专利名称：杆状病毒载体在基因治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用病毒载体的基因传送。
WO-A-98/20027公开了一种在血管手术期间可用来进行动脉基因转移的外膜周环。但是，还需要更多容易得到并且高效的基因转移载体。在心血管的应用中，为了取得生物效应，也许只需要转基因的短暂表达；见Yla-Herttuala等人，Lancet 355213-222(2000)。
很久以来，杆状病毒一直被用作生物杀虫剂和在昆虫细胞中进行重组蛋白高效生产的工具。由于它们具有自然的高种属特异性，并且就目前所知，它们不会在非无脊椎动物宿主中增殖，因此它们通常被认为是安全的。尽管已经显示病毒体能够进入某些脊椎动物来源的细胞系，但是在使用自然病毒时，没有检测到病毒基因表达的证据。但是，含有合适的真核启动子的苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)能够在几种哺乳动物细胞类型中高效地传送和表达目的基因；例如，可以参阅Hofmann等人，PNAS USA 9210099-10103(1995)。另外，Barsoum等人在Hum.Gene.Ther.82011-8(1997)中报道了在被膜中含有疱疹性口腔炎病毒C糖蛋白的杆状病毒能够显著增加对人类肝癌细胞系的转导效率，拓宽了能被杆状病毒转导的哺乳动物细胞类型的范围。通过在杆状病毒基因组中包含一个编码可选择的显性标记的表达盒，或者通过使用杂交的杆状病毒-腺伴随病毒载体，已经取得了由杆状病毒介导的对哺乳动物细胞的稳定转导；参阅Condreay等人，PNAS USA 96127-132(1999)以及Palombo等人，J.Viro1.725025-34(1998)。
Sandig等人在Hum.Gene.Ther 71937-45(1996)中报道了一些不成功的尝试，即通过系统性应用或肝门内应用以及直接注射入肝实质的方法，在小鼠和大鼠中用杆状病毒进行体内基因传送。有人假定其中的一个原因是杆状病毒被血清补体系统的经典途径失活。
WO-A-00/05394公开了杆状病毒载体和它们在脊椎动物神经细胞中进行基因转移的应用。
本发明能够在合适的载体中(基因从该载体中表达)利用杆状病毒的优点，如果这一载体施用(体内或体外)于无血或基本无血的身体部位。因此，外膜周围基因传送，特别是环介导的局部基因传送就能允许在基本无血清的情况下进行基因传送，从而避免了血清组分的有害作用。该新方法也避免了另两个在系统基因传送中遇到的主要问题，即病毒从注射位点快速再分布和病毒局部浓度的下降。发明详述在WO-A-98/20027和WO-A-99/55315(这些文献的内容在此作为参考文献引用)中说明了合适的传送系统、活性物质、配方、剂量等。因此，只作为例子，传送载体可以是环或包裹物。和那些出版物相比，用于基因传送的载体是杆状病毒。
杆状病毒是已知的，并且熟练技术人员能够构建任何用于本发明的合适载体。同时，很明显，对杆状病毒生物学和AcMNPV基因组的广泛知识将有助于设计改进的第二代病毒以用于基因转移。构建的简单性和接受外源大片断DNA(＞20kb)的能力允许开发杆状病毒，该病毒具有增强的或靶向的细胞嗜性，以及更稳定的转基因表达和对转基因表达的时间和细胞类型特异性的控制。用于本发明的重组杆状病毒可以用已知的方法配制成药剂用于治疗。
本发明的实施路线和位点包括眼内应用、关节内应用、表皮内应用、输尿管、膀胱、输卵管、胆囊、脊索、脑脊液室、胸膜腔和腹膜腔内。已经使用的位点(见实施例)是动脉、脑和骨骼肌，包括例如mycocytes、卫星细胞和再生型成肌细胞。基因传送可以通过直接注射或多种类型的导管来完成。
如果合适，在手术期间，身体部位可以变成“无血的”。这项技术经常在腿部或手臂手术中使用，通过在手臂和大腿周围施加压迫压力，从而阻止血液流动。接着可以在该身体部位灌注盐水以除去血液，再进行杆状病毒转染。
本发明可以用来传送VEGF受体的激动剂，例如在WO-A-98/20027中更详细描述的。而且，通过选择合适的基因，它还可以用来治疗癌症，如脑部的癌症。
本发明的另一方面涉及器官移植和管移植，这些器官和管可以在体外灌注盐水并注射杆状病毒。
用下面的实验工作来说明本发明。
用BacTo-BacTM杆状病毒表达系统(Gibco BRL)产生重组病毒。以2×106个细胞/毫升的细胞密度在草地夜蛾(sf9)悬浮培养物(SF-900培养基，Gibco BRL)中培养3天，以使病毒扩增。对于50毫升培养基，用200微升初级转染上清液作为接种物。为了得到1升扩增的病毒，用2毫升扩增的病毒原液作为接种物。在室温下，以16,000g对细胞培养基离心20min，以除去细胞碎片。澄清的上清液转移入底部铺有1.5毫升溶于磷酸盐缓冲液(PBS)的25％蔗糖的超离心管中，通过离心(120,000g，4℃，1.5h)对病毒进行浓缩。病毒沉淀重悬于35毫升用冰预冷的PBS中，转移入含有3毫升溶于PBS的25％蔗糖的超离心管中，用如上所述的方法进行离心。最终的病毒沉淀重悬于10毫升冷的PBS中，用0.45μm滤器过滤，并在4℃下避光保存备用。通过对Sf9细胞的噬菌斑测定来确定病毒的滴度。分析病毒制备物中的脂多糖和细菌污染物。重组腺病毒的制备编码核定位的LacZ的腺病毒(pCMVnlslacZAd5)按照Laitinen等人描述的方法(此处同前)进行构建和制备。按照Laitinen等人在Hum.Gene.Ther，91481-6(1998)中描述的方法分析病毒制备物中的可复制病毒、脂多糖和细菌污染物。体外基因转移以每孔(Falcon Culture，Becton Dickinson，Meylan，France)10,000细胞的密度将兔主动脉细胞(RAASMC；Yla-Herttuala等人(1995)，supra)和人类癌细胞/类内皮细胞ECV-304(ATTC CRL-1998)进行平板培养。在转导之前，让细胞在无血清培养基(DMEM，100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素，Gibco BRL))贴壁3h。以200或1000的MOIs将病毒加入培养基中，在37℃下让细胞孵育90min。在转导后，在有或没有10nM正丁酸(Sigma，St.Louis，MD，USA)的情况下，加入含有10％胎牛血清的生长培养基。孵育18h后，除去培养基，并用PBS对细胞清洗三遍。细胞用1.25％的戊二醛固定15min，接着用PBS清洗三遍。将细胞加入X-Gal(MBI Fermentas，Lithuania)染色液(1mg/ml，2mM/MgCl2，5mM K3Fe(CN)6，5mM K4Fe(CN)6，1X PBS)中，在37℃孵育3h。接着用PBS清洗细胞，进一步用4％的多聚甲醛(PFA)固定10min。用PBS清洗之后，细胞用Mayers Carmalum复染5min。对蓝色的X-Gal阳性细胞计数，转导效率用阳性细胞占细胞总数的百分比表示。ONPG试验如Ruponen等人在Biochim.Biophys.Acta 1415331-41(1999)中所描述的，用发色底物邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG，Sigma)测定转导的RAASMC细胞中由lacZ编码的β-半乳糖苷酶的活性。体外毒性试验在96孔平板上，以20,000细胞每孔的密度将细胞在100微升含有10％胎牛血清和抗生素(100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)的生长培养基中进行平板培养。用转导效率试验中的方法进行病毒转导，在37℃下细胞孵育48h。除去生长培养基，并用PBS清洗细胞。接着加入不含酚红但含有MTT溶液(3-(4，5二甲基噻唑基-2)2，5-二苯基四唑溴，5mg/ml，终浓度0.3mg/ml)的无血清DMEM，细胞孵育2h。为了溶解暗蓝色的甲臜晶体，除去MTT溶液，在每个孔中加入150微升的1M DMSO，彻底混匀。在570nm波长下测定吸收值。通过和无病毒或无丁酸的孔(100％存活)的吸收值比较来计算存活百分比。动物试验使用了雄性新西兰白兔(NZW)(n＝12；2.8-3.7kg)。用芬太尼-氟丁酰酮(0.3ml/kg，s.c.；Janssen Pharmaceutica，Beerse，Belgium)和咪达唑仑(1.5mg/kg，i.m.，Roche，Basel，Switzerland)进行麻醉。用颈中线切开法使左颈动脉和右颈动脉暴露。小心地将动脉和周围组织分开，并将一个3厘米长的硅橡胶环(见Laitinen等人(1997)，supra)放置在它周围。在环放置之后五天，用latinen等人(1997)在supra中描述的方法将兔子重新麻醉，进行基因转移，并比较质粒/脂质体、假型逆转录病毒和腺病毒的转染效率。打开环，充入500微升含有1×109pfu腺病毒或杆状病毒的基因转移溶液。在每只动物中，左颈动脉用腺病毒处理，右颈动脉用杆状病毒处理。在基因转移之后3、7和14天，每天处死四只兔子，并将动脉切下进行组织分析。所有动物方法都是经过允许的。组织分析带环的动脉平均分成三份近端部分浸在4％PFA/15％蔗糖中固定4h，在15％蔗糖(PH7.4)中冲洗过夜，并用石蜡包埋。中间部分浸在4％PFA/PBS(PH7.4)中固定30min，用PBS(PH7.4)冲洗，并用OCT化合物(Miles Scientific，Naperyille，IL，USA)包埋。远端部分在液氮中快速冷冻，在-70℃保存以提取mRNA并进行逆转录酶多聚酶链式反应(RT-PCR)。
用X-Gal(MBT Fermentas)对从每只兔子中随机选取的冰冻切片(10微米)染色18h以确定β半乳糖苷酶阳性细胞。由两个独立的观察者对8片随机选取的切片进行观察，以每平方毫米外膜或动脉壁上的X-Gal阳性细胞来计算基因转移效率。报道结果的平均值±平均值的标准误差(SEM)。如Yla-Hertualla(1995)在supra中所描述的，石蜡切片用于免疫细胞化学检测内皮细胞(CD-31；1∶50稀释；Dako，Hamburg，Germany)、巨噬细胞(RAM-11；1∶100稀释；Dako)、平滑肌细胞(HHF-35；1∶50稀释；Dako)和T细胞(MCA-805；1∶100稀释；Dako)。免疫染色的对照包括不用第一抗体的切片以及和类属相匹配的免疫球蛋白一同孵育的切片。用苏木精-伊红染色的石蜡切片和Image-Pro PlusTM软件结合Olympus AX70显微镜(0lympus Optical，Japan)进行形态测量和图象分析。RT-PCR用Trizol试剂(Gibco-BRL)从颈动脉片断中提取总RNA，并用过量的RQ1无RNA酶的DNA酶(Promega，Madison，WI，USA)进行处理。M-MulV逆转录酶(MBI Fermentas)用作cDNA合成。选择CMV启动子的5’的引物和编码区3’的引物来设计LacZ的引物，以区别内源基因和转导基因。用多聚酶Dynazyme(Finnzymes，Espoo，Finland)进行扩增。
在LacZ扩增中，引物SEQ ID NO1用作腺病毒(A)的正向引物，引物SEQ ID NO2用作杆状病毒(B)的正向引物，SEQ ID NO3用作两者的反向引物。热起始(95℃5min，58℃3min)后进行39个循环，每个包含95℃1min，58℃2min，72℃3min，最后在72℃下进行10min的延伸反应。用5微升的第一次PCR产物以及正向引物SEQ ID NO4(A)和SEQ ID NO5(B)进行第二次PCR。两者的反向引物是SEQ ID NO6。第一个PCR循环在95℃进行5min，接着按照第一次PCR的参数进行20个循环。体外基因转移为了测试杆状病毒原液，在存在或不存在10mM丁酸盐的情况下，以每细胞200或1000pfu的感染复数(MOI)转导RAASMC细胞和ECV-304细胞，并计算X-Gal阳性细胞的百分比。该结果与在同样条件下用LacZ-腺病毒转导的细胞进行比较(表1)。同发表的结果符合，(Condreay等人，supra)在细胞培养基中加入丁酸盐能显著增加转基因的表达，特别是对杆状病毒而言。RAASMC细胞(在MOI1000时，91％感染)似乎比ECV-304细胞(在MOI1000时，21％感染)对杆状病毒的转导更敏感。用定量生化试验结合邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)测量了RAASMC细胞中β半乳糖苷酶的活性程度。该结果和X-Gal染色相一致，显示在杆状病毒转导的细胞中用丁酸盐处理后，转基因的表达增加。体外毒性用3-(4，5二甲基噻唑基-2)2，5-二苯基四唑溴试验测量病毒制备物的细胞毒性(表2)。在MOI200或1000，并且不存在丁酸盐的情况下，杆状病毒和腺病毒对RAASMC细胞都不表现较大的细胞毒性。但是，在丁酸盐存在的情况下，用MOI1000的杆状病毒时，在这些细胞中探测到了一些细胞毒性。对于原代培养的WHHL(Watanabe可遗传的高脂血)兔成纤维细胞也得到了相似的结果，除了一个是例外，即在有丁酸盐并且MOI1000的情况下，对于杆状病毒没有探测到细胞毒性作用。(数据没有显示)体内基因转移为了确定杆状病毒是否可用来进行体内基因转移，在基因转移之后3、7和14天处死NZW兔子。由于β半乳糖苷酶的核定向表达，较强的X-Gal染色位于转导细胞的细胞核中。从杆状病毒转导(每动脉1×109pfu)的颈动脉中计算β半乳糖苷酶活性阳性的细胞数目，并且和类似处理的腺病毒转导的动脉相比较。两种病毒都介导标记基因传送到管壁上。在第三天，用杆状病毒处理的动脉和用腺病毒处理的动脉中转基因阳性细胞的数目分别为每平方毫米外膜12±5和23±7个β半乳糖苷酶阳性细胞(对于整个动脉壁而言，分别是每平方毫米11±4个细胞和19±6个细胞)。在第7天，相应的值分别是17±6和22±7(15±5和18±6)。在第14天，这些值是0.1±0和0.2±0.1(0.1±0和0.1±0.1)。因此，杆状病毒介导的基因表达是短暂的，并且和腺病毒介导的基因转移具有相似的效率和时间模式。用RT-PCR也证实了转基因在动脉壁中的表达。
对杆状病毒处理的动脉和腺病毒处理的动脉，内膜/中膜比率(所有动脉)的平均值分别是0.18±0.03和0.12±0.01，这表明处理方法没有破坏管壁。基因转移之后7天，动脉的组织学在外膜外没有检测到β半乳糖苷酶活性。对于两种病毒，用RAM-11和MCA-805免疫染色分别发现巨噬细胞渗入了转导的动脉并探测到T细胞在动脉中。在整个实验过程中，动脉结构和内皮保持完整。表3总结了所有时间点的组织学发现。表1用杆状病毒和腺病毒对RAASMC和ECV-304细胞系进行的转导细胞系 MOI丁酸盐(mM) 阳性细胞(％)杆状病毒 腺病毒RAASMC 200 0 1.0±0.3 1.7±0.810 52.5±0.8 42.1±1.110000 5.3±1.3 48.0±5.810 90.6±1.6 87.6±2.3ECV-304 200 0 0 44.2±2.910 2.6±1.7 89.4±1.910000 0.3±0.3 87.51±4.010 20.8±7.7 97.6±1.4±s.e.m.表2杆状病毒和腺病毒在RAASMC细胞中的细胞毒性的MTT试验MOI 丁酸盐(mM) 杆状病毒(％)*腺病毒(％)*200 0 82±3 98±410 78±2 101±21000 0 81±1 99±110 65±1 90±3*同模拟转导的细胞相比，RAASMC细胞的存活百分率。±s.e.m.表3基因转移之后3、7和14天，转导的动脉中组织学发现的总结时间点 病毒 巨噬细胞 PMN细胞 内容是否完整3d腺病毒 +++ 是杆状病毒 ++++ 是7d腺病毒 + + 是杆状病毒 + + 是14d 腺病毒 ++- 是杆状病毒 ++- 是-，无；+轻微；++中度和+++和对照动脉相比严重渗入。PMN，多形核。实施例2用和实施例1中基本相同的方法，表明杆状病毒基因转移在脑部和骨骼肌中也是可行的。用杆状病毒/LacZ，大鼠脑部多种类型的脑细胞显示阳性转染，特别是脑室中的脉络丛细胞和内皮细胞。转染细胞的轮廓和用腺病毒转染的明显不同。
进一步，杆状病毒感染已经在兔子骨骼肌中证实。用25G针将编码LacZ的杆状病毒(1.8×1010PFU)直接注射入NZW兔子的内收肌。注射量是0.5毫升。基因转移之后7天，收集组织样品，用X-Gal染色过夜。这些结果清楚地表明杆状病毒可以用来转染哺乳动物的多种细胞类型，即不仅仅是动脉细胞。
了编码核定位的β半乳糖苷酶的杆状病毒转染盒的构建。通常，这是一个标准的、带有多角体蛋白启动子的公共结构域杆状病毒，并且在其中克隆入了限制性酶切位点和CMV-NTLacZ表达盒。LacZ表达盒与多角体蛋白启动子反向定位。CMV-NTLacZ表达盒的序列在SEQ IDNO7中。
序列表<110>Ark Therapeutics Ltd.<120>病毒载体的基因传送<130>REP06446WO<140>未知<141>2001-05-29<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>1ttggaggcct aggcttttgc 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>2ttggcctaga gtcgacggat 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>3tgaggggacg acgacagtat 20<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>4ggtagaagac cccaaggact tt 22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>5ccaagaagaa acgcaaagtg 20<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>6cgccattcgc cattcag 17<210>7<211>4495<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述重组杆状病毒<400>7ccattgcata cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaata 60tgaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca 120ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 180ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 240acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 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1.一种传送基因产物的方法，其中基因通过杆状病毒载体提供，并且载体应用于无血或通常无血的身体区室。
2.根据权利要求1的方法，其中传送是外膜周围的。
3.根据权利要求1或2的方法，其中基因产物是VEGF受体的激动剂。
4.根据前面任一项权利要求的方法，用来治疗内膜增生。
5.根据权利要求1或2的方法，其中区室含有动脉细胞。
6.根据权利要求1或2的方法，其中区室含有脑细胞。
7.根据权利要求1或2的方法，其中区室含有骨骼肌。
8.一种用来外膜周围基因产物传送的装置，其中基因通过杆状病毒载体提供，并且该基因可以从该载体中表达。
9.根据权利要求8的装置，其形式是环。
10.根据权利要求8的装置，其形式是包裹物。
11.根据权利要求8到10中任一项的装置，其中基因产物是VEGF受体的增效剂。
全文摘要
在基因产物的传送方法中，基因通过杆状病毒载体提供，并且载体应用在无血或通常是无血的身体区室中。在用于基因产物的外膜周围传送的装置中，基因通过杆状病毒载体提供，并且该基因可以在该杆状病毒载体中表达。
文档编号A61K35/76GK1430675SQ0181017
公开日2003年7月16日 申请日期2001年5月29日 优先权日2000年5月26日
发明者S·伊拉－赫图阿拉, K·J·艾兰尼 申请人:Ark治疗学有限公司