专利名称：一种突变载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术中DNA突变工具，具体地说是一种可以将DNA克隆到其上简洁快速地完成突变的突变载体及其应用。
背景技术：
基因突变有很多种方法。末端重叠PCR是常用的一种；Ho等早在1989年就使用了这一办法实现了对基因的剪切、连接以及突变等工作(Ho SN，Hunt HD，Horton RM.et al Site directed mutagenesis by overlap extensionusing the polymerase chain reaction.Gene 1989；7751-59.)。1997年Warrens等对这种突变方法又做了改进(Warrens AN，Jones MD，Lechler RI.Splicingby overlap extension by PCR using asymmetric amplificationan improvedtechnique for the generation of hybrid proteins of immunological interest.Gene.1997 20；186(1)29-35.)。直到近来这仍是基因突变常用方法之一；但其有操作复杂的缺点。在实际工作中发现，由于PCR的高度灵敏性，痕量的原模板污染就会造成突变的失败。由于带突变位点的引物之间的结合能不一定足够低，使得大量的两侧引物与未突变模板结合。在最终PCR产物中未突变的产物占绝大多数，从而使后继筛选工作不胜繁琐。Urban，Xu，Wang，Li等对这一方法进行了改进，但是其前期工作也比较繁杂，有些要用到价格昂贵的DpnI酶以除去污染(Urban A，Neukirchen S，Jaeger KE.A rapid andefficient method for site-directed mutagenesis using one-step overlap extensionPCR.Nuclec Acid Res.1997 25(11)2227-2228 Xu W，Zhang Y，Yeh LY et al.One-step，highly efficient site-directed mutagenesis by toxic protein selection.Biotechniques.2002 32(6)1266-1268，1270. Wang W，Malcolm BA.Two-stage polymerase chain reaction protocol allowing introduction of multiplemutations，deletions，and insertions，using QuikChange site-directedmutagenesis.Methods Mol Biol.2002；18237-43.Li F，Mullins JI.Site-directedmutagenesis facilitated by DpnI selection on hemimethylated DNA.MethodsMol Biol.2002；18219-27.)。否则就需要极小心吃力地进行操作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使突变操作更简便，不需要高性能的DNA聚合酶，而且中间产物无需纯化，最终产物分离简易的突变载体。使用该载体无需价格昂贵的DpnI酶，即可从突变产物中排除原模板扩增物的污染。
为实现上述目的，本发明从PUC 19出发，制成了一个带有T尾巴，具有Amp抗性，能在大肠杆菌中自主复制的载体做突变载体；其具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列。
所述突变载体的应用过程为1)通过PCR法制取待突变基因；以载体上已有的序列GTT GTA AAACGA CGA CCA GTG A作为引物P1；按待突变基因的碱基序列和突变目的设计带有互补区的另外二条突变引物P2、P3；2)突变模板的制备取待突变基因与突变载体连接，连接产物转化感受态菌株，转化物铺于IPTG-Xgal-Amp+LB琼脂平板上，37℃培养8～18小时，随机挑取若干个(至少2个，最好为8个或8个以上，如8～100个)白色菌落，悬浮于水或其它缓冲液(例如生理盐水，pH8.0的Tris-cl缓冲液，磷酸盐缓冲液等)中。振荡混均，95～100℃加热3～20min，取混合物加水或缓冲液稀释，此稀释物命名为混合模板；水或缓冲液的用量，必需足以使混合物中的PCR抑制物失去抑制作用，而模板DNA还可以有效地被扩增为好。通常为被稀释混合物体积的10倍或10倍以上。
3)突变反应①取混合模板做PCR反应的模板，配制PCR反应体系，均分成两管，一管以P1，P2做引物，另一管以P1，P3做引物，做PCR反应；②完整突变基因的合成；按1∶1的体积比取微量上述两管的反应产物做模板，以P1为引物，进行PCR反应。
最终PCR产物走琼脂糖凝胶电泳，若出现一条大于原基因分子量的基因条带就说明已完成基因突变。切取突变基因可以做后续操作。
本发明具有如下优点1.成本低。与市场上现有的同样的突变试剂盒相比，本发明绕过了DpnI酶，与高性能的DNA聚合酶。虽然多合成了一条引物，但是引物的造价低于这些酶不止十倍，而且不受DpnI酶生产菌株的限制，可以制造出价格更有竞争力的产品，这无疑对于产业化有莫大好处。
2.应用时简洁、快速、可靠。本载体具有以单个T为未端的尾巴，可以直接对PCR产物进行操作；而且带有Amp抗性编码基因，可用抗生素筛选转化成功的菌落；具有Lac Z部分编码基因，可以在适当的宿主中完成蓝白筛选，直接以颜色鉴别是否插入了外源PCR扩增产物；制做突变模板时只需随机挑取几个白色菌落即可。不需要常规操作时繁琐的质粒提取纯化过程，而且中间产物不用纯化，不怕原模板的污染。这些大大简化了操作，使而使从前三四天才能完成的工作量可在一天完成。
本发明产品采用两步法PCR引入突变位点，与一步法相比似乎更麻烦，但实际上由于第一次PCR反应中的产物无须纯化，只需取1uL做为底物加入第二步PCR反应体系即可，所以操作并不太复杂；而且第一步PCR产物的剩余部分可以用做电泳分析，在扩增失败时可以一步步查找原因，反倒比一步法更可靠。
3.有效地排除了原模板污染对后期工作的不利影响，提高了工作效率。本发明突变载体只有一个突出的T末端与PCR产物的A末端相互补，所以其插入产物不具有方向性。正向反向的插入片段都有；随机挑取一个白色转化菌落，其中含有正向插入片断的概率是1/2，其中含有反向插入片断的概率也是1/2。所以随机挑取n个菌落，所得的菌株中只含有正向，或只含有反向插入片断的概率为(1/2)n。而包含两个方向插入片断的概率为1-2×(1/2)n。投入P1和P2引物后，只有正向插入的VEGF的N端编码基因端夹在两个引物中间被扩增出来，而反向插入的VEGF不能被扩增。当投入P1和P3引物后，只有反向插入的VEGF的C端编码基因端夹在两个引物中间被扩增出来，而正向插入的VEGF不能被扩增。将P1-P2 PCR产物和P1-P3 PCR产物混合到一起，变性并退火，这两个片段的互补部分相互退火，PCR条件下延伸形成一条两端带反向载体片段的VEGF突变物。由于P1引物的互补片段在T载体的片段上，因此投入P1引物进行扩增时只有突变片断的退火产物可以被扩增出来。而留在反应体系中的原模板由于两端不带突变时引入的反向载体片段而不能扩，这就有效地排除了原模板污染对后期工作的不利影响，提高了工作效率(参见图1所示)。
4.通用引物设计合理具有GTT GTA AAA CGA CGA CCA GTG A序列。这个序列同源性小，依此而设计的引物适用范围广，而且引物长度适宜，使后继PCR操作很方便。
5、便于最终产物的筛选和确认。通用引物最后一个碱基到T尾巴的距离大约为95个碱基对，这可在完成突变后的基因上增加200碱基的长度(突变后的基因比原基因两端各多一百个左右的碱基，可以在适当酶切后用于后继的操作)，可以不用测序，直接用电泳技术即可鉴别突变是否成功，而且便于与末突变模板的分离。这对于常常需要引入突变的基因工程和蛋白工程实验十分有用。
图1为本发明突变载体工作原理图；图2为P1-P2及P1-P3 PCR产物电泳图；图3为单用P1 PCR产物电泳图；图4为本突变载体型的质粒图谱。
具体实施例方式
实施例1突变载体具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtaccgatatacgactcactatagcgcgacaaataatcgatcttatccgatgcgcggcggccagcagaccacacatcgtgtggtccattcaaaaaggtatacaaaagccaaaatacgacgctgcgggatactctgtagataatgtggtcaaagtgacgtatccaggactgacgccacacaacgtgtggcggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcg
ttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtc(1)SEQ ID NO1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度2869碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构环形(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源人工序列Puc19DNA(2)突变载体的构建PUC 19载体，EcoR I和Hind III内切酶，Ligase均购自宝生物公司。Xcm I内切酶自制，也可市购。
基因序列SEQ ID NO2agtgaattcgagctcggtaccgatatacgactcactatagcgcgacaaataatcgatcttatccgatgcgcggcggccagcagaccacacatcgtgtggtccattcaaaaaggtatacaaaagccaaaatacgacgctgcg
ggatactctgtagataatgtggtcaaagtgacgtatccaggactgacgccacacaacgtgtggcggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttgct自行合成。
(1)SEQ ID NO2的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度246碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源人工序列将PUC 19载体用EcoR I和Hind III内切酶处理，酶切过程依宝生物公司的产品说明进行；同时对合成的序列SEQ ID NO2做同样处理。用1％琼脂糖电泳纯化酶切所得的片段。然后将两个片段按1∶1摩尔比例混合，加入Ligase，在4度条件下反应16小时。反应条件依产品说明进行。连接物转化大肠杆菌JM109。在Amp+LB液体培养基中，37度，270rpm条件下培养18小时。提取质粒，用Xcm I酶切处理。用1％琼脂糖电泳纯化酶切所得的2700bp片段，做为突变载体。用紫外分光光度法测定其浓度，-20度贮存备用。
图4中给出了本突变载体型的质粒图谱。此质粒含有一个复制起始位点，一个AMP+编码基因(抗氨苄青霉素基因)，和一个LacZ基因。在LacZ基因中间，在不破坏LacZ基因读码框架的情况下插入一段核苷酸序列。此质粒的复制起点能高频率起动质粒复制，使一个细菌的质粒拷贝数可达500-700个。质粒携带的抗氨苄青霉素基因，编码β-内酰胺酶。它能水解氨苄青霉素的β-内酰胺环，破坏氨苄青霉素。当用此质粒转化细菌后，细菌能在含氨苄青霉素的培养基中生长，而不含此质粒的细菌都将被青霉素杀死。此质粒还带细菌lac操纵子中的lacI和lacZ编码基因。LacZ编码基因编码β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的结构域，并受到lacI编码产物的调控。当培养基加入诱导物IPTG时，lac Z基因被诱导表达，产生β-半乳糖苷酶的N端片断，它能与宿主菌表达的C端肽片断互补，产生具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白。半乳糖苷酶水解培养基中的Xgal，而使菌落呈现蓝色。本专利中插入的核苷酸序列不破坏LacZ基因读码框架，但当PCR产物插入后，通常会破坏lacz′编码的半乳糖苷酶，不能与宿主编码的肽段结合成有活性的半乳糖苷酶，不能水解培养基中的Xgal，菌落就不呈现蓝色。这种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有插入序列的转化菌落。
实施例2 突变载体的应用合成如下五条引物引物1(P1)GTT GTA AAA CGA CGA CCA GTG A引物2(P2)AGC CAG GCCAGCAGC ATT GCA GCA GC引物3(P3)GCTGCTGGC CTG GCTTGT GTG C引物4(P4)TAG AAT TCA CAT ATG GCA GAA GGA GGA GG引物5(P5)TAG AATTCA CGC CTC GGC TTG TCA CAT C委托伯奥公司合成P1、P2、P3，大连宝生物公司合成P4，P5。参照《精编分子生物学实验指南》中实验方法，以P4，P5为引物，通过PCR法制得的血管内皮生长因子(VEGF)基因，并以此血管内皮生长因子基因为例来完成突变。PCR反应基本条件为94度预变性2分钟，循环条件为94度30秒，72度30秒，55度30秒，循环30个循环。所用PCR试剂盒——Primix购自宝生物公司。引物1是载体上已有的序列，引物2和引物3是血管内皮生长因子上的序列。加粗字部分是P2、P3的互补区，下划线部分是引入的突变点。
突变模板的制备取VEGF的PCR产物与突变载体连接。连接反应使用宝生物的T4DNA连接酶，反应条件依然试剂说明进行。连接产物转化JM109感受态菌株，转化物铺于IPTG-Xgal-Amp+LB琼脂平板上，37℃培养过夜(见分子克隆第二版)。随机挑取八个白色菌落，悬浮于100ul无菌milli Q水中。振荡混均，100℃加热10min。取10ul混合物加水90ul，做十倍稀释。此稀释物命名为混合模板。
突变反应依以下条件做PCR反应。
第一步VEGF N端编码基因突变物和C端编码基因突变物的合成取混合模板1ul；P1，1ul；P2，1ul；Primix，25ul；ddH2O，22ul。分装12.5ul/管。做梯度PCR反应，退火温度依次设定为43℃，48℃，53℃。VEGF C端编码基因突变物的合成混合模板，1ul；P1，1ul；P3，1ul；Primix，25ul；ddH2O，22ul；分装12.5ul/管。做梯度PCR反应，退火温度依次设定为43℃，48℃，53℃。
第二步VEGF突变物的合成VEGF N端编码基因突变物0.5ul；VEGF C端编码基因突变物，0.5ul；P1，1ul；Primix，25ul；ddH2O，23ul；做梯度PCR反应，退火温度依次设定为41.3℃，45.4℃，48.0℃，50.7℃，56℃。
VEGF突变物的鉴定PCR产物走1％琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带(700bp)，用引物P4-P5，P1-P2，P1-P3做PCR鉴定(参见图2所示，其中左侧三条略下的明显条带为P1-P2 PCR产物，右侧三条略上的明显条带为P1-P3 PCR产物)。
由于突变基因最终产物比原VEGF基因长约200bp，所以很容易用常规电泳技术鉴定是否已完成突变，并十分方便地分离突变后的基因与末突变的模板基因。(参见图3所示，其中上面的一条是突变以后变大的基因，下面一条是掺入的原模板。两者距离很远，简单切胶纯化即可完成分离)。P1-P2，P1-P3 PCR产物做酶切分析，也可以证明这一点。VEGF突变物做序列测定，可以进一步证实突变点是是否成功引入预期位置。
权利要求
1.一种突变载体，其特征在于具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列。
2.一种权利要求1所述突变载体的应用，其特征在于1)通过PCR法制取待突变基因；以载体上已有的序列GTT GTA AAACGA CGA CCA GTG A作为引物P1；按待突变基因的碱基序列和突变目的设计带有互补区的另外二条突变引物P2、P3；2)突变模板的制备取待突变基因与突变载体连接，连接产物转化感受态菌株，转化物铺于IPTG-Xgal-Amp+LB琼脂平板上，37℃培养8～18小时，随机挑取至少2个白色菌落，悬浮于水或缓冲液中；振荡混均，95～100℃加热3～20min，取混合物加水或缓冲液稀释，此稀释物命名为混合模板；3)突变反应①取混合模板做PCR反应的模板，配制PCR反应体系，均分成两管，一管以P1，P2做引物，另一管以P1，P3做引物，做PCR反应；②完整突变基因的合成；按1∶1的体积比取微量上述两管的反应产物做模板，以P1为引物，进行PCR反应。
3.按照权利要求2所述突变载体的应用，其特征在于所述缓冲液为生理盐水，pH8.0的Tris-cl缓冲液或磷酸盐缓冲液。
4.按照权利要求2所述突变载体的应用，其特征在于所述突变模板的制备过程中随机挑取的白色菌落为8个或8个以上。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术中DNA突变工具，具体地说是一种可以将DNA克隆到其上简洁快速地完成突变的突变载体及其应用。本发明优点为成本低，应用时简洁、快速、可靠，有效地排除了原模板污染对后期工作的不利影响，提高了工作效率，便于筛选和确认。
文档编号C12N15/11GK1661017SQ20041002130
公开日2005年8月31日 申请日期2004年2月27日 优先权日2004年2月27日
发明者吕安国, 白向阳, 吴文芳 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所