专利名称：：一种耐高温龙须菜优良品系诱变选育方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，具体地说，涉及一种耐高温龙须菜优良品系-秀变选育方法。
背景技术：
：我国藻类栽培有60余年历史，产量占世界70%以上。栽培物种主要有海带、紫菜、裙带菜等。藻类栽培创造了显著的经济、社会和生态效益。但是，与海洋经济动物养殖相比，产业和产品结构更新发展緩慢。琼胶是食品、化工、医药和生物工程等产业不可缺少的重要原料，具有巨大的市场需求。20世纪90年代末世界琼胶年产量约15000吨(纪明侯《海藻化学》)，目前已超过20000吨。但是我国产琼胶海藻栽培基本是空白。产琼胶海藻主要是石花菜属("ehV/，)和江蓠属("ac/hr/a),其中三分之二的琼胶是由江蓠属海藻生产的。江蓠属海藻生长速度比石花菜快，琼胶的含量也很高。因此，在江蓠属中选择适宜的物种进行人工栽培，为琼胶生产提供原料，具有重要的意义。龙须菜(〃rac/7ar/a/e/z7<2/7e//*o_nz7/s),红藻门江蓠科江蓠属，原产于山东沿海潮间带。龙须菜分枝较多，生长快，每年春秋两季为快速生长期，最适生长温度为12-23°C。与江蓠属其他物种性比，龙须菜是一种较好的产琼胶海藻。目前对原产于我国青岛的龙须菜进行了系统的遗传学研究，包括细胞突变体的遗传分析、突变体光合特性的变异、琼胶质量和酶活性的变异等。从20世纪80年代就已经在龙须菜的原产地一青岛海区进行人工栽培试验，获得成功，标志着从采集野生龙须菜到人工规模栽培的转变。并且在人工栽培过程中发现了自发突变体，经高温环境条件下筛选出来耐高温突变抹野生型龙须菜，具有耐高温、速生抗逆、3琼胶含量高质量好等优良性能，2007年获得国家级原良种种证书。野生型龙须菜选育成功为龙须菜栽培业奠定了基础。目前在我国已经形成在广东、福建、浙江、江苏、山东和辽宁沿海的栽培产业，栽培面积超过20万亩，年产量超过15万吨，已成为我国第三大海藻栽培业。龙须菜栽培促进了我国琼胶制造业的发展，年产琼胶愈万吨，消耗龙须菜产量的四分之三。另外龙须菜在鲍鱼养殖中是一种重要的饰料，随着鲍鱼养殖业的发展，需求量日益增加，已占龙须菜产量的三分之一。随着龙须菜养殖业的不断发展，其耐高温性、生长速率及琼胶含量仍亟待提高，以扩大其栽培地域并延长栽培时间，进一步提高产品产量和质量。因此有必要对其进行遗传改良，选育出更具应用价值的新品种。
发明内容本发明提供了一种耐高温龙须菜优良品系诱变选育方法，可以解决现有野生型龙须菜的耐高温性能差、生长速率慢和含胶量较低的问题。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现一种耐高温龙须菜优良品系诱变选育方法，所述方法包括下述步骤a、M匪G诱变将龙须菜的藻丝放入MNNG处理液中浸泡，对龙须菜进行诱变，所述MNNG为N-曱基-N'-硝'基-N-亚硝'基胍；b、HYP抗性系筛选将上述经诱变的龙须菜的藻丝放入含HYP的f/2培养基中进行高温培养，筛选出所需要的耐高温龙须菜的藻丝，所述HYP为L-羟脯氨酸。在本发明的上述技术方案中，还具有以下技术特征所述浸泡时间为10~60min。在本发明的上述技术方案中，还具有以下技术特征所述MNNG处理液的浓度为25~40mg/L。在本发明的上述技术方案中，还具有以下技术特征所述f/2培养基中HYP的〉农度为0.01~3mmol/L。4在本发明的上述技术方案中，还具有以下技术特征所述高温为30~45°C。在本发明的上述技术方案中，还具有以下技术特征所述高温优选范围为31~33°C。在本发明的上述技术方案中，还具有以下4支术特征在进行MNNG诱变筛选之前可以对龙须菜的藻丝进行预培养，所述预培养是采用f/2培养基，培养温度为16~3(TC，光强40~60mol/m2s,光暗周期12L:12D,每周更换一次培养基，然后再进4亍MNNG诱变篩选。光暗周期12L:12D指的是在一天24小时内，光照12小时，黑暗12小时。在本发明的上述技术方案中，还具有以下技术特征所述培养温度优选为20-25°C。在本发明的上述技术方案中，还具有以下技术特征所选用的龙须菜的藻丝是龙须菜的茎尖部分，所述茎尖部分的长度为20~50mm。在本发明的上述技术方案中，还具有以下技术特征所述HYP抗性系筛选步骤中的培养时间为3~14天。戶斤述MNNG是N—曱基一N'_石肖基一N—亚石宵基脈(N—methyl—N'-nitro-N-nitrosoguanidine);MNNG是一种强诱变剂，具有强致癌性，应该在实验过程多加注意防护措施，并且做好后期实验药品的处理。所述HYP是L-羟脯氨酸f/2培养基的配方如下工作液(mg/L)A:NaN0375mgB:NaH2P04.H205mg母液(g/L)75gC:Na2Si03.9H2020mgDNa2EDTA4.36mg20g4.36g3.16g0.Olg0.023g0.012g0.18gE:FeCh.6H203.16mgF:CuS04.5H200.OlmgZnS04.7H200.023mgCoCL2.6H200.012mgMnCL.4H200.18mgNa2Mo042H200.07mg0.07gG:维生素Bl0.lg0.lmg维生素B120.5g0.5mg生物素0.5g0.5mg自然海水(0.4m孔径滤膜过滤)1升，在121°C下灭菌20min。具体选育步骤如下1、材料的采集和培养将采集的材料用毛刷进行刷洗，除去杂藻。选取生长旺盛的藻林于三角瓶中通气培养。采用f/2培养基，培养温度为20~22°C。光强40~60mol/m2s。光暗周期12L:12D，每周更换一次培养基。2、M腦诱变处理(1)诱变剂浓度为30mg/L的MNNG。(2)诱变处理取长20~30mm的茎尖作为诱变材料，于250ml三角瓶中培养一周，然后置于MNNG处理液中进行-秀变，处理时间分别为0、10、20、30、40和50min,每组茎尖100条。诱变处理完毕先用蒸馏水冲洗，再用消毒海水冲洗3遍。处理后的材料于f/2培养基中暗培养24小时后移至光下培养，培养条件同上。将存活的藻体茎尖继续培养，观察其活性，选择生长旺盛的处理组进行下一步耐高温筛选。3、耐高温藻抹的选择(1)筛选培养基加入不同浓度HYP的f/2培养基(HYP浓度为0.5、1、1.5、2、2.5和3画1/L)。(2)HYP处理将上述经30minMNNG诱变的茎尖再加入不同浓度HYP的f/2培养基中进行初筛，每组30条，根据茎尖的死亡率选择HYP的适宜浓度。然后在含有此浓度的HYP培养基上继续培养。最后将存活的植抹在31°C下高温筛选，得到的成活植林就是所要筛选的耐高温品系。以981龙须菜开始i秀变称为出发品系，以出发品系为对照，才全测新品系的耐高温性能和生长状况。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是本发明采用化学诱变剂N-曱基-N'-硝基-N-亚硝基胍(N-methy1—N'—nitro—N—nitrosoguanidineMNNG)诱变的方法，对龙须菜进行诱变，然后对其进行L-羟脯氨酸(HYP)抗性系的筛选，筛选出具有耐高温等优良性状的新品种，不但能提高野生型藻体的耐高温性能、而且还提高生长速率和含胶量。本发明提出了一种全新的诱变方法，这种通过人工栽培方法得到的龙须菜品种具有优良性状，不但耐高温，这样在南方通常水温比4交高的环境下同样也可以大量繁殖龙须菜，而且生长速率快，其含胶量也比较高，为龙须菜栽培提供了新品系，对于促进琼胶制造业的发展也有重要意义。图1为野生型龙须菜经不同时间诱变处理后的存活率；图2为不同剂量HYP处理后藻抹的存活率；图3为4(TC胁迫72h后野生型龙须菜和07-2生长状态比较；图4为07-2和野生型龙须菜藻体长度的比较；图5为30°C高温胁迫对07-2和野生型龙须菜体内游离脯氨酸含量的影响；图6为不同温度条件下07-2和野生型龙须菜中a-半乳糖苷酶活性比较；图7为2种龙须菜日平均生长速率的比较；图8为07-2和野生型龙须菜日平均生长速率比较。具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。实施例1:1)龙须菜的诱变选育方法取长20-50mm的茎尖作为诱变材料，然后置于30mg/L的MNNG处理液中进行诱变，处理时间分别为0、10、20、30、40和50min,处理后的材料于f/2培养基中暗培养24小时后移至光下培养。结果显示茎尖经M匪G诱变后仍具有正常的萌发和成长能力。但其存活率与诱变时间有一定的关系。由图1可以看出M丽G对野生型龙须菜有明显的抑制作用，诱变时间越长，茎尖的存活率越低，当7诱变时间达到30min以上时，50%的茎尖无法存活。处理后第3天，10min处理组的存活率为90%，而5Omin处理组的存活率<又为75%。处理后第12天，30min处理组的存活率为48%,50min处理组已经全部死亡。经MNNG诱变后的藻体在短时间的培养的藻体中可见生长速度差异，并偶尔出现色素突变体。30min处理组的藻体较早出现分枝，生长速度明显高于其他各组，收集茎尖进行下一步HYP筛选。2)HYP抗性系的篩选方法将上述经30minMNNG诱变的茎尖在加入不同浓度HYP(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.Ommol/L)的f/2培养基中进行初筛，每组30条，根据茎尖的死亡率选择HYP的适宜浓度。然后在含有此浓度的HYP培养基上继续培养。筛选结果经HYP处理后第1、3、7天的藻抹存活率见图2。可见HYP对藻林的存活率有明显的影响，不同浓度处理后藻抹的存活率都明显低于对照组，尤其高浓度对藻株表现出强烈的致死作用。处理l天后，0.5mmo1/L组存活率达到92。/。，3mmo1/L组《又为20。/。，处理7天后，0.5mmo1/L组存活率下降到70°/。，3mmo1/L组已经全部死亡。2mmol/L组第1天存活率为73%,第7天下降到51°/。接近半致死率。因此经过0.5~3mmo1/LHYP浓度的初始筛选后，得到适宜的筛选浓度为2mmol/L。用含有此浓度的筛选培养基进行培养，取存活藻株在31。C高温条件下培养24h进行二次筛选。最后将存活的9抹藻抹放入烧杯中通气培养，采用f/2培养基，培养温度为21°C士rC，光强40~60mol/m2s，光暗周期12L:12D。每周更换新鲜培养基。四周后观察有一抹材料分枝较多、色泽均匀、生长迅速，命名为07-2。实施例22个品系耐高温特性的测定野生型龙须菜和07-2分别选取3林藻体置于100ml的三角瓶中加80ml培养基，在4(TC的光照恒温培养箱中培养，观察藻体的形态及色素变化。相同的高温胁迫条件(40°C)对07-2和野生型龙须菜造成的损伤和病烂程度并不相同，07-2发生病烂的时间和程度明显晚于野生型龙须菜。胁迫12h，二者形态都无明显变化，枝条保持完整，无病烂现象(退色和烂梢)。24h时，野生型龙须菜分枝开始出现退色变白，07-2仅有少量分枝发白死亡。48h时，野生型龙须菜的退色区域扩大主枝呈现粉红色，07-2主枝仍呈现深红色。72h时，野生型龙须菜全部变白死亡，07-2分4支全部死亡^f旦主冲支为红色(如图3所示)。实施例32个品系线生长速度的比较野生型龙须菜和07-2分别选取长度为10mm的幼嫩藻尖50根，置于100ml的三角瓶中加入80ml培养基，培养一周后测定长度，如有分枝，将所有分枝加入总长，连续测四周，计算平均线生长速度。每周更换培养基。07-2和野生型龙须菜的生长状态见图4，显示出较为明显的差异。07-2平均线生长速率为0.90mm/d;野生型龙须菜为0.77mm/d,两者之间差异显著(p<0.05)。两个品系的藻抹起始长度都为10mm，随着培养时间延长07-2和野生型龙须菜的藻体长度差异逐渐明显。7天时07-2和野生型龙须菜的藻体长度并无显著差异(p>0.05)，28天时二者已经显示出明显的差异(p<0.05)，野生型龙须菜藻体平均长度为40.85mm，07-2藻体平均长度为45.90mm，表现出较明显的生长优势。实施例42个品系藻体分枝数和直径的比较随机选取野生型龙须菜和07-2的末级分枝20段，长度0.5mm。计算每个品系的分枝数。并从中选取长度超过lcm的茎尖，用刀片从其基部切断。每20根为一组，计算每个品种的藻枝直径。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*代表差异极其显著(pSO.01)分枝数和直径的比较见上表，2个品系藻体分枝数和直径的比较。与野生型龙须菜相比，07-2分枝数增加，藻枝直径增大。07-2比野生型龙须菜分枝数增多了约36%,t-检验结果表明存在显著差异(PSO.01)。07-2与野生型龙须菜相比直径增大约50%。t-检验结果表明存在显著差异(p^O.01)。实施例52个品系高温胁迫条件下游离脯氨酸含量的比较野生型龙须菜和07-2分别称取鲜重2.5g的藻体，置于500ml的三角瓶中加入300ml培养基，在30。C的光照培养箱中培养，连续四天测其含量。Pro含量的测定采用》黄基水杨酸提取法；称取0.5g待测藻林，加5mL3%磺基水杨酸沸水浴浸提10min，酸性茚三酮染色，曱苯萃取后520nm处比色。图5表示了07-2和野生型龙须菜在30°C高温胁迫条件下脯氨酸含量随着时间的变化情况。由图6可以看出，在高温胁迫下龙须菜藻体内的脯氨酸含量都发生了显著的变化，前3天内逐渐升高，第4天突然回落。常温下07-2和野生型龙须菜体内脯氨酸含量为11.17±0.51和5.24±0.47,t-test结果表明不存在显著差异(p〉0.05)。高温胁迫后二者含量变化明显，第3天二者体内脯氨酸含量为23.28±0.20和16.88±0.40，t-test结果表明存在显著差异(p<0.05)。在高温胁迫条件下培养3天时，07-2体内的含量比初始值提高了约108%,明显高于野生型龙须菜(p<0.05);当培养时间到3天后，脯氨酸含量急剧下降，但07-2的含量仍明显高于野生型龙须菜。实施例62个品系oc-半乳糖苦酶活性的比较野生型龙须菜和07-2分别在10°C、15°C、20°C、25°C、30°C的光照恒温培养箱中培养3天后测酶活。鉴于酶活性在1天之内有明显的改变，所以实-验都要在每天相同时刻测定。准确称取0.3g待测藻才朱。液氮研磨力口《爰冲液(50mmol/LGly—NaOH，0.1%(v/v)|3-巯基乙醇，pH8.25)。4。C离心，取上清进行活性分析。蛋白质浓度测定参照Bradford的方法。以牛血清白蛋白作为标准。一个酶活单位(U)定义为在上述条件下lmin内催化liamol底物或生成1jlimol产物的酶量。酶的活性用酶的比活表示，即U/mg蛋白。图6表示07-2和野生型龙须菜分别在10°C、15°C、20°C、25。C、30。C条件下07-2和野生型龙须菜中oc-半乳糖苷酶活性比较。由图6看出，在1020。C之间，a-半乳糖苷酶活性变化呈下降趋势；20~3(TC则呈现显著上升趋势。从整体变化上看，07-2体内酶的活性要高于野生型龙须菜。对于07-2来说，在20~25。C下酶活有一个显著提高的过程(p<0.05)，与20。C相比，提高了47%。在25~30°C下，酶活趋于稳定。实施例7广东汕头南澳养殖区的生长状况为了验证07-2的优良性状能否在大规模栽培中得到表现，从2007年12月份开始在广东汕头南澳岛首先进行了栽培试验。2007年12月26曰由青岛空运种苗到汕头，先在海水池里暂养，的优良性状，将青岛养殖区的野生型龙须菜和07-2在同等条件下栽培。2008年2月21日下海，对照野生型龙须菜16绳，07-219绳(苗绳长5米，每绳加藻4米重约50克)。取两种龙须菜各4绳(重约200克)，每周称重一次，连续测六周，按照下列公式进行计算龙须菜的日平均生长速率(SpecificGrowthRate,SGR):SGR(%)/d=(lnWn-lnW0)/nxi00%式中Wn为第n天的藻体重量(g);WO——初始夹苗量(g)经过42天的栽培时间，07-2的平均藻体重量为1007.0g，野生型龙须菜的平均藻体重量为954.7g。经过方差分析，2个品系的藻体重量的增长差异程度显著(P<0.05)。07-2移植到南澳岛14天后已增重60%，栽培42天后，总增重比达到5倍。而野生型龙须菜在14天后仅增重40%,42天后总增重比仅为3.5倍，如下表所示，2个龙须菜品系平均藻体重量的比较栽培天数07-2野生型龙须菜(天)藻体重量(g)藻体重量(g)0200.0200.07281.7±16.0269.0±6.614370.1±25.2330.7±23.821474.3±34.7416.0±29.028608.9±40.1540.2±45.635936.1±114.1682.2±94.6421077.0±104.7749.7±114.1112个龙须菜品系的藻体日平均生长速率的变化如图7所示。07-2的日平均生长速率为4.09H，野生型龙须菜的藻体日平均生长速率为3.20%。实施例8山东荣城养殖区的生长状况为了进一步验证07-2的优良性状能否在大规模栽培中得到表现，从2008年7月开始在山东荣城再次进行了栽培试—验。2008年7月由汕头空运种苗(野生型龙须菜和07-2)到荣城，先在海水池里暂养。2008年8月25日进行分苗，取两种龙须菜各10绳(重约200克)，每10天称重一次，连续测四次，计算日平均生长速率(计算方法同实施例7)。2个品系的起始重量都是200g,经过40天的栽培时间，野生型龙须菜的平均藻体重量为4549g，07-2的平均藻体重量为7721g，比野生型龙须菜高69.7%。图8表示07-2和野生型龙须菜日平均生长速率的变化曲线，其中07-2的日平均生长速率为6.21%,野生型龙须菜的日平均生长速率为4.11%,经方差分析，差异显著(P<0.05)。实施例92个品系琼胶特性比较取上述2个龙须菜品系的鲜藻，晒干后，按照纪明侯的方法分别对龙须菜品系的琼胶含量和凝胶强度等特性进行测定。07-2和野生型龙须菜的琼"交含量分别为20.6%和18.0%，琼^交的凝胶强度分别为1260g/cm2和1100g/cm2，07-2的琼胶呈现澄清，而野生型龙须菜的琼胶呈现淡黄色，如下表所示，2个龙须菜品系的琼胶特性比较。07-2的琼胶含量比野生型龙须菜提高14.4%,凝胶强度也提高了14.5%。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。权利要求1、一种耐高温龙须菜优良品系诱变选育方法，其特征在于所述方法包括下述步骤a、MNNG诱变将龙须菜的藻丝放入MNNG处理液中浸泡，对龙须菜进行诱变，所述MNNG为N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍；b、HYP抗性系筛选将上述经诱变筛选后的龙须菜的藻丝放入含HYP的f/2培养基中进行高温培养，筛选出所需要的耐高温龙须菜的藻丝，所述HYP为L-羟脯氨酸。2、根据权利要求1所述的诱变选育方法，其特征在于所述浸泡时间为10~60min。3、根据权利要求1所述的诱变选育方法，其特征在于所述MNNG处理液的浓度为25~40mg/L。4、根据权利要求1所述的诱变选育方法，其特征在于所述f/2培养基中HYP的浓度为0.01~3mmol/L。5、根据权利要求1所述的诱变选育方法，其特征在于所述高温为30~45°C。6、根据权利要求5所述的诱变选育方法，其特征在于所述高温优选范围为31~33°C。7、根据权利要求1所述的诱变选育方法，其特征在于在进行匪NG诱变筛选之前可以对龙须菜的藻丝进行预培养，所述预培养是采用f/2培养基，培养温度为16~30°C，光强40-60mol/m2s,光暗周期12L:12D，每周更换一次培养基，然后再进行MNNG诱变。8、根据权利要求7所述的诱变选育方法，其特征在于所述培养温度优选为20~25°C。9、根据权利要求1所述的诱变选育方法，其特征在于所选用的龙须菜的藻丝是龙须菜的茎尖部分，所述茎尖部分的长度为20~5Omm。10、根据权利要求1所述的诱变选育方法，其特征在于所述HYP抗性系筛选步骤中的培养时间为3~14天。全文摘要本发明提供了一种耐高温龙须菜优良品系诱变选育方法，可以解决现有技术存在的野生型龙须菜的耐高温性能差、生长速率慢和含胶量较低的问题。所述诱变选育方法包括下述步骤a.MNNG诱变将龙须菜的藻丝放入MNNG处理液中浸泡，进行诱变；b.HYP抗性系筛选将上述经诱变的龙须菜的藻丝放入含HYP的f/2培养基中进行高温培养，筛选出所需耐高温藻株。本发明得到的龙须菜品种不但耐高温，而且生长速率快，其含胶量也比较高，为龙须菜栽培提供了新品系，对于促进琼胶制造业的发展也有重要意义。文档编号A01H1/04GK101564004SQ200910013758公开日2009年10月28日申请日期2009年1月8日优先权日2009年1月8日发明者琳孟,张学成,涤徐,臧晓南申请人:中国海洋大学