专利名称：一种具有免疫调节作用的龙须菜纯多糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及天然植物活性多糖的提取分离技术领域，具体地说涉及一种龙须 菜纯多糖的制备方法。
背景技术：
龙须菜(Grac!7a〃a /e附a"e!/ow /i;)是江蓠属(Gracilaria Greville )的一种温 带性红藻。原产于我国山东省沿海和日本冲绳岛，近年来在广东、福建等省实现 规模化养殖，产量逐年增加。龙须菜其主要用途是作为琼胶生产的原料，也可做 为鲍鱼饲料及绿色食品开发，另外龙须菜的栽培有利于改善沿海海水水质，具有 环境修复作用。但有关龙须菜深加工方面的研究很少。目前国外未见有关龙须菜生物活性方 面的研究报道，国内也只有少数学者对龙须菜多糖的生物活性进行了初步研究， 研究发现其具有抗突变、抗肿瘤、清除自由基和抗氧化作用。有关龙须菜多糖调 节免疫活性方面的研究，中国专利CN101100488A正在公示一种在较高温度下提 取龙须菜活性多糖的方法。该方法虽获得对小鼠^^巴细胞具有较高增殖效果的龙 须菜多糖，但提取的多糖并非纯品多糖，不利于明确活性成分和进一步研究作用 途径。发明内容本发明提供一种具有免疫调节作用的龙须菜纯多糖的制备方法。 本发明采取的技术方案采用由一种具有免疫调节作用的龙须菜纯多糖的制 备方法，其方案是包括如下步骤1)、原料处理，2)、多糖提取，3)、超滤分级，4)、离子柱层析，5)、凝胶柱层 析，6)、成品收集。实施本发明后的积极效果是本发明提取了龙须菜纯品多糖，不仅可提供市场需要，还为深入研究龙须菜 纯多糖其在抗突变、抗肿瘤、清除自由基和抗氧化作用，以及调节免疫活性方面
机理的研究创造了条件。
图1为龙须菜纯多糖制备流程2为制备的龙须菜纯多糖HPSEC层析结果图具体实施方式
现结合附图对本发明作进一步说明一种具有免疫调节作用的龙须菜纯多糖的制备方法，包括如下步骤1) 、原料处理龙须菜干品粉碎后，留下过60目筛的龙须菜干品粉，4'C保存备用；2) 、多糖提取龙须菜藻粉以水重复提取3次，具体方法以1:20-50重量比加入蒸馏水， 每小时搅拌l次，在20-28'C室温下，提取12h，提取液4000r/min (或6层纱布 过滤后再滤纸抽率)分离残渣。最后合并提取液。3) 、超滤分级提取液经截留分子量为IO万的膜超滤，截留液减压浓縮、-20汇保存；4) 、离子柱层析截留液经DEAE-Sepharose Fast Flow (琼脂糖凝胶)离子交换柱层析(2.6 X100cm)，先用蒸馏水洗脱，再用NaCl梯度洗脱，最大浓度2.0mol/L;收集样 品峰，用截留分子量为8，000-12，000 Da透析袋，蒸馏水透析3-5天，-20'(:保存；5) 、凝胶柱层析取离子柱下来的样品，进行凝胶柱Sephacryl S500 (丙烯葡聚糖凝胶)分离 (1.6x100 cm);流动相为0.2mol/L亚硝酸纳，流速0.5 mL/min, 5mL/管收集， 示差折光检测器检测并收集样品峰；6) 、成品收集浓縮后，蒸馏水透析3-5天，冷冻干燥收集，即为龙须菜纯多糖。实施例1 ①、原料处理龙须菜干品粉碎后留下过60目筛的龙须菜干品粉，4'C保存备用。
②、多糖提取称取龙须菜藻粉5Kg，以重量比l:20加入蒸馏水，每小时搅拌1次，室温 下提取12h，提取液4000r/min离心10min (或6层纱布过滤后再滤纸抽率)分 离残渣，残渣再重复提取2次，合并提取液。 ◎、超滤分级提取液经截留分子量为IO万的膜超滤，截留液减压浓缩、-20'0:保存。
、离子柱层析制备浓度为8-10mg/ml截留液。经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱 层析(2.6X100cm)，先用蒸馏水洗脱，再用NaCl梯度洗脱，最大浓度2.0mol/L， 上样量8mg/ml，共48ml。 60min后开始收集，15ml /管，样品峰2-20管，浓 縮后，用截留分子量为8-12kD透析袋，蒸馏水透析3-5天，-20'0保存。 ⑤、凝胶柱层析取离子柱下来的样品，配置成浓度15-20mg/mL溶液，进行凝胶柱Sephacryl S500分离(1.6x100 cm)。上样量0.4mL,流动相为0.2mol/L亚硝酸纳，流速 0.5mL/min， 5mL/管收集，示差折光检测器检测。收集19-29管，浓縮后，蒸馏 水透析3-5天，冷冻干燥收集样品，即为龙须菜多糖纯品GCpF2-lB。实施例2 纯度鉴定高效渗透色谱层析(HPSEC)配置测试样品2mg/mL， 10000 rpm离心10 min，取上清20nL上样，记录 洗脱曲线。HPSEC的具体测试条件如下Waters高效液相色谱系统(2695 HPLC Pump， In-line Degasser, 2414 Refractive Index Detector与2487 DualXAbsorbance Detector平行检测，TSK PWXL 4000-3000串联柱)，流动相为pH为7.0的0.1 mol/LNaH2P03和0.3 mol/LNaN03。流速为0.2 mL/min，柱温30i0.1'C。(见图 2)实施例3GCpF2-lB生物活性检测颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下取脾，置于100目灭菌不锈钢筛网上，用注 射器内塞将脾研碎，过筛，用PBS冲洗网筛2-3遍，脾细胞的悬液转入无菌的
离心管中，再加入PBS至30-40ml,400g离心6min,收集细胞，在室温下加NH4Cl 溶液(1.5ml/只)，不断枪打或摇晃混匀细胞10分钟，以裂解红细胞，力卩PBS至 30-40ml, 400G离心5分钟，去上清，加入少量RPMI1640培养基细胞计数仪计 数后，用RPMI1640稀释细胞悬液至2xl()S个/ml。取 180 pl细胞悬浮液加至 96孔板中，分别加入20 nl的不同的样品和阳性对照植物血凝素，阴性对照PBS。 在37°C和5% C02的条件下培养3天后，用ELISA自动读板仪分别测定570 nm 和600 nm的吸光度，加入20 pi Alamar Blue显色剂，培养6-8小时，再次测定 570 nm和600 nm的吸光度，然后根据Alamer Blue Assay给的公式计算各样品 对淋巴细胞的激活率。淋巴细胞增殖率(％)=[117216 X Aj70(s咖ple)-80586 X Ax600(sample)〗 /[117216X Ak570(control)-80586X Ax600(contro1)] X 100%; 实验结果显示，在低浓度(50pg/ml)时，增值率为152%:当浓度增加到 200pg/ml增值率达到185%;继续增加浓度至500ng/ml时，增值率达到227%(阳 性对照60ng/ml植物凝聚素增值率207%)。表明GCpF2-lB具有较高的刺激淋巴 细胞增殖作用，且呈现剂量依赖性。
权利要求
1，一种具有免疫调节作用的龙须菜纯多糖的制备方法，其特征是包括如下步骤1)、原料处理龙须菜干品粉碎后，留下过60目筛的龙须菜干品粉，4℃保存备用；2)、多糖提取龙须菜藻粉以水重复提取3次，具体方法以1∶20-50重量比加入蒸馏水，每小时搅拌1次，在20-28℃室温下，提取12h，提取液4000r/min离心分离残渣；最后合并提取液；3)、超滤分级提取液经截留分子量为10万的膜超滤，截留液减压浓缩、-20℃保存；4)、离子柱层析截留液经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析，先用蒸馏水洗脱，再用NaCl梯度洗脱，最大浓度2.0mol/L；收集样品峰，用截留分子量为8,000-12,000Da透析袋，蒸馏水透析3-5天，-20℃保存；5)、凝胶柱层析取离子柱下来的样品，进行凝胶柱Sephacryl S500分离；流动相为0.2mol/L亚硝酸纳，流速0.5mL/min，5mL/管收集，示差折光检测器检测并收集样品峰；6)、成品收集浓缩后，蒸馏水透析3-5天，冷冻干燥收集，即为龙须菜纯多糖。
全文摘要
一种具有免疫调节作用的龙须菜纯多糖的制备方法，本发明涉及天然植物活性多糖的提取分离技术领域，具体地说涉及一种龙须菜纯多糖的制备方法。其特点是包括如下步骤1)原料处理，2)多糖提取，3)超滤分级，4)离子柱层析，5)凝胶柱层析，6)成品收集。实施本发明后的积极效果是本发明提取了龙须菜纯品多糖，不仅可提供市场需要，还为深入研究龙须菜纯多糖其在抗突变、抗肿瘤、清除自由基和抗氧化作用，以及调节免疫活性方面机理的研究创造了条件。
文档编号A61P37/02GK101397346SQ20081004298
公开日2009年4月1日 申请日期2008年9月17日 优先权日2008年9月17日
发明者唐庆九, 孙晓红, 宫春宇, 张劲松, 潘迎捷, 勇 赵 申请人:上海海洋大学