专利名称：一种双向特异性配体靶向逆转录病毒的方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及在体内和体外能够靶向传递逆转录病毒的高效基因治疗技术领域，进一步涉及一种双向特异性配体靶向逆转录病毒的方法。
背景技术：
目前，高效的基因治疗工具已经具备能够准确通过适当的载体将目的基因送达体内特异性细胞或者组织的特点。逆转录病毒，如慢病毒，因其自身具有稳定转染，可整合入基因组长期表达，以及促进感染细胞转化成为非分裂细胞等功能显示出了良好的应用前
旦
ο许多研究以病毒载体假型嵌和包膜相结合的方法研制开发出了针对慢病毒包膜蛋白的嵌合抗体，目前已经提高了慢病毒的基因传递特异性。在未来基因治疗领域中，这些研究工作为进一步修饰和改进传递载体系统方法的应用奠定了基础。在众多方法中一个相类似的策略就是应用非偶联的方法靶向识别细胞，这种方法是采用融合表达的方法使独立的蛋白表达在病毒载体的表面。该方法已被证实，其制备更为简便，同时可以促进Y逆转录病毒和慢病毒载体靶向特异性细胞。这种方法采用配体蛋白或者细胞特异性抗体作为桥梁在体外将载体靶向传递到未经修饰的具有禽肉瘤或者造血细胞组织增生病毒的特异性细胞包膜蛋白处。25年前，单克隆抗体和重组DNA技术的结合使得构建在正常自然条件下所存在的以抗体为基础的生物分子成为可能。其中，第一批双向特异性抗体，其表面类似普通免疫球蛋白分子，但是其中两个结合臂却具有截然不同的结合特异性。使用该种方法Staerz等人将双向特异性抗体结合于细胞毒性T细胞，从而达到靶向裂解肿瘤细胞的目的。从那以后， 人们构建了不同种类的双向特异性抗体来靶向肿瘤细胞。但是，这种方法的特点和局限性也逐渐显示出来。与此同时，将双向特异性抗体结合于其他细胞毒性免疫细胞的生物工程治疗方法也已经陆续被研发和构建出来。例如靶向巨噬细胞表面的FcgRI/CD64和肿瘤细胞表面的HER2/neU或者EGFR。同时，越来越多的嵌合抗体及其与化疗药物偶联的药物已经在试验中取得了良好的结果且被批准应用于肿瘤的临床治疗。尽管科研人员不断改进并减少生物工程制剂在临床应用过程中存在的问题，但单克隆抗体治疗肿瘤仍然具有其局限性，药物的靶向传递效率依然未能达到理想水平。然而， 正是这些在临床治疗中存在的问题为生物工程药物的进一步改进提出了要求。临床治疗中，针对不同疾病的有效基因治疗方法应具备以下特点利用最佳条件高效并特异性靶向传递治疗基因到目的细胞；同时，还要保持该基因的稳定转染和长期表达特性。目前，常采用血液直接注射的方法将药物引入体内，然后通过载体归巢的方法将目的基因靶向传递至细胞或者器官。因此，现阶段已经有研究应用生物工程和基因重组的方法以不同病毒载体为基础开发出靶向基因治疗传递系统。腺病毒和腺相关病毒载体已经因为它们具有结合和感染机理单一的优点而被应用于靶向基因传递策略。尽管这些经过改进的病毒载体已经被成功应用于体外靶向特异性细胞，但却因为它们自身的非特异导向性(特别是在肝脏细胞)以及改构以后影响病毒载体的感染能力等缺点，使得它们在体内的应用受到了限制。与腺病毒不同，逆转录病毒载体颗粒是介导多核酸进入细胞(如真核细胞)的另一种重要工具。“介导”一词包括多种将多核苷酸转移入细胞的方法。其中包括转化、转导和转染等。逆转录病毒是RNA病毒，因此病毒基因组是RNA，当宿主细胞感染逆转录病毒后， 基因组RNA反转录成为DNA中间体，介导病毒基因高效整合入感染细胞的染色体DNA中。整合的DNA中间体是指前病毒。逆转录病毒家族是包膜单链RNA病毒，主要感染哺乳动物，如牛、猴、羊和人以及禽类和鼠类等。逆转录病毒在众多RNA病毒中，以它们通过RNA合成DNA 拷贝并且能够整合入感染细胞的基因组的多种特殊方式而显示出其独特的应用价值。逆转录病毒家族中按照目前国际病毒分类标准，可分为7个属α逆转录病毒属 Alpharetrovirus, β 逆转录病毒属 Betaretrovirus, γ 逆转录病毒属 Gammaretrovirus, δ逆转录病毒属 Deltaretrovirus, ε逆转录病毒属Epsilonretrovirus,慢病毒属 Lentivirus和泡沫病毒属Spumavirus。其中，慢病毒包括HIV-1、HIV-2和SIV ； γ逆转录病毒包括白血病病毒(鼠白血病病毒MLVs和猫白血病病毒)。如何将逆转录病毒应用于体内靶向特异性细胞或组织目前还是一个难题。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种双向特异性配体靶向逆转录病毒的方法，以克服克服现有技术存在的靶向传递逆转录病毒制备效率低、体内靶向性差的问题。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是
一种双向特异性配体靶向逆转录病毒的制备方法，依次包括下述步骤 步骤一、通过免疫小鼠制备抗逆转录病毒包膜蛋白(VSV-G)以及特异性靶向标志物的抗体细胞。步骤二、分别构建相应的抗体噬菌体呈现文库，分别筛选能够与逆转录病毒包膜蛋白或特异性靶蛋白特异性结合的噬菌体个体。步骤三、根据步骤二中筛选获得的噬菌体，将编码抗逆转录病毒包膜蛋白与特异性靶向标志物的单链可变区片断的cDNA克隆，重组表达双向特异性配体。步骤四、双向特异性配体与逆转录病毒载体的结合。上述步骤一中，特异性靶向标志物的抗体是指抗EGFR (EGF受体)、EpCAM (表皮细胞粘附分子)、EphA2 (Eph受体酪氨酸激酶A2)、Her2 (人EGF受体2)等特异性肿瘤或某种疾病的标志物分子。本发明中所描述的以双向特异性配体介导的逆转录病毒靶向体内细胞和组织的制备方法通过联合使用逆转录病毒以及双向特异性亲和配体将基因选择性传递到靶细胞或者组织。在以下具体的实施例中，逆转录病毒为慢病毒。其他逆转录病毒也可以在该系统中应用于靶向传递基因。选择性传递基因到靶细胞或者组织已经被广泛应用于肿瘤的治疗、感染性疾病的治疗和基因紊乱疾病的治疗等。本发明中所说的双向特异性亲和配体可以选择性结合逆转录病毒和靶向细胞或者组织。该配体可以先与逆转录病毒混合，然后应用于治疗；将二者同时应用于治疗；或者在病毒应用后再用配体治疗。双向特异性配体至少有2个结合区域。一个可以与逆转录病毒结合，另一个可以与靶细胞或者组织结合。2 个结合部分通过共价键结合在一起。好的双向特异性配体不会抑制病毒与细胞的融合。其中，双向特异性配体包括双向特异性抗体、双向特异性适体、双向特异性小分子及嵌合体 (一个结合区域是小分子，另一个结合区是抗体)。本发明中，双向特异性配体可以包括2个以上的结合区域。例如特异性结合于病毒表面蛋白的多适体。可以通过多聚体载体(例如多赖氨酸，聚丙烯酸或类似物)形成双向特异性亲和配体被偶联于多个特异性靶向细胞表面蛋白的抗体。将双向特异性配体与病毒结合后，去除多余的未结合配体后即可用于治疗。同时， 还可以通过偶联的方法将双向特异性配体共价偶联(或加入交联试剂进行偶联，例如戊醛或DIC)于病毒，但需要进一步确定双向特异性配体与病毒复合物的稳定性，。尽管，近来的许多研究证实慢病毒可以在体内以假型病毒的模式传递至特异性靶细胞。然而，重要的是细胞的非特异性传递仍然存在。该问题主要是因为嵌合包膜蛋白上的非特异性结合区未能得到很好的封闭。双特异性配体则能通过特异性封闭慢病毒载体而较好地解决这个问题。一个好的双向特异性配体可以通过其一端与包膜糖蛋白非特异性结构域结合，而其另一端则可以特异性将病毒直接导向靶位。这一策略与嵌合包膜蛋白相比具有两个优点第一，它阻断了病毒的非特异性结合区；第二，在病毒制备的时候保证了病毒包膜蛋白的完整性，从而降低对病毒包装的影响，使病毒的制备达到较高的滴度。该病毒传递系统与传统逆转录病毒靶向策略相比较具有三个优点
(1)通过双向配体的封闭端阻断并封闭所传递病毒的非特异性结构表位的结合能力；
(2)通过本发明所述的方法筛选并构建的双向特异性配体具有靶向和封闭逆转录病毒非特异性结合区的双重作用；
(3)通过本发明所述的方法筛选并构建的双向特异性配体与逆转录病毒结合不影响逆转录病毒制备的滴度。
具体实施例方式下面将通过具体实施例对本发明进行详细地说明
实施例1 制备双向特异性抗体靶向Her2肿瘤细胞传递慢病毒的具体方法，依次包括下述步骤
步骤一、通过免疫小鼠制备抗逆转录病毒包膜蛋白(VSV-G)以及抗Her2抗体细胞。a. VSV-G 抗原选择
成熟VSV-G蛋白或其结合区域可用于免疫小鼠，从而制备单链可变区片断抗体噬菌体呈现文库。b.制备单克隆抗体的抗原免疫方法抗原成熟VSV-G蛋白
佐剂完全弗氏佐剂，不完全弗氏佐剂； 小鼠体重20g, Balb/C小鼠，雄性
免疫方法第一天，初始免疫，抗原与完全弗氏佐剂200μ 1混悬成乳浊液，皮下四点注射，每只200 μ 1 ；第14天，第二次免疫，抗原与不完全弗氏佐剂200 μ 1混悬成乳浊液，皮下四点注射，每只200 μ 1 ’第24天，第三次免疫，抗原与不完全弗氏佐剂200 μ 1混悬成乳浊液，皮下四点注射，每只200 μ 1 ；第35天，第四次免疫，抗原与不完全弗氏佐剂200 μ 1混悬成乳浊液，静脉注射，每只200 μ 1 ；第42天，尾静脉取血检测抗体滴度；第45天，第五次免疫，抗原与不完全弗氏佐剂200 μ 1混悬成乳浊液，静脉注射，每只200 μ 1 ；第66天，第六次免疫，抗原与PBS 200 μ 1混勻，腹腔注射；4天后进行细胞融合实验。c.抗肿瘤表面抗原Her2蛋白单链可变区片断的制备
抗Her2 (人EGF受体2)单链可变区片断的制备。可以参考有关文献中所提示的序列片断结构构建，也可以按照上述a和b的方法免疫小鼠产生抗体细胞。步骤二、构建抗慢病毒或Her2抗体的单链可变区片断的抗体噬菌体呈现文库，方法如下
a.抗VSV-G蛋白抗体单链可变区片断噬菌体呈现文库的制备(具体方法参见Antibody Phage Display: Methods and Protocols, Editor(s): Philippa M. 0' Brienl, Robert Aitken. Series: Methods in Molecular Biology, Volume No. : 178, Print ISBN: 978-0-89603-906-3)
从上述经免疫雄性Balb/C小鼠脾脏和骨髓中提取总RNA(具体方法参见分子克隆第三版)。使用前保存于-70° C。使用MMuLv、01igo-dT18和随机六聚体引物以总RNA为模板反转录合成第一链 cDNA(具体方法参见分子克隆第三版以及ProtoScript M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒说明书，New England Biolabs公司)。通过后续3次PCR反应分别扩增并重组合成重链，κ 轻链和λ轻链的可变区基因(VH，V κ和νλ)。第一次PCR产物由重链和轻链可变区组成。 重链5’引物设计时引入SfiI位点，轻链3’引物引入NotI位点。轻链5’引物同时还含有链接区域(Gly4Ser)3。重链3’端引物与之相应。和νλ基因的等量PCR产物根据标准操作方法经琼脂糖凝胶纯化后将VH和Vk混合。第二次PCR，使用pfu (DNA聚合酶)扩增并组装重链和轻链。组装PCR反应包括等摩尔混合重链(VH)和轻链(V κ或V λ )基因产物。 第三次PCR反应根据第二次PCR产物加入筛选出的相应基因弓I物PCR构建全长单链可变区片断基因。使用Pfu聚合酶和1 μ 1第二次PCR获得的组合产物反应，此次获得的产物是从 SfiI到NotI经过充分扩增延长的单链可变区片断基因，样品经过纯化后可用于后续克隆。使用SfiI和NotI对PCR扩增得到的单链可变区片断cDNA和pCANTAB5E噬菌体中间载体进行双酶切。将单链可变区片断产物插入PCANTAB5E载体中产生单链可变区片断基因融合文库。b.抗Her2蛋白抗体单链可变区片断噬菌体呈现文库的制备方法与a相同。c.筛选文库获得高亲和力抗体的片断序列
分别使用成熟的VSV-G结合区与Her2抗原蛋白在噬菌体文库中筛选高亲和力克隆。使用96孔板筛选呈现特异性单链可变区片断的噬菌体颗粒。将不同的蛋白抗原按照 (50-600 μ g/ml)包被于孔中。每个文库中加入IO11和IO12个噬菌体颗粒，室温孵育2小时。 用PBST (0. l%Tween-20)洗10次，去除未结合的噬菌体。然后用PBS洗10次。用50 μ 1 的50mM甘胺盐酸ρΗ2.0 (10分钟后立即中和至pH7. 4)。洗脱结合的噬菌体。将洗脱下来的噬菌体感染指数生长时期的大肠杆菌TGl细胞。挑取单一噬菌体感染的克隆并扩增噬菌体颗粒。加入M13K07或KM13辅助噬菌体培养，每个抗原选择2_3轮后，使用ELISA方法鉴定抗原结合能力。
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步骤三、构建靶向Her2肿瘤细胞传递慢病毒的双向特异性单链可变区片断，方法如下
使用连接体(Gly4Ser)混合两单链可变区片断(抗VSV-G和抗Her2肿瘤表面抗原)并表达双向特异性抗体(具体方法参见Generation of Bispecific and Tandem Diabodies, Chapter 14, Robert Aitken (ed. ), Antibody Phage Display, Second Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 562)。第一次PCR为独立产生两个不同单链可变区片断的反应。第一个单链可变区片断的5’引物与第二个单链可变区片断的3’引物分别引入适当的可用于克隆的限制性酶切位点。第二个单链可变区片断的5’引物含有连接区域的部分可以与第一个单链可变区的3’ 引物相配对。经凝胶纯化后取两个PCR的等量产物混合后，经pfu (DNA聚合酶)组装并延伸(不加引物)。第三次反应由第二次PCR产物加入具有适当酶切位点的第一次单链可变区片断5’引物和第二次单链可变区片断3’引物构建全长(2个单链可变区片断串联体)2。将 PCR产物纯化后克隆进入CMV载体，并在细胞中表达产生双向特异性抗体(scFV2)。步骤四、双向抗体与逆转录病毒载体的结合将适量抗VSV-G和抗Her2肿瘤表面抗原的双向抗体与有GFP标记或无标记的的慢病毒混合。实施例2 制备双向特异性抗体靶向PSCA肿瘤细胞传递慢病毒的具体方法，依次包括下述步骤
前列腺癌是发病率较高的肿瘤之一，是目前美洲男性肿瘤致死的第二大病因。前列腺癌常因为转移入骨和表现为激素非依赖性肿瘤生长形式而导致死亡。生理性前列腺肿瘤模型的发现和建立，如LAPC-9移植瘤模型，为前列腺癌的发生与发展机理和治疗相关领域的研究奠定了基础。通过前列腺癌细胞抗原(PSCA)靶向前列腺肿瘤细胞的具体方法是
步骤一、通过免疫小鼠制备抗逆转录病毒包膜蛋白(VSV-G)以及抗PSCA抗体细胞。具体方法与实施例1相同，不同之处在于靶向特异性肿瘤细胞标志物为PSCA蛋白。步骤二、构建抗慢病毒或PSCA抗体的单链可变区片断的抗体噬菌体呈现文库。具体方法与实施例1相同，不同之处在于靶向特异性肿瘤细胞标志物为PSCA蛋白。步骤三、构建靶向PSCA肿瘤细胞传递慢病毒的双向特异性单链可变区片断，具体方法与实施例1相同，不同之处在于靶向特异性肿瘤细胞标志物为PSCA蛋白。步骤四、双向特异性配体与逆转录病毒载体的结合。具体方法与实施例1相同。LAPC-9细胞来源于人骨转移，可经过移植入SCID小鼠后形成表达前列腺特异性抗原和野生型雄激素受体(Id)的荷瘤小鼠模型。经过筛选后约一半为激素非依赖性和微转移性小鼠模型，是临床研究人前列腺肿瘤发生和发展机理的良好模型。我们制备的双向特异性抗体可以特异性将慢病毒传递入活体动物的前列腺癌中， 并且我们制备的载体在LAPC-9模型系统中也显示出了良好的作用。PSCA编码一个具有 123位氨基酸的蛋白。氨基末端具有信号序列(一个碳端GPI铆定序列和多氮糖基化位点)。 PSCA的mRNA在雄激素依赖和非依赖前列腺荷瘤小鼠体内均表达上调。PSCA表达于80%以上的前列腺癌和LAPC-9移植瘤中，是一个确定的治疗靶位。因此，在该实施例中，我们将具有抗PSCA和抗VSV-G特性的双向特异性抗体与慢病毒载体相结合进行靶向治疗。实施例3 双向特异性抗体靶向Her2肿瘤细胞传递慢病毒的体内和体外传递效果的鉴定方法
a.将混合产物分别加入表达和不表达特异性肿瘤表面抗原Her2的肿瘤细胞:MCF_7 (Her2-)和SK0V-3 (Her2+),分别在转染后细胞培养第2和第3天通过流式细胞术检测2 组不同肿瘤细胞GFP的表达效率。计数不同组细胞中GFP的阳性率，不表达特异性肿瘤表面抗原的肿瘤细胞GFP阳性率应小于90% ；表达特异性肿瘤表面抗原的肿瘤细胞GFP阳性率应大于90%。 b.将混合产物经静脉注射入MCF-7 (Her2-^nSK0V_3 (Her2+)荷瘤小鼠体内，检测GFP在肿瘤和其他组织器官细胞中的表达情况。肿瘤细胞中GFP阳性率应大于50% ；其余组织器官细胞GFP阳性率应小于90%。
权利要求
1.一种双向特异性配体靶向逆转录病毒的制备方法，依次包括下述步骤步骤一、通过免疫小鼠制备抗逆转录病毒包膜蛋白(VSV-G)以及特异性靶向标志物的抗体细胞；步骤二、分别构建相应的抗体噬菌体呈现文库，分别筛选能够与逆转录病毒包膜蛋白或特异性靶蛋白特异性结合的噬菌体个体；步骤三、根据步骤二中筛选获得的噬菌体，将编码抗逆转录病毒包膜蛋白与特异性靶向标志物的单链可变区片断的cDNA克隆，重组表达双向特异性配体；步骤四、双向特异性配体与逆转录病毒载体的结合。
2.根据权利要求1所述的一种双向特异性配体靶向逆转录病毒的制备方法，其特征在于所述的特异性靶向标志物的抗体是指抗EGFR (EGF受体)、EpCAM (表皮细胞粘附分子)、 EphA2 (Eph受体酪氨酸激酶A2)、Her2 (人EGF受体2)等特异性肿瘤或某种疾病的标志物分子。
全文摘要
本发明涉及一种双向特异性配体靶向逆转录病毒的方法。目前，单克隆抗体和重组DNA技术的结合使得构建在正常自然条件下所存在的以抗体为基础的生物分子成为可能，但单克隆抗体治疗肿瘤其药物的靶向传递效率依然未能达到理想水平。本发明通过应用抗体噬菌体呈现技术筛选具有抗包膜蛋白的特异性抗体，同时将其与抗肿瘤表面特异性标志物抗体的可变区片断构建成双向特异性抗体或者其它生物工程形式分子，从而建立可以在体内和体外特异性传递逆转录病毒的系统。本发明能阻断并封闭传递病毒的非特异性结构表位的结合能力；具有靶向和封闭逆转录病毒非特异性结合区的双重作用双重作用；并且不影响逆转录病毒制备的滴度。
文档编号C07K16/28GK102344492SQ201010243428
公开日2012年2月8日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者刘镭, 徐学明, 王天欣 申请人:西安杰诺瓦生物科技有限公司