专利名称：龙须菜选育品系和野生型及相关种鉴定的方法
技术领域：
本发明涉及对中国沿海经济海藻龙须菜选育品系及野生型和相关种进行鉴定；即龙须菜选育品系及野生型和相关种的ITS(转录间隔区)序列的获得及RAPD和ISSR特异指纹图谱的建立的方法，也即利用经济海藻龙须菜的ITS1和5.8S rDNA部分或全部DNA序列及RAPD和ISSR种内和种间的特异指纹图谱对龙须菜选育品系及野生型和相关种进行鉴定的方法。
背景技术：
龙须菜(G.lemaneiformis)是江蓠属的一个重要养殖种，它具有生长速度快、抗逆性强等优点。龙须菜营养价值极高，蛋白含量高，氨基酸种类多、数量大，维生素的含量也很丰富，此外，还含有大量的钙、磷、铁等无机盐等。龙须菜具有重要的工业价值，藻体内充满藻胶，含胶量达30％以上，是制造琼胶的重要原料之一，广泛应用于工、农、医业，作为细菌、微生物的培养基。龙须菜还具有药用价值，能解肠热，养胃滋阴，能治疗内热痰结和小便不利等。《中国海藻志》记载江蓠有弓江蓠(Gracilaria arcuata Zan.)、节江蓠(G.articulata)、芋根江蓠(G.blodgettii)、绳江蓠(G.chorda Holm.)、舌江蓠(G.lingula J.Ag.)和缢江蓠(G.salicornia)和龙须菜(G.lemaneiformis)等几十种。江蓠的许多种类在形态上差异比较大，很容易将它们区分开来。然而，也有些种特别是养殖种龙须菜，要想从形态上将它们从野生型中区分开来十分困难，因为龙须菜形态的变化很容易受到养殖环境水流、温度和地理差异等因素的影响。
随着分子生物学的迅猛发展，一些分子标记技术诸如随机引物扩增多态性(RAPD)、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)和简单序列重复间区(ISSR)等已被广泛的应用于重要经济海藻的鉴定。RAPD的原理是利用随机合成的10个寡核苷酸分子作为引物，以基因组DNA为模板，进行DNA片段的单引物随即合成，该技术现已广泛用于基因定位、连锁标记、物种识别和遗传多样性检测、种质资源鉴定和系统学研究等。ISSR利用了RAPD技术的优点和基因组中丰富的SSR(微卫星)序列信息，可在没有任何分子生物学研究基础的情况下进行基因组指纹图谱的构建，现也已应用于许多高等植物的品系鉴定、遗传作图、基因定位和遗传多样性分析等。
核糖体DNA是编码核糖体RNA的基因，在植物细胞核中以头尾相连的方式在染色体上重复排列，每个细胞中的拷贝数目在1000到10000之间。核糖体DNA中包含了进化速率不等的编码区、非编码区和非转录区，ITS(Internal transcribed spacer)是核糖体DNA中介于18S和5.8S之间(ITS1)以及5.8S和26S之间(ITS2)的非编码转录间隔区，目前研究显示，18S、5.8S和26S等rDNA基因的碱基对序列非常保守，不同植物间的差别很小；而位于植物rDNA基因间的ITS1和ITS2的碱基对序列则差异较大。尤其是近些年来，建立在PCR基础上直接测序方法的建立和广泛应用，ITS序列分析已成为在序列水平上对科内属间及属下种间的植物进行命名、分类、亲缘关系确定和系统进化研究的重要手段。
发明内容
本发明的目的是提供一套对中国沿海经济海藻龙须菜选育品系及野生型和相关种进行鉴定的方法，利用ITS区DNA序列和RAPD和ISSR种内和种间特异指纹图谱的内在联系，使结果更可靠、更准确。
本发明首先获得了中国沿海经济海藻龙须菜的rDNA ITS(包括ITS1和5.8S)全序列，包括如下步骤(1)收集藻体材料，进行品种鉴定，对选出的藻体进行总DNA提取(SDS-KAc法)取新鲜健康的藻体材料，用无菌水处理后，在液氮种研磨成粉末，转移到提取缓冲液[100mmol L-1Tris.HCl，pH8.0，50-100mmol L-1ethylenediaminetetra-acetic acid(EDTA)，0.2-0.5M NaCl，5％β-巯基乙醇，0.2％PVP-40，1.0-2.5％sodium dodecyl sulfate(SDS)]中，30-45℃水浴1h后用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次。上清液中等体积的4M的KAC，冰浴10min后再用氯仿∶异戊醇(24∶1)再抽提一次，取上清液加2/3体积异丙醇沉淀DNA。DNA溶解在TE中，加入Rnase除去RNA后用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提二次，加1/3体积异丙醇沉淀DNA，干燥后的DNA重新溶解在TE中；纯化部分DNA。琼脂糖凝胶电泳后染色显示提取的基因组DNA大小在23Kb以上。
(2)PCR扩增以寡核苷酸作为聚合酶链式反应(PCR)的引物，扩增ITS区段，所用的引物分别位于5.8S和28S的保守区段；龙须菜ITS区扩增的引物为P1和P2，序列如下P1(正向)为5’GGGATCCGTTTCCGGTAGGTGAACCTGC3’位于18S上，P2(反向)为5’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’，位于26S上；利用该引物对步骤(1)提取的DNA为模板，对总DNA进行PCR扩增反应；PCR反应扩增反应在20μL的体系种完成，反应液含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，Taq polymerase 1U，4种dNTP各2mmol/L，两个引物各5mmol/L，DNA模板约50ng。反应循环参数为95℃预变性5分钟；90℃ 1分钟，50℃ 2分钟，5个循环；72℃ 1分钟；90℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。并以ddH2O代替模板DNA做空白对照。
(3)PCR产物纯化；PCR产物用Watson试剂盒进行纯化，步骤按试剂盒操作指南进行。
(4)DNA序列测定应用直接测序技术对纯化后的DNA进行序列测定，确立rDNA ITS区，包括ITS1和5.8S区的全序列；用BigDyeTM测序试剂盒进行测序反应，测序反应参数为Mix 1μL，纯化后的DNA约30-50ng，Primer 1.5pmol，buffer 1.2μL，ddH2O适量。测序反应条件为95℃ 1min，95℃ 30s，50℃ 30s，60℃ 4min，总共35个循环；用ABI 310全自动测序仪上进行序列测定。
(5)DNA序列数据分析ITS1和ITS2的起止范围参照Genbank中已经注册的部分龙须菜ITS1和5.8SrDNA序列，待分析的rDNA ITS区的序列一经测定，序列输入计算机后用对位排列软件Clustal W进行对位排列，并辅以人工校对，用系统进化分析软件MEGA 2.1和Phylip 3.5分别分析各样品DNA序列与数据库中各个序列间的差异。
建立用于鉴别龙须菜种内和种间差异的RAPD和ISSR特异指纹图谱，步骤如下1)材料收集和总DNA提取(与前述相同，故省略)；2)RAPD和ISSR引物的合成，从大量随机引物中筛选出能稳定的扩增出特征条带的引物；3)根据扩增条带的多态性(分别根据RAPD和ISSR的扩增结果，依据不同材料的带型差异)，构建龙须菜选育品系及野生型和相关种的RAPD和ISSR特异指纹图谱。
所述的ITS区扩增后测序所设计的引物为P35’CGTTTCCGTAGGTGAACC3’，P25’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’；所述DNA序列数据分析中可以采用的部分DNA序列，其为中国沿海经济海藻龙须菜ITS区DNA序列，具有序列表SEQ ID NO1～13中任意一组碱基序列。
所述RAPD和ISSR引物的合成，从大量随机引物中筛选出能稳定的扩增出特征条带的引物从300个RAPD随机引物中筛选出30个能扩增出稳定带型的引物，再从这30个引物中筛选出7个能扩增出特异带型的引物。同样从合成的22个ISSR引物中筛选出16个能扩增出稳定带型的引物，再从这16个引物中筛选出7个能扩增出特异带型的引物。
经过RAPD检测从300个随机引物中筛选出用于构建龙须菜选育品系和野生种的种内RAPD指纹图谱的引物共有7条，其编号和序列分别为S345 CTCCATGGGG，S1110 CAGACCGACC，S1219 CTGATCGCGG，S1510 ACTGCCCGAC，S1513 GGCTTGGCGA，S2001 TTCCCCACCC，S2118 AGCCAAGGAC；经过RAPD检测从300个随机引物中筛选出用于构建江蓠属种间RAPD特异指纹图谱的引物共有7条，其编号和序列分别为S352GTCCCGTGGT，S384 GACTGCACAC，S387 AGGCGGGAAC，S389TGCGAGAGTC，S399 GAGTGGTGAC，S416 GTAACCAGCC，S1201CCATTCCGAG，S1217 CCACCACGAC，S1512 CTCCCAGGGT，S1514CTCTCGGCGA，S2010 GGACGTTGAG，S2020 GAGCGCTACC；经过ISSR检测从22个合成引物中筛选出用于构建龙须菜选育品系和野生种的种内ISSR指纹图谱的引物共有7条，其编号和序列分别为P1HBH(AG)7，P2(ATG)6，P3(GACA)4，P4(TG)8RT，P5(AC)8YG，P6(CA)8RG，P7(CA)6GG；经过ISSR检测从22个合成引物中筛选出用于构建江蓠属种间ISSR特异指纹图谱的引物共有6条，其编号和序列分别为P11(AG)8YC，P12BHB(GA)7，P13 VHV(GT)7，P14 BDB(CA)7，P15(GAA)6，P16(AAG)7。
RAPD扩增反应体系为1×PCR buffer，2.5mM MgCl2，0.2mMdNTP，0.2-0.4μM引物，10-50ng模板DNA，1.0-1.5U Taq酶；PCRbuffer为100mM KCl，80mM(NH4)2SO4，100mM Tris-HCl，pH＝9.0，NP-40；RAPD扩增反应循环参数为94℃预变性5分钟；94℃ 0.5分钟，38℃ 1分钟，72℃ 2分钟，35个循环，72℃延伸10分钟。
ISSR扩增反应体系为1×PCR buffer，2-2.5mM MgCl2，0.2mMdNTP，0.2-0.4μM引物，25-60ng模板DNA，1.0UTaq酶；PCR buffer为100mM KCl，80mM(NH4)2SO4，100mM Tris-HCl，pH＝9.0，NP-40；ISSR扩增反应参数为94℃预变性5分钟；94℃ 50秒，48℃-55℃1分钟，延伸72℃ 2分钟，32个循环。72℃延伸8分钟。
申请人从中国沿海9个港口城市采集了江蓠和龙须菜共13个材料；本发明提供了它们的rDNA ITS区的ITS1和5.8S的全部DNA序列，并构建了特异的RAPD和ISSR种内和种间指纹图谱，运用它们中的任何一种方法都可以把龙须菜选育品系及野生型和相关种鉴别开来。
本发明具有以下优点1.本发明首先建立了一套快速、有效的龙须菜高质量DNA的制备方法。
2.本发明对中国沿海经济海藻龙须菜选育品系及野生型和相关种的rDNA ITS区序列进行了测序，并获得了rDNA ITS区的ITS1和5.8S的全部序列。
3.本发明利用RAPD随机引物扩增的特异带型，构建了中国沿海经济海藻龙须菜选育品系及野生型和相关种的种内和种间RAPD特异指纹图谱。
4.本发明利用合成的ISSR引物扩增的特异带型，构建了中国沿海经济海藻龙须菜选育品系及野生型和相关种的种内和种间ISSR特异指纹图谱。
5.本发明利用ITS区DNA序列和RAPD和ISSR种内和种间特异指纹图谱的内在联系，结合三种检测方法，完全可以对中国沿海经济海藻龙须菜选育品系及野生型和相关种进行鉴定，使结果更可靠、更准确。
图1为龙须菜的种内RAPD指纹图谱；图2为江蓠属种间的ISSR指纹图谱；图3为龙须菜野生型和不同年代选育品系的ISSR指纹图谱。
具体实施例方式
实施例1用1g新鲜的江蓠或龙须菜，采用CTAB法和SDS-KAc法分别提取基因组DNA。
CTAB法新鲜的藻体加液氮研磨成粉末，转移到提取缓冲液[5％cetyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)，100mmol Tris-HCl(pH8.0)，100mm EDTA(pH8.0)，1.4mol NaCl，1％PVP]中，65℃水浴1h后加蛋白酶k，再用氯仿抽提。向上清液中加2倍体积95％冷乙醇将DNA沉淀下来，洗涤风干后溶于TE中。加入Rnase以除去RNA，用氯仿抽提一次后用异丙醇沉淀，得到的DNA重新溶解在TE中备用。
SDS-KAc法新鲜的藻体加液氮研磨成粉末，转移到提取缓冲液[100mmolL-1 Tris.HCl，pH8.0，50mmol L-1 ethylenediaminetetra-acetic acid(EDTA)，0.2M NaCl，5％β-巯基乙醇，0.2％PVP-40，1.0％sodiumdodecylsulfate(SDS)]中，37℃水浴1h后用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次。上清液中等体积的4M的KAC，冰浴10min后再用氯仿∶异戊醇(24∶1)再抽提一次，取上清液加2/3体积异丙醇沉淀DNA。DNA溶解在TE中，加入Rnase除去RNA后用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提二次，加1/3体积异丙醇沉淀DNA，干燥后的DNA重新溶解在TE中。
测定上述两种方法得到的DNA的得率和纯度(OD260/280)，结果进行比较，如下表1所示表1.
实施例2在本试验中，以SDS-KAc法提取基因组DNA，按优化的反应组分和扩增程序进行龙须菜的RAPD扩增，引物为S1510 ACTGCCCGAC，反应总体积为25μl，其中包括1×PCR buffer(100mM KCl，80mM(NH4)2SO4，100mM Tris-HCl，pH＝9.0，NP-40)，2.5mM MgCl2，0.2mMdNTP，0.2μM引物，25ng模板DNA，1.5UTaq酶。反应在Eppendorfmastercycler gradiant上进行。首先94℃预变性5min；94℃ 0.5min，38℃ 1min，72℃ 2min，35个循环；最后72℃延伸10min。反应产物在含有EB的1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测，85伏电压下电泳1.5小时，再经VDS观察拍照。电泳结果(如图1所示)显示出，根据引物S1510ACTGCCCGAC扩增后的差异带型可以明确区分龙须菜野生型和选育品系。
实施例3在本试验中，以SDS-KAc法提取基因组DNA，按优化的反应组分和扩增程序进行龙须菜的ISSR扩增，引物为P14，反应总体积为25μl，其中包括1×PCR buffer(10mM KCl，80mM(NH4)2SO4，100mM Tris-HCl，pH＝9.0，NP-40)，2.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.2μM引物，40ng模板DNA，1.0U Taq酶。反应在Eppendorf mastercycler gradiant上进行。首先94℃预变性5min；94℃ 50s，48℃ 1min，72℃ 2min，32个循环；最后72℃延伸8min。反应产物在含有EB的1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测，85伏电压下电泳1.5小时，再经VDS观察拍照。电泳结果(如图2所示)显示出，根据引物P14(TG)8RT扩增后的差异带型可以明确区分江蓠属内的不同种。
实施例4在本试验中，以SDS-KAc法提取基因组DNA，按优化的反应组分和扩增程序进行龙须菜的ISSR扩增，引物为P1，反应总体积为25μl，其中包括1×PCR buffer(100mM KCl，80mM(NH4)2SO4，100mM Tris-HCl，pH＝9.0，NP-40)，2.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.2μM引物，40ng模板DNA，1.0U Taq酶。反应在Eppendorf mastercycler gradiant上进行。首先94℃预变性5min；94℃ 50s，48℃ 1min，72℃ 2min，32个循环；最后72℃延伸8min。反应产物在含有EB的1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测，85伏电压下电泳1.5小时，再经VDS观察拍照。电泳结果(如图3所示)显示出，根据引物P1 HBH(AG)7扩增后的差异带型可以将龙须菜野生型和不同年代的选育品系鉴别开来。
序列附表(中国沿海经济海藻龙须菜rDNA ITS区(包括ITS1和5.8S)的全序列)1.源于山东青岛有囊果的野生龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)ITS1和5.8S区DNA全序列TTAGAGTTTGTGGGGGTGGCTTGATTCGATTTTCTTTTTGAGGTGCGCTGCTTGCATTTCTCCAATCGAGTTTTTGTTTTTTGAAGATTCTTGGATCGAAATGAGAGTAGTGTTCTGAAAAACAAGGAGTCTAGAGTCGTCGCCCTTGCAAGTGTTCTATTTTCTTACGCGAATAACTGTACTTTTTTTTTATTATCAACCCAAACCCATATGAAACGAAAAACTAAACTTTACAAAACACAACTCGTAACGGTGGATGTCTCGGTTCCTACATCGATGAAGAACGTAGCAAACTGCGAAACGTAATGCGAATTGCAGATCTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCAAGTTGCGCTCGCGGGTAACCCTGTGAGCATGTCTGCTTGAGTGTCCGCACAAA2.源于广西钦州的真江蓠(Gracilaria asiafica)ITS1和5.8S区DNA全序列ATAAAACCTGCTTCTTTTACTTAAAAATCCAAACCCTTTTTTTTTTTTCCCCTTCTCCCATNGANCGGCANAATTCCTNNCAAAAATTCCCTTGCCCCAAAAATTTAAAACCCCCAATAATAAAAAAAANCCCCCNNGGCCCGGTTTNTTTCATTTCCCCCAAAAAATTTTTCTGGAAACTTTTCTTTTTTTTTTACCCAAAACCCAAACCAAAANCAAACNTNTTGGCCTTGGGAAAATAAATTAAACCCCCCTACCGGGGGTTTTCCCCGCCCCCACACCNATAAAAAACNTCCCAAACGGCAAAACNTATGNCAAAATTGCAAAACCCCNGNAATCCCCAAAATTTTTTAAACCCCAGTGGGCCCCCCCGGGTAACCCCTCAAACCTTTTTTT3.源于山东荣成的选育品系龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)ITS1和5.8S区DNA全序列TTAGAGTTTGTGGGGGTGGCTTGATTCGATTTTCTTTTTGAGGTGCGCTGCTTGCATTTCTCCAATCGAGTTTTTGTTTTTTGAAGATTCTTGGATCGAAATGAGAGTAGTGTTCTGAAAAACAAGGAGTCTAGAGTCGTCGCCCTTGCAAGTGTTCTATTTTCTTACGCGAATAACTGTACTTTTTTTTTATTATCAACCCAAACCCATATGAAACGAAAAACTAAACTTTACAAAACACAACTCGTAACGGTGGATGTCTCGGTTCCTACATCGATGAAGAACGTAGCAAACTGCGAAACGTAATGCGAATTGCAGATCTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCAAGTTGCGCTCGCGGGTAACCCTGTGAGCATGTCTGCTTGAGTGTCCGCACAAA4.源于山东青岛野生龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)营养枝ITS1和5.8S区DNA全序列TTAGAGTTTGTGGGGGTGGCTTGATTCGATTTTCTTTTTGAGGTGCGCTGCTTGCATTTCTCCAATCGAGTTTTTGTTTTTTGAAGATTCTTGGATCGAAATGAGAGTAGTGTTCTGAAAAACAAGGAGTCTAGAGTCGTCGCCCTTGCAAGTGTTCTATTTTCTTACGCGAATAACTGTACTTTTTTTTTATTATCAACCCAAACCCATATGAAACGAAAAACTAAACTTTACAAAACACAACTCGTAACGGTGGATGTCTCGGTTCCTACATCGATGAAGAACGTAGCAAACTGCGAAACGTAATGCGAATTGCAGATCTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCAAGTTGCGCTCGCGGGTAACCCTGTGAGCATGTCTGCTTGAGTGTCCGCACAAA5.源于广西竹林的细基江蓠(Gracilaria tenuistipitata)ITS1和5.8S区DNA全序列TTAAGATCGTCAAAAATTACTTTACAATTGAGCTGCCTTTTAACGAAGGAATGTGTTCCGGTCTTATCCAAGCGACTCAAATCCGGTTGAGCCTTTGTTGTTTATTGAGATATCAAAAAACTAAAAAAGAAGGAGAAAAACTTGTATCTAGAGAGCTGCCAGTAGGCCGTAATAATTTCTTTTTCATTCTTCACGCGAATAATTTTGTTTGTTCTTTTATTTTTTACAAAAAAACCAAAACGAAAAAAAATGTAAAACGTGTCTGAACTAATTACAACTCGTAACGGTGGATGTCTCGGCTCCTACATCGATGAAGAACGTAGCAAACTGCGAAACTCGTGAATCATCAAATTTTTGAACGCAAGTGGCGCTCGCGGGTAACCCTGCGAGCATGTCTGTTTGAGTGTCCCTACAAA6.源于广东深圳的细基江蓠(Gracilaria tenuistipitata)ITS1和5.8S区DNA全序列TTAAGATCGTCAAAAATTATTTTACAATTGAGCTGCCTTTTAACGAAGGAATGTGTTCCGGTCTTATCCCAGCGACTCAAATCCGGTTGAGCCTTTGTTGTGTATTGAGATATCAAAAAACTAAAAGAGAAGGAGAAAAACTTGTATCTAGAGAGCTGTCAGTAGGCCGTAATAATTTTTTTTTATTCTTCACGCGAATAATTTTGTTTGTTCTTTTATTTTTTACAAAAAAACCAAAACGAAAAAAAATGTAAAACGTGTCTGAACTAATTACAACTCGTAACGGTGGATGTCTCGGCTCCTACATCGATGAAGAACGTAGCAAACTGCGAAACTCGTGAATCATCAAATTTTTGAACGCAAGTGGCGCTCGCGGGTAACCCTGCGAGCATGTCTGTTTGAGTGTCCCTACAAA7.源于广西防城港的真江蓠(Gracilaria asiafica)ITS1和5.8S区DNA全序列ATAAAACCTGCTTCTTTTACTTAAAAATCCAAACCCTTTTTTTTTATTTCCCCTTCTCCCAGNGANCGGCANAATTCCTTNCAAAAATTCCCTTGCCCCAAAAATTTAAAACCCCCAATAATAAAAAAAANCCCCCNNGGCCCGGTTTNTTTCATTTCCCCCAAAAAATTTTTTTGGAAACCTTTTTTTTTTTTTTTACCCAAACCCCAAACCAAAANCCAACCTNTTGGCCCTGGGAAAAAAAAATTAAACCCCCAAACNGGGGGTTTCCCCCGCCCCCACACCNATAAAAAACNTCCNACCCGGCAAAAACTTTNNGAAATTGCNAAAACCCNGAAACCCCCAAATTTTTCAAACCCAATTGGCCCCCCCGGGGACCCCCCGAACTTTTTTTT8.源于广西的张氏江蓠(Gracilaria changii)ITS1和5.8S区DNA全序列TTAAGATCGTCAAAAATTATTTTACAATTGAGCTGCCTTTTAACGAAGGAATGTGTTCCGGTCTTATCCAAGCGACTCAAATCCGGTTGAGCCTTTGTTGTGTATTGAGATATCAAAAAACTAAAAAAGAAGGAGAAAAACTTGTATCTAGAGAGCTGTCAGTAGGCCGTAATAATTTCTTTTTCATTCTTCACGCGAATAATTTTGTTTGTTCTTTTATTTTTTACAAAAAAACCAAAACGAAAAAAAATGTAAAACGTGTCTGAACTAATTACAACTCGTAACGGTGGATGTCTCGGCTCCTACATCGATGAAGAACGTAGCAAACTGCGAAACTCGTGAATCATCAAATTTTTGAACGCAAGTGGCGCTCGCGGGTAACCCTGCGAGCATGTCTGTTTGAGTGTCCCTACAAA9.源于江苏连云港的选育品系龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)ITS1和5.8S区DNA全序列TTAGAGTTTGTGGGGGTGGCTTGATTCGATTTTCTTTTTGAGGTGCGCTGCTTGCATTTCTCCAATCGAGTTTTTGTTTTTTGAAGATTCTTGGATCGAAATGAGAGTAGTGTTCTGAAAAACAAGGAGTCTAGAGTCGTCGCCCTTGCAAGTGTTCTATTTTCTTACGCGAATAACTGTACTTTTTTTTTATTATCAACCCAAACCCATATGAAACGAAAAACTAAACTTTACAAAACACAACTCGTAACGGTGGATGTCTCGGTTCCTACATCGATGAAGAACGTAGCAAACTGCGAAACGTAATGCGAATTGCAGATCTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCAAGTTGCGCTCGCGGGTAACCCTGTGAGCATGTCTGCTTGAGTGTCCGCACAAA10.源于福建的选育品系龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)ITS1和5.8S区DNA全序列TTAGAGTTTGTGGGGGTGGCTTGATTCGATTTTCTTTTTGAGGTGCGCTGCTTGCATTTCTCCAATCGAGTTTTTGTTTTTTGAAGATTCTTGGATCGAAATGAGAGTAGTGTTCTGAAAAACAAGGAGTCTAGAGTCGTCGCCCTTGCAAGTGTTCTATTTTCTTACGCGAATAACTGTACTTTTTTTTTATTATCAACCCAAACCCATATGAAACGAAAAACTAAACTTTACAAAACACAACTCGTAACGGTGGATGTCTCGGTTCCTACATCGATGAAGAACGTAGCAAACTGCGAAACGTAATGCGAATTGCAGATCTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCAAGTTGCGCTCGCGGGTAACCCTGTGAGCATGTCTGCTTGAGTGTCCGCACAAA11.源于广西江平的细基江蓠(Gracilaria tenuistipitata)ITS1和5.8S区DNA全序列TTAAGATCGTCAAAAATTATTTTACAATTGAGCTGCCTTTTAACGAAGGAATGTGTTCCGGTCTTATCCAAGCGACTCAAATCCGGTGGAGCCTTTGTTGTGTATTGAGATATCAAAAAACTAAAAAAGAAGGAGAAAAACTTGTATCTAAAGAGCTGTCAGTAGGCCGTAATAATTTTTCTTTCATTCTTCACGCGAATAATTTGGTTTGTTCTTTTATTTTTCACAAAAAAACCAAAACGAAAAAAAATGTAAAACGTGTCTGAACTAATTACAACCTCGTAACGGTGGATGTCTCGGCCCCTACATCGATGAAGAACGTAGCAAACTGCGAAACTCGTGAATCATCAAATTTTTGAACGCAAGTGGCGCTCGCGGGTAACCCTGCGAGCATGTCTGTTTGAGTGTCCGTACAAA12.源于山东青岛的真江蓠(Gracilaria asiafica)ITS1和5.8S区DNA全序列ATAAAACCTGCTTCTTTTACTTAAAAATCCAAACCCTTTTTTTTTTTTTCCCCTTCTCCCANNGANCGGCANAATTCCTGNCAAAAATTCCCTTGCCCCAAAAATTTAAAACCCCCAATAATAAAAAAAANCCCCCNNACCCCGGTTTNTTTCATTTCCCCCAAAAAATTTTTGGGACCCTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCAAANCCCAACCCAAAANCAAACTTNTTGGCCTTGGGAAAAAAAAATTAAACCCCCAAACGGGGGGTTTTCCCCGCCCCCACACCNATAAAAAACNTTTCCAACTCGGCAAAACTTTTTNGGAAATTGCCAAACCCCNGTAAACCCCAATTTTTTAACCCCCANGTGGCCCCCCCGGTTAACCCCGCGAACCTTTTTTTT13.源于山东青岛的扁江蓠(Gracilaria textorii)ITS1和5.8S区DNA全序列
GTACGTTCTCTACTCATTGCTGTTTATGAGCTGCTCGTGGGGGGGTCCTGAAAAATGGAAATCCCCAGGGGAATGTGTTCCAGTAGCGAGTTGCGTATATACTACAAGAGTCTGTGCGTTTTTCTGCATAAGCTTTACCACAGAAATAAACACATCCAGGGCTCTAAAACTACCACGCGCATACTTTCATAATCTTTTTTTTATACTTTTAACCTAGAACCTACAAACCCATAAACAGCTAACCATGTGTGTGAAAATTACAACTCGTAACGGTGGATGTCTCGGCTCCTACATCGATGAAGGACGTAGCAAACTGCGAAACGTAATGCGAATTGCAGAACTCGTGAATCATCAAATTTTTGAACGCAAGTGGCGCTCGCGGGTAACCCTGCGAGCATGTCTGTTTGAGTGTCCCGTACAAA
SEQUENCE LISTING<110>中国科学院海洋研究所<120>龙须菜选育品系和野生型及相关种鉴定的方法<130>
<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>401<212>DNA<213>龙须菜(Gracilaria sjoestedtii Kylin)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)..(239)<223>
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<221>rRNA<222>(240)..(401)<223>
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<221>misc_feature<222>(62，65，71，79，80，130，136，137，148，216，222，224，283，293，310，315，333，335)<223>n＝未知<220>
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1.龙须菜选育品系和野生型及相关种鉴定的方法，其特征在于龙须菜的rDNA ITS全序列的获取，步骤如下(1)总DNA提取取新鲜健康的藻体材料，用无菌水处理后，在液氮种研磨成粉末，提取总DNA；提取缓冲液的组成为100mmol L-1Tris.HCl，pH8.0，50-100mmol L-1EDTA，0.2-0.5M NaCl，5％β-巯基乙醇，0.2％PVP-40，1.0-2.5％SDS，提取所用的KAc浓度为4.0-5.0M，pH值范围在5.2-7.5；(2)PCR扩增龙须菜ITS区扩增的特异引物P1、P2的序列分别为P15’GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC3’，位于18S上；P25’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’，位于26S上；利用该引物对步骤(1)提取的DNA为模板，对总DNA进行PCR扩增反应；(3)PCR产物纯化；(4)DNA序列测定纯化后的DNA进行序列测定，确立rDNA ITS区，包括ITS1和5.8S区的全序列；(5)DNA序列数据分析待分析的rDNA ITS区的序列一经测定，用对位排列软件Clustal W进行对位排列，并辅以人工校对，用系统进化分析各样品DNA序列与数据库中各个序列间的差异；建立用于鉴别龙须菜种内和种间差异的RAPD和ISSR特异指纹图谱，步骤如下1)总DNA提取；2)RAPD和ISSR引物的合成，从大量随机引物中筛选出能稳定的扩增出特征条带的引物；3)根据扩增条带的多态性，构建龙须菜选育品系及野生型和相关种的RAPD和ISSR特异指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的龙须菜选育品系和野生型及相关种鉴定的方法，其特征在于所述总DNA提取为新鲜的藻体加液氮研磨成粉末后，转移到提取缓冲液中，30-45℃水浴1h后用酚∶氯仿∶异戊醇抽提一次；上清液中加等体积的4M的KAC，冰浴10min后再用氯仿∶异戊醇再抽提一次，取上清液加2/3体积异丙醇沉淀DNA，DNA溶解在TE中，加入Rnase除去RNA后用氯仿∶异戊醇抽提二次，加1/3体积异丙醇沉淀DNA，干燥后的DNA重新溶解在TE中。
3.根据权利要求1所述的龙须菜选育品系和野生型及相关种鉴定的方法，其特征在于所述20μL ITS区扩增的反应液中含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，Taq polymerase 1U，4种dNTP各2mmol/L，两个引物各4-6mmol/L，DNA模板40-100ng；PCR扩增的反应循环参数为95℃预变性5分钟；90℃1分钟，50-53℃2分钟，5个循环；72℃1分钟；90℃1分钟，58-60℃1分钟，72℃1分钟，28-35个循环；72℃延伸10分钟。
4.根据权利要求1所述的龙须菜选育品系和野生型及相关种鉴定的方法，其特征在于所述的ITS区扩增后测序所设计的引物为，P35’CGTTTCCGTAGGTGAACC3’，P25’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’。
5.根据权利要求1所述的龙须菜选育品系和野生型及相关种鉴定的方法，其特征在于所述DNA序列数据分析中可以采用的部分DNA序列，其为中国沿海经济海藻龙须菜ITS区DNA序列，具有序列表SEQ IDNO1～13中任意一组碱基序列。
6.根据权利要求1所述的龙须菜选育品系和野生型及相关种鉴定的方法，其特征在于所述筛选出用于构建龙须菜选育品系和野生种的种内RAPD指纹图谱的引物共有7条，其编号和序列分别为S345 CTCCATGGGG，S1110CAGACCGACC，S1219 CTGATCGCGG，S1510 ACTGCCCGAC，S1513GGCTTGGCGA，S2001 TTCCCCACCC，S2118 AGCCAAGGAC；所述筛选出用于构建江蓠属种间RAPD特异指纹图谱的引物共有7条，其编号和序列分别为S352 GTCCCGTGGT，S384 GACTGCACAC，S387 AGGCGGGAAC，S389 TGCGAGAGTC，S399 GAGTGGTGAC，S416 GTAACCAGCC，S1201 CCATTCCGAG，S1217 CCACCACGAC，S1512 CTCCCAGGGT，S1514 CTCTCGGCGA，S2010 GGACGTTGAG，S2020 GAGCGCTACC；所述筛选出用于构建龙须菜选育品系和野生种的种内ISSR指纹图谱的引物共有7条，其编号和序列分别为P1 HBH(AG)7，P2(ATG)6，P3(GACA)4，P4(TG)8RT，P5(AC)8YG，P6(CA)8RG，P7(CA)6GG；所述筛选出用于构建江蓠属种间ISSR特异指纹图谱的引物共有6条，其编号和序列分别为P11(AG)8YC，P12 BHB(GA)7，P13 VHV(GT)7，P14 BDB(CA)7，P15(GAA)6，P16(AAG)7。
7.根据权利要求6所述的龙须菜选育品系和野生型及相关种鉴定的方法，其特征在于RAPD扩增反应体系为1×PCR buffer，2.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.2-0.4μM引物，10-50ng模板DNA，1.0-1.5U Taq酶；PCR buffer为100mM KCl，80mM(NH4)2SO4，100mM Tris-HCl，pH＝9.0，NP-40。
8.根据权利要求6所述的龙须菜选育品系和野生型及相关种鉴定的方法，其特征在于RAPD扩增反应循环参数为94℃预变性5分钟；94℃0.5分钟，38℃1分钟，72℃2分钟，35个循环，72℃延伸10分钟。
9.根据权利要求6所述的龙须菜选育品系和野生型及相关种鉴定的方法，其特征在于ISSR扩增反应体系为1×PCR buffer，2-2.5mMMgCl2，0.2mM dNTP，0.2-0.4μM引物，25-60ng模板DNA，1.0UTaq酶；PCR buffer为100mM KCl，80mM(NH4)2SO4，100mM Tris-HCl，pH＝9.0，NP-40。
10.根据权利要求6所述的龙须菜选育品系和野生型及相关种鉴定的方法，其特征在于ISSR扩增反应参数为94℃预变性5分钟；94℃50秒，48℃-55℃1分钟，延伸72℃2分钟，32个循环；72℃延伸8分钟。
全文摘要
本发明涉及对中国沿海经济海藻龙须菜选育品系及野生型和相关种进行鉴定的方法，即龙须菜rDNA ITS区ITS1和5.8S整个序列的确定，及RAPD与ISSR种内和种间特异指纹图谱的建立。ITS区DNA序列获得的步骤为1)总DNA提取；2)以上步得到的DNA为模板，进行PCR扩增反应；3)PCR产物纯化；4)对纯化后的DNA进行测序；5)用对位排软件进行对位排列，并辅以人工校对，结合Genbank中已经注册的部分龙须菜的ITS序列确定ITS的起始位点，用系统进化软件分析序列差异并对龙须菜进行鉴定。RAPD和ISSR指纹图谱建立的步骤为1)总DNA提取；2)RAPD和ISSR引物的筛选；3)特异引物扩增及建立RAPD和ISSR种内和种间差异的指纹图谱。结合三种检测方法，完全可以对中国沿海经济海藻龙须菜选育品系及野生型和相关种进行鉴定。
文档编号C12Q1/68GK1641044SQ20041002101
公开日2005年7月20日 申请日期2004年1月7日 优先权日2004年1月7日
发明者段德麟, 李文红, 胡自民 申请人:中国科学院海洋研究所