龙须菜试剂级r-型藻红蛋白的高效分离纯化方法
【专利摘要】本发明属于海洋天然活性物质制备技术，具体的说是一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法。将粉碎的原料大型经济海洋红藻龙须菜加入其10-30体积的PBS缓冲液中浸泡，浸泡后以9000rpm/min-15000rpm/min离心20-30min，收集上清液进行浓缩；浓缩液经硫酸铵进行分级盐析，收集沉淀并用PBS缓冲液溶解，溶解后进行透析24--48小时；所得透析液经强阴离子Source-15Q层析柱纯化，以含NaCl的PBS缓冲液作为洗脱液，流速0.5ml/min,收集第360min-510min的洗脱液，即为纯度大于5.0的R-型藻红蛋白溶液。采用本发明方法得到的蛋白回收率高，纯化效果好，易于放大，上样量大等特点实现了对藻红蛋白高效分离纯化。
【专利说明】龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于海洋天然活性物质制备技术，具体的说是一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法。
【背景技术】
[0002]藻胆蛋白(phycobiliprotein, PBP)是除叶绿素a外的另一类光合色素蛋白，存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中。根据藻胆蛋白紫外吸收光谱的特点藻胆蛋白可以分为三类:藻蓝蛋白(phycocyanin, PC, λ max610_620nm)，别藻蓝蛋白(allophycocyanin, APC, λ max650-655nm)和藻红蛋白(phycoerythrin, PE, λ max540-570nm);通常藻红蛋白根据来源和光谱特性的不同又可分为B-藻红蛋白，R-藻红蛋白和C-藻红蛋白。藻红蛋白是由脱辅基蛋白和以四毗咯为基本结构的几种色基组成，其蛋白部分是一类寡聚蛋白，基本构建单位是α和β亚基，在藻红蛋白中还存在少量的Y亚基。在光合作用中作为捕光色素系统进行吸收和传递能量，在藻体细胞中还作为储存蛋白能够使藻类在氮源缺乏的季节得以生存。
[0003]藻红蛋白作为一种水溶性的色素蛋白，用途极为广泛。由于合成的着色剂具有毒性和致癌等不安全因素，藻胆蛋白做为天然色素可以广泛应用于食品工业(糖果，口香糖，冰激凌，乳制品，软饮料，芥末酱等)，在亚洲一些国家藻红蛋白被用于化妆品行业(眼脸膏，眼线膏，口红)。藻红蛋白具有吸收系数大，荧光量子产率高，斯托克位移宽，稳定性强等特性常做为荧光试剂应用于生物医学分析(流式细胞仪，荧光活细胞分选，荧光免疫分析，荧光显微镜等);同时它还是一种重要的生理活性物质，如抗氧化，抗肿瘤，抗病毒，提高人体免疫力等，可制成食品和药品用于医疗保健上；此外，藻胆蛋白也是一种最具有开发潜力的光敏剂，可介导肿瘤光动力学治疗等。现已有公司在从事与藻胆蛋白相关的生产，在2008年时，Sekar和Chandramohan两家公司就已经有了 297项与藻胆蛋白有关的专利。
[0004]藻红蛋白在不同领域应用时对其纯度(Αλ_ / A280)要求不同，一般纯度大于0.7是食品级，大于3.0是医药级,大于3.9是反应级,试剂级大于4.0。藻胆蛋白在不同领域中应用时，因其纯度要求不同，所以藻胆蛋白的价格也不尽相同。Cyanotech公司生产的R-藻红蛋白价格$ 3.25-14/mg, Martek公司生产的山羊抗鼠IgG:R-藻红蛋白的价格高达$ 165/mg。
[0005]红藻作为提取藻红蛋白的主要原材料，在我国也有广泛的种植。自2000年，张学成教授等选育的国家水产新品种“龙须菜良种981”在广东汕头南澳岛示范栽培获得成功以来，龙须菜栽培面积不断扩大，目前南澳龙须菜养殖形成规模化，平均亩产达到3.5吨，养殖周期从原产地春秋两季各45天延长至5个月以上。全国龙须菜的栽培面积超过20万亩，年产量15万吨干品，成为继海带和紫菜之后第三大海藻栽培业，这为大规模分离纯化藻红蛋白提供了可能。
[0006]一般藻红蛋白分离纯化是通过数次的羟基磷灰石柱层析结合离子交换层析或凝胶过滤层析来进行，以往的提纯方法在实际工业化生产过程中存在操作步骤复杂，动力能耗高以及操作周期长等缺点；据文献报道，分离纯化的成本占产品成本的50-90%，此外，由于步骤过多而导致产量损失大，通常每增加一步层析过程目标蛋白就会减少20%，这对工业化生产来说成本无疑是十分昂贵的。因此，一种高效，经济，易于放大的分离纯化方法对于生产高纯度和高回收率的藻红蛋白来说是十分必要的。
【发明内容】
[0007]本发明目的在于一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法。
[0008]为实现上述目的本发明采用的技术方案为:
[0009]一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，将粉碎的原料大型经济海洋红藻龙须菜加入其10-30体积的PBS缓冲液中浸泡，浸泡后以9000rpm/min-15000rpm/min离心20-30min,收集上清液进行浓缩；浓缩液经硫酸铵进行分级盐析，收集沉淀并用PBS缓冲液溶解，溶解后进行透析24-48小时；所得透析液经强阴离子SourCe-15Q层析柱纯化，以含不同浓度NaCl的PBS缓冲液作为洗脱液进行梯度洗脱，流速0.5ml/min,收集器每管收集1min,收集第360min-510min的洗脱液，即为纯度大于5.0的R-型藻红蛋白溶液。
[0010]所述原料大型经济海洋红藻龙须菜。
[0011]将原料大型经济海洋红藻龙须菜粉碎至粒径0.l-ο.5mm，粉碎后加入至其10-30体积的PBS缓冲液中，在4°C下，浸提24-48小时，浸提液再于4_8°C，以9000rpm/min-15000rpm/min条件下离心20—30min,离心后上清过滤,滤液用50kd的浓缩板浓缩,待用。
[0012]所述PBS 缓冲液为 50-100mM/L PBS 缓冲液 ρΗ6.0—7.0。
[0013]所述浓缩液中加入硫酸铵使其饱和度达到25-35%，并静置12-15个小时，静置后于4°C, 12000rpm/min-15000rpm/min条件下离心20_30min,收集上清；上清液中再加入硫酸铵使其饱和度达到45-60%，静置6—12小时，而后于4°C，12000rpm/min-15000rpm/min条件下离心20—30min,收集沉淀,待用。
[0014]所述洗脱液为0-0.6M NaCl 的 lmM/L-25mM/L，pH6.0-7.0PBS 缓冲液。
[0015]所述强阴离子Source-15Q层析柱规格1.6 X 20cm,柱床高度6_8cm,平衡和洗脱的流速均为0.5-1.0ml/min，洗脱总体积为400-500ml。
[0016]本发明所具有的优点:本发明提供的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法操作简单，回收率高,纯度高并达到试剂级要求,大大降低了生产成本,为试剂级R-型藻红蛋白应用于医学检测，生物技术等领域奠定了基础，同时本发明所得纯化的R-藻红蛋白吸收光谱吸收峰分别为499nm，540nm，566nm，A566/A280达到5.0以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为本发明实施例提供的纯化后的藻红蛋白的光谱图。
[0018]图2为本发明实施例提供的纯化后藻红蛋白的Native-PAGE电泳图。
【具体实施方式】
[0019]实施例1
[0020](I)将大型经济海洋红藻龙须菜用去离子水清洗干净；
[0021](2) R-藻红蛋白的粗提:把龙须菜超微破碎到粒径0.1-0.5mm，粉碎后加入其10倍体积的PH7.0浓度为50mM/L的PBS缓冲液中，4°C下，浸提48小时，浸提液再在4°C，15000rpm/min条件下离心30min,离心后上清过滤,滤液用50kd的浓缩板浓缩；
[0022](3) R-型藻红蛋白的初步纯化:向步骤(2)所获得的藻红蛋白粗提液中加入固体硫酸铵后使其饱和度达到25%，而后静置12小时，静置后在4°C，15000rpm/min条件下离心30min,收集上清，之后在上清中再加入硫酸铵使其饱和度达到45%，静置24-48小时在4°C，15000rpm/min条件下离心30min，收集沉淀并用pH7.0浓度为25mM/L的PBS缓冲液溶解，然后用3kd的透析袋进行透析48小时；
[0023](4)试剂级R-型藻红蛋白制备:将步骤(3)透析所得的蛋白溶液过强阴离子Source-15Q层析柱,色谱柱规格1.6X 20cm,柱床高度6cm,平衡流速为0.5ml/min,平衡层析柱采用的平衡液为PH7.0，25mM/L的PBS缓冲液；洗脱时，洗脱液总体积为500ml，用PH7.0，离子强度为0—0.6M NaCl的PBS缓冲液，以0.5ml/min的流速进行梯度洗脱，收集器每管收集1min,收集第360min-510min的洗脱液，即为收集纯度大于5.0的R-型藻红蛋白溶液(参见图1和图2)。
[0024]由图1的纯化的R-藻红蛋白吸收光谱可见，吸收峰分别为499nm，540nm，566nm，A566/A280达到5.0以上，回收率为66%，表明其已达到试剂级。用499nm激发，荧光发射峰位于578nm。上述纯化的试剂级R-藻红蛋白的Native-PAGE电泳图见图2，只有一个条带近，进一步说明获得的R-藻红蛋白没有受其他蛋白污染达到了电泳纯。
[0025]实施例2
[0026](I)将大型经济海洋红藻龙须菜用去离子水清洗干净；
[0027](2) R-藻红蛋白的粗提:把龙须菜超微破碎到粒径0.1-0.5mm，粉碎后加入其30倍体积的PH6.0浓度为50mM/L的PBS缓冲液中，4°C下，浸提24小时，浸提液再在4°C，9000rpm/min条件下离心20min,离心后上清过滤,滤液用50kd的浓缩板浓缩；
[0028](3) R-型藻红蛋白的初步纯化:向步骤(2)所获得的藻红蛋白粗提液中加入固体硫酸铵后使其饱和度达到25%，而后静置12小时，静置后在4°C，12000rpm/min条件下离心20min，收集上清，之后在上清中再加入硫酸铵使其饱和度达到45%，静置6小时在4°C，12000rpm/min条件下离心20min，收集沉淀并用pH6.0浓度为25mM/L的PBS缓冲液溶解，然后用3kd的透析袋进行透析24小时；
[0029](4)试剂级R-型藻红蛋白制备:将步骤(3)透析所得的蛋白溶液过强阴离子Source-15Q层析柱,色谱柱规格1.6 X 20cm,柱床高度8cm,平衡流速为1.0ml/min,平衡层析柱采用的溶液为PH6.0，25mM/L的PBS缓冲液；洗脱时，洗脱液总体积为500ml，用pH6.0，离子强度为0—0.6M NaCl的PBS缓冲液，以0.5ml/min的流速进行梯度洗脱，收集器每管收集1min,收集第360min-510min的洗脱液，即为收集纯度大于5.0的R-型藻红蛋白溶液(参见图1和图2)。
[0030]由图1的纯化的R-藻红蛋白吸收光谱可见，吸收峰分别为499nm，540nm，566nm，A566/A280达到5.0以上，表明已达到试剂级。用499nm激发，荧光发射峰位于578nm。上述纯化的试剂级R-藻红蛋白的Native-PAGE电泳图见图2，只有一个条带近,进一步说明获得的R-藻红蛋白没有受其他蛋白污染达到了电泳纯。
【权利要求】
1.一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于:将粉碎的原料大型经济海洋红藻龙须菜加入其10-30体积的PBS缓冲液中浸泡，浸泡后以9000rpm/min-15000rpm/min离心20_30min,收集上清液进行浓缩；浓缩液经硫酸铵进行分级盐析，收集沉淀并用PBS缓冲液溶解，溶解后进行透析24-48小时；所得透析液经强阴离子Source-15Q层析柱纯化，以含不同浓度NaCl的PBS缓冲液作为洗脱液进行梯度洗脱，流速0.5ml/min,收集第360min-510min的洗脱液，即为纯度大于5.0的R-型藻红蛋白溶液。
2.按权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于:所述原料大型经济海洋红藻龙须菜。
3.按权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于:将原料大型经济海洋红藻龙须菜粉碎至粒径0.1-0.5_，粉碎后加入至其10-30体积的PBS缓冲液中，在4°C下，浸提24-48小时，浸提液再于4_8°C，以9000rpm/min-15000rpm/min条件下离心20—30min，离心后上清过滤，滤液用50kd的浓缩板浓缩，待用。
4.按权利要求1或3所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于:所述PBS缓冲液为50-100mM/L PBS缓冲液pH6.0-7.0。
5.按权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于:所述浓缩液中加入硫酸铵使其饱和度达到25-35%，并静置12-15个小时，静置后于4°C，12000rpm/min-15000rpm/min条件下离心20-30min,收集上清；上清液中再加入硫酸铵使其饱和度达到45-60%，静置6-12小时，而后于4°C，12000rpm/min-15000rpm/min条件下离心20-30min，收集沉淀，待用。
6.按权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于:所述洗脱液为 0-0.6M NaCl 的 lmM/L-25mM/L，pH6.0-7.0PBS 缓冲液。
7.按权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于:所述强阴离子Source-15Q层析柱规格1.6 X 20cm,柱床高度6_8cm,平衡和洗脱的流速均为0.5-1.0ml/min,洗脱总体积为400-500ml。
【文档编号】C07K14/405GK104292316SQ201310306723
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月19日 优先权日:2013年7月19日
【发明者】刘冰, 杜虹, 谷洋洋, 秦松, 陈洁辉 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所, 汕头大学