人notch受体突变及其应用的制作方法

人notch受体突变及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供对与增强的受体信号传导相关的NOTCH突变的鉴定和表征。本发明提供使用其的方法和试剂盒。本发明还提供治疗具有实体瘤的患者的癌症的方法，其中所述实体瘤细胞包含水平升高的NOTCH?ICD。
【专利说明】人NOTCH受体突变及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤学领域，提供了对包含导致受体信号传导增加的突变的NOTCH受 体的鉴定和表征。本发明还提供使用其的方法和试剂盒。本发明还提供治疗实体瘤患者的 癌的方法，其中所述实体瘤细胞包含水平升高的NOTCH ICD。

【背景技术】
[0002] 癌是发达国家的主要死亡原因之一，仅在美国，每年就有超过一百万人被诊断为 罹患癌症并且有500, 000人死亡。总的来说估计超过三分之一的人会在其一生中发展某种 形式的癌。存在超过200种不同类型的癌，其中4种--乳腺癌、肺癌、结直肠癌和前列腺 癌，超过所有新病例的一半（Jemal等，Cancer J. Clin. 53:5-26 (2003))。逐渐地，对癌的治 疗已经从使用全身性作用的细胞毒性药物转向包括更具靶向性的疗法，所述疗法针对的是 使细胞生长和存活失调的机制。
[0003] NOTCH受体1?4是跨膜受体蛋白，其通过依赖于受调控的蛋白水解的途径 而进行信号传导。在结合配体后，该受体依次：i)被ADAM家族的金属蛋白酶细胞外切 割（Brou 等，Mol. Cell. 5:207-216 (2000) ;Mumm 等 Mol Cell 5:197-206(2000)) ;ii) 在正好位于跨膜结构域内部的赖氨酸残基上发生单泛素化（Gupta-Rossi等，J.Cell Biol. 166:73-83(2004)) ;iii)被胞吞（Gupta-Rossi, 2004);和 iv)被 γ-分泌酶蛋白水 解性切割（De Strooper等，Nature 398:518-522(1999))。该激活过程中的最后一步允许 NOTCH受体的细胞内部分转移到细胞核，在细胞核中，其与转录因子相互作用，从而改变基 因活性。NOTCH受体信号传导在细胞的分化和增殖中和在控制凋亡中起重要作用，这三个过 程对于成瘤性转化而言非常重要。
[0004] NOTCH蛋白的调控性胞外结构域主要由串联排列的为配体结合所需的EGF样重复 组成（Artavanis-Tsakonas 等 Science, 268:225-232 (1995))。在这些 EGF 样重复的羧基 末端，是另外三个富半胱氨酸重复，命名为LIN12/N0TCH重复（LNR)。LNR的下游是被弗林 (furin)样转化酶识别的蛋白水解性切割序列（RXRR)。对于N0TCH1，在该位点处的切割会 产生180kDa的胞外肽和120kDa的胞内肽，它们在细胞表面保持在一起形成异二聚体受体 (Blaumueller 等，Cell 90:281-91 (1997))。
[0005] NOTCH的胞内结构域（NOTCH. I⑶）挽救功能丧失性NOTCH表型，表明该 形式的NOTCH组成性地进行信号传导（Fortini, Μ· E.和S. Artavanis-Tsakonas. Cell75:1245-7(1993))。NOTCH的细胞质结构域含有三个可确认的结构域：RAM结构 域、锚蛋白重复结构域和羧基末端PEST结构域。在配体激活时，NOTCH经历两次额 外的蛋白水解切害!]，这导致细胞质结构域的释放（Weinmaster, G. Curr Opin Genet Dev. 8:436-42 (1998))。该 NOTCH 肽转移至细胞核，并与称为 CSL (CBF, Su (Η)，Lag-2) 的转录阻遏物相互作用，将其转化成转录激活剂。CSL/N0TCH相互作用依赖于NOTCH 的RAM结构域的存在；同时，转录活性还需要锚蛋白重复的存在（Hsieh，J. J.等 J. Virol. 71:1938-45 (1997))。体内和体外研究均表明HES和Hey基因是N0TCH/CSL依赖 性信号传导的直接靶标（Nakagawa 等 Proc Natl Acad Sci USA 97:13655-13660(2000))。 HES和HEY基因是在N-框处结合DNA的bHLH转录阻遏物。还提出NOTCH通过CSL非依赖 性途径进行信号传导。事实上，仅锚蛋白重复结构域的表达对于某些形式的NOTCH信号传 导而言就是充分且必要的（Lieber等Genes Dev. 7:1949-1965(1993))。最后，已提出PEST 结构域与SEL-10/泛素依赖性途径的蛋白质转换有关（Greenwald，I. Current Opinion in Genetics&Development 4:556-62 (1994))。
[0006] 之前已经示出，（7 ;9)易位形成了一种N0TCH-T细胞受体β融合基 因，该基因编码氨基末端缺失的、与ICD类似的具有组成性活性N0TCH-1多肽 (Ellisen 等，Cell66:649-661(1991) ;Aster 等，Cold Spring Harb.Symp.Quant. Biol. 59:125-136(1994))，并且这些截短的组成性活性形式的NOTCH-1在小鼠模型中诱导 T-细胞急性淋巴细胞性白血病（T-ALL) (Aster 等，Mol. Cell. Biol. 20:7505-7515(2000))。 事实上，已在超过50 %的人T-ALL中报道了 N0TCH-1的激活性突变（Weng等，Science 306:269-271 (2004))。已显示，N0TCH-1的HD结构域内的白血病相关突变使得该受体对配 体非依赖性蛋白水解激活变得敏感（Malecki等，Mol. Cell. Biol. 26:4642-4651 (2006))， 而TOST结构域中的突变导致CDC4/FBW7介导的变性减少并使N0TCH-1的细胞内切割形式 稳定（Pancewicz 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:16619-16624(2010))。
[0007] 虽然NOTCH-3和NOTCH-4中的激活性突变尚未在人类癌症中鉴定出，但已 知在其他哺乳动物中这些NOTCH受体的功能的异常增加能够引起T-ALL (N0TCH-2 和-3，Bellavia 等，Embo J. 19:3337-3348(2000) ;Rohn J. Virol. 70:8071-8080(1996); Weng 等，Mol.Cell.Biol.23:655-664))、B 细胞淋巴瘤（N0TCH-2，Lee 等，Cancer Sci.l00:920-926(2009))和乳腺癌（N0TCH-4，Callahan and Rafat，J. Mammary Gland Biol Neoplasia 6:23-36(2001))。
[0008] 鉴定出人实体肿瘤中新突变，在帮助鉴定癌的存在和鉴定对NOTCH信号传导抑制 剂有响应的癌细胞时具有诊断用途，由此可以对用NOTCH信号传导途径抑制剂的合理癌治 疗进行指导。


【发明内容】

[0009] 本发明提供对依赖于异常NOTCH活性来维持不受控生长的癌细胞组的鉴定。在一 些实施方式中，本发明证明这些细胞含有突变的NOTCH受体，并且这些突变可以诊断性地 用于鉴定可能对NOTCH抑制剂疗法或使NOTCH活性减少的其他因子产生响应的癌细胞。 [0010] 因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种编码突变的人N0TCH1受体的分离的多 核苷酸，其中所述多核苷酸包含在人N0TCH1基因的7279位核苷酸处的缺失。在另一实施 方式中，所述突变是在7279位核苷酸处的鸟嘌呤（G)缺失。
[0011] 本发明还涉及一种编码突变的人N0TCH3受体的分离的多核苷酸，其中所述多核 苷酸包含在人N0TCH3基因的6622位的插入。在另一实施方式中，所述突变是在6622位处 的胞嘧啶（C)插入。
[0012] 本发明还涉及一种编码突变的人N0TCH3受体的分离的多核苷酸，其中所述多核 苷酸包含在人N0TCH3基因的6096位的插入。在另一实施方式中，所述突变是在6096位处 的胞嘧啶（C)插入。
[0013] 本发明还涉及一种编码突变的人N0TCH1受体的分离的多核苷酸，其中所述多核 苷酸包含在人N0TCH1基因的6733位的替换。在另一实施方式中，所述突变的多核苷酸包 含在6733位的腺嘌呤（A)或胞嘧啶（C)。在另一实施方式中，所述突变是在6733位的鸟嘌 呤（G)至腺嘌呤（A)替换或鸟嘌呤（G)至胞嘧啶（C)替换。
[0014] 本发明还涉及一种编码突变的人N0TCH1受体的分离的多核苷酸，其中所述多核 苷酸包含在人N0TCH1基因的6788位的替换。在另一实施方式中，所述突变是在6788位替 换为腺嘌呤（A)。在另一实施方式中，所述突变是在6788位的鸟嘌呤（G)至腺嘌呤（A)替 换。
[0015] 在一个实施方式中，本发明涉及由本文所述的突变的NOTCH受体编码的分离的多 肽。在又一实施方式中，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的载体。在一个实施方式中，本 发明涉及用所述载体转化的宿主细胞。
[0016] 在一个实施方式中，本发明涉及一种鉴定展示出增加的NOTCH受体信号传导的实 体瘤细胞的方法，所述方法包括鉴定所述细胞是否在人N0TCH1的富脯氨酸-谷氨酸-丝氨 酸-苏氨酸（PEST)结构域或TAD结构域中含有突变，其中，所述实体瘤细胞选自由以下肿 瘤组成的组：神经胶质瘤、胃肠道肿瘤、肾肿瘤（renal tumor)、卵巢肿瘤、肝肿瘤、结直肠肿 瘤、子宫内膜肿瘤、肾脏肿瘤（kidney tumor)、前列腺肿瘤、甲状腺肿瘤、成神经细胞瘤、胰 腺肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、子宫颈肿瘤、胃肿瘤、膀胱肿瘤、肝细胞瘤、乳腺肿瘤、结肠肿 瘤、黑素瘤、胆道肿瘤以及头颈肿瘤。
[0017] 在另一个实施方式中，本发明涉及一种鉴定展示出增加的NOTCH受体信号传导的 实体瘤细胞的方法，所述方法包括鉴定所述细胞是否在人N0TCH2的PEST结构域或TAD结 构域中含有突变，其中所述实体瘤细胞选自由以下肿瘤组成的组：肺肿瘤、神经胶质瘤、胃 肠道肿瘤、肾肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、结直肠肿瘤、子宫内膜肿瘤、肾脏肿瘤、前列腺肿瘤、 甲状腺肿瘤、成神经细胞瘤、胰腺肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、子宫颈肿瘤、胃肿瘤、膀胱肿 瘤、肝细胞瘤、结肠肿瘤、黑素瘤、胆道肿瘤以及头颈肿瘤。
[0018] 在另一实施方式中，本发明涉及一种鉴定展示出增加的NOTCH受体信号传导的实 体瘤细胞的方法，所述方法包括鉴定所述细胞是否在N0TCH3的PEST结构域或TAD结构域 中含有突变，其中所述实体瘤细胞选自由以下肿瘤组成的组：肺肿瘤、神经胶质瘤、胃肠道 肿瘤、肾肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、结直肠肿瘤、子宫内膜肿瘤、肾脏肿瘤、前列腺肿瘤、甲状 腺肿瘤、成神经细胞瘤、胰腺肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、子宫颈肿瘤、胃肿瘤、膀胱肿瘤、肝 细胞瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤、黑素瘤、胆道肿瘤以及头颈肿瘤。
[0019] 在又一个实施方式中，本发明涉及一种鉴定展示出增加的NOTCH受体信号传导的 实体瘤细胞的方法，所述方法包括鉴定所述细胞是否在N0TCH4的PEST结构域或TAD结构 域中含有突变，其中所述实体瘤细胞选自由以下肿瘤组成的组：肺肿瘤、神经胶质瘤、胃肠 道肿瘤、肾肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、结直肠肿瘤、子宫内膜肿瘤、肾脏肿瘤、前列腺肿瘤、甲 状腺肿瘤、成神经细胞瘤、胰腺肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、子宫颈肿瘤、胃肿瘤、膀胱肿瘤、 肝细胞瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤、黑素瘤、胆道肿瘤以及头颈肿瘤。
[0020] 在一个实施方式中，所述突变是错义、无义或移码突变。在另一实施方式中，所述 突变是PEST结构域的移码或无义突变。在另一实施方式中，所述突变是在人N0TCH1基因 的7279位核苷酸处的缺失。在又一实施方式中，所述突变是在人N0TCH1基因的7279位核 苷酸处的鸟嘌呤（G)缺失（B40突变）。在另一实施方式中，所述突变是在人N0TCH3基因的 6622位的插入。在又一实施方式中，所述突变是在人N0TCH3基因的6622位的胞嘧啶（C) 插入（B37突变）。在另一实施方式中，所述突变是在人N0TCH3基因的6096位的插入。在 又一实施方式中，所述突变是在人NOTCH3基因的6096位的胞嘧啶（C)插入（C31突变）。 在另一实施方式中，所述突变是在人NOTCH1基因的6733位的替换。在又一实施方式中，所 述突变是在人NOTCH1基因的6733位替换为腺嘌呤（A)或胞嘧啶（C)。在又一实施方式中， 所述突变是在人NOTCH1基因的6733位的鸟嘌呤（G)至腺嘌呤（A)替换或鸟嘌呤（G)至胞 嘧啶（C)替换（肺_01246突变）。在另一实施方式中，所述突变是在人NOTCH1基因的6788 位的替换。在又一实施方式中，所述突变是在人NOTCH1基因的6788位替换为腺嘌呤（A)。 在又一实施方式中，所述突变是在人NOTCH1基因的6788位的鸟嘌呤（G)至腺嘌呤（A)替 换（乳腺_H12932T突变）。
[0021] 在一个实施方式中，使用抗NOTCH抗体或使用在严格条件下与突变NOTCH多核苷 酸杂交的核酸探针来确定突变的存在。在另一实施方式中，所述抗体或核酸探针带有可检 测的标记。在另一实施方式中，所述标记选自由免疫突光标记、化学发光标记、磷光标记、酶 标记、放射性标记、抗生物素蛋白/生物素、胶体金颗粒、有色颗粒和磁性颗粒组成的组。在 另一实施方式中，通过放射性免疫测定、蛋白质印迹测定、免疫荧光测定、酶免疫测定、免疫 沉淀测定、化学发光测定、免疫组织化学测定、斑点印迹测定、狭缝印迹测定或流式细胞术 测定来确定所述突变的存在。在另一实施方式中，通过RT-PCR来确定所述突变的存在。在 又一实施方式中，通过微阵列来确定所述突变的存在。在再一实施方式中，通过核酸测序来 确定所述突变的存在。
[0022] 本发明还涉及一种对癌症患者群体进行分阶（stratify)以用NOTCH抑制剂进行 治疗的方法，所述方法包括：(a)确定来自所述患者的肿瘤细胞是否含有人NOTCH受体的 PEST结构域的激活性突变，和（b)基于突变的存在或不存在将所述患者群体分阶。
[0023] 本发明还涉及一种选择患者以用NOTCH抑制剂进行治疗的方法，所述方法包括： (a) 确定来自所述患者的肿瘤细胞是否含有人NOTCH受体的PEST结构域的激活性突变，和 (b) 选择出其肿瘤细胞含有所述突变的患者。
[0024] 本发明还涉及一种确定被诊断为患有癌症的患者是否可能对基于NOTCH抑制剂 的治疗产生响应的方法，所述方法包括确定来自所述患者的肿瘤细胞是否含有人NOTCH受 体的PEST结构域的激活性突变的步骤，其中所述突变的存在表明所述患者可能对治疗产 生响应。
[0025] 本发明还涉及一种确定被诊断为患有癌症的患者是否应该施用NOTCH抑制剂的 方法，所述方法包括确定来自所述患者的肿瘤细胞是否含有人NOTCH受体的PEST结构域的 激活性突变，其中所述突变的存在预示着所述患者对NOTCH抑制剂治疗具有有利的响应。
[0026] 本发明还涉及一种确定被诊断为患有癌症的患者是否应该继续用NOTCH抑制剂 进行治疗的方法，所述方法包括确定来自所述患者的肿瘤细胞是否含有人NOTCH受体的 PEST结构域的激活性突变，其中任一突变的存在表明所述患者可能对治疗产生响应，其中 所述突变的存在预示着所述患者对NOTCH抑制剂治疗具有有利的响应。
[0027] 本发明还涉及一种确定用于治疗患者癌症的NOTCH抑制剂的治疗功效的方法，所 述方法包括确定来自所述患者的肿瘤细胞是否含有人NOTCH受体的PEST结构域的激活性 突变，其中所述突变的存在表明所述NOTCH抑制剂具有治疗功效。
[0028] 在一个实施方式中，所述患者是人。在一个实施方式中，所述突变增加 NOTCH信号 传导。在另一实施方式中，来自患者的肿瘤细胞中的至少约〇. 1%、至少约1%、至少约2% 或至少约5%包含所述突变。在另一实施方式中，所述勵了01受体是勵了011或勵了013。在 另一实施方式中，所述突变是错义、无义或移码突变。在又一实施方式中，所述突变是PEST 结构域的移码或无义突变。在另一实施方式中，所述突变是在人N0TCH1基因的7279位核 苷酸处的缺失。在另一实施方式中，所述突变是在人N0TCH1基因的7279位核苷酸处的鸟 嘌呤（G)缺失（B40突变）。在另一实施方式中，所述突变是在人N0TCH3基因的6622位的 插入。在另一实施方式中，所述突变是在人N0TCH3基因的6622位的胞嘧啶（C)插入（B37 突变）。在另一实施方式中，所述突变是在人N0TCH3基因的6096位的插入。在又一实施方 式中，所述突变是在人N0TCH3基因的6096位的胞嘧啶（C)插入（C31突变）。在另一实施 方式中，所述突变是在人N0TCH1基因的6733位的替换。在又一实施方式中，所述突变是在 人N0TCH1基因的6733位替换为腺嘌呤（A)或胞嘧啶（C)。在又一实施方式中，所述突变 是在人N0TCH1基因的6733位的鸟嘌呤（G)至腺嘌呤（A)替换或鸟嘌呤（G)至胞嘧啶（C) 替换（肺_〇1246突变）。在另一实施方式中，所述突变是在人N0TCH1基因的6788位的替 换。在又一实施方式中，所述突变是在人N0TCH1基因的6788位替换为腺嘌呤（A)。在又一 实施方式中，所述突变是在人N0TCH1基因的6788位的鸟嘌呤（G)至腺嘌呤（A)替换（乳 腺 _H12932T 突变）。
[0029] 在一个实施方式中，所述方法还包括从所述患者获得身体样品。在另一实施方式 中，所述样品是全血、血浆、血清或组织。在另一实施方式中，所述癌选自由以下组成的组： 肺癌、胃肠道癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾脏癌、前列腺癌、甲状腺癌、 成神经细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、子宫颈癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、黑 素瘤、胆道癌以及头颈癌。
[0030] 在一个实施方式中，使用抗NOTCH抗体或使用在严格条件下与突变NOTCH多核苷 酸杂交的核酸探针来确定突变的存在。在另一实施方式中，所述抗体或核酸探针带有可检 测的标记。在另一实施方式中，所述标记选自由免疫突光标记、化学发光标记、磷光标记、酶 标记、放射性标记、抗生物素蛋白/生物素、胶体金颗粒、有色颗粒和磁性颗粒组成的组。在 另一实施方式中，通过放射性免疫测定、蛋白质印迹测定、免疫荧光测定、酶免疫测定、免疫 沉淀测定、化学发光测定、免疫组织化学测定、斑点印迹测定或狭缝印迹测定来确定所述突 变的存在。在另一实施方式中，通过RT-PCR来确定所述突变的存在。在另一实施方式中， 通过微阵列来确定所述突变的存在。在另一实施方式中，通过核酸测序来确定所述突变的 存在。
[0031] 在一个实施方式中，所述方法还包括对所述患者施用NOTCH抑制剂。在另一实 施方式中，所述NOTCH抑制剂是γ-分泌酶抑制剂或抗NOTCH抗体。在另一实施方式中， 所述分泌酶抑制剂选自由以下物质组成的组：III-31-C ;N-[N-(3, 5-二氟苯乙酰 基）-L-丙氨酰基]S-苯基甘氨酸叔丁基酯）（DAPT);化合物E ;D-螺旋肽294 ;异香豆素； B0C-LyS(CbZ)Ile-Leu-环氧化物；和（Z-LL) 2-酮。在另一实施方式中，抗NOTCH抗体是抗 N0TCH1抗体。在另一实施方式中，所述抗N0TCH1抗体阻断了配体与N0TCH1受体的结合。 在另一实施方式中，所述抗N0TCH1抗体阻断了对N0TCH1受体的切割。在另一实施方式中， 所述抗N0TCH1抗体包含：含有CDR氨基酸序列CDR1(SEQ ID N0:5)、CDR2(SEQ ID N0:6)和 CDR3(SEQ ID N0:7)的重链可变区，和含有 CDR 氨基酸序列 CDR1(SEQ ID N0:8)、CDR2(SEQ ID N0:9)和CDR3(SEQ ID N0:10)的轻链可变区。在另一实施方式中，抗NOTCH抗体是抗 N0TCH3抗体。在另一实施方式中，所述抗N0TCH3抗体阻断了配体与N0TCH3受体的结合。在 另一实施方式中，所述抗N0TCH3抗体阻断了对N0TCH3受体的切割。在另一实施方式中，所 述抗 N0TCH3 抗体包含：含有 CDR 氨基酸序列 CDR1(SEQ ID N0:23)、CDR2(SEQ ID N0:24)和 CDR3(SEQ ID N0:25)的重链可变区，和含有CDR氨基酸序列CDR1(SEQ ID N0:26)、CDR2(SEQ ID NO:27)和 CDR3(SEQ ID NO:28)的轻链可变区。
[0032] 本发明还涉及一种治疗具有实体瘤的患者的癌症的方法，所述方法包括对所述 患者施用治疗有效量的N0TCH1抑制剂，其中所述患者中的至少一个实体瘤细胞包含人 N0TCH1基因中的激活性突变。本发明还涉及一种治疗具有乳腺肿瘤的患者的乳腺癌的方 法，所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的N0TCH1抑制剂，其中所述患者中的至少一 个乳腺肿瘤细胞包含人N0TCH1基因中的激活性突变。在一个实施方式中，所述激活性突变 是PEST结构域突变。在另一实施方式中，所述突变增加 NOTCH信号传导。在另一实施方式 中，所述突变包含在人N0TCH1基因的7279位核苷酸处的鸟嘌呤缺失。在又一实施方式中， 所述突变是在人N0TCH1基因的6733位的鸟嘌呤（G)至腺嘌呤（A)替换或鸟嘌呤（G)至胞 嘧啶（C)替换（肺_01246突变）。在另一实施方式中，所述突变是在人N0TCH1基因的6788 位的鸟嘌呤（G)至腺嘌呤（A)替换（乳腺_H12932T突变）。
[0033] 本发明还涉及一种治疗具有实体瘤的患者的癌症的方法，所述方法包括对所述 患者施用治疗有效量的N0TCH3抑制剂，其中所述患者中的至少一个实体瘤细胞包含人 N0TCH3基因中的激活性突变。本发明还涉及一种治疗具有乳腺肿瘤的患者的乳腺癌的方 法，所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的N0TCH3抑制剂，其中所述患者中的至少一 个乳腺肿瘤细胞包含人N0TCH3基因中的激活性突变。在一个实施方式中，所述激活性突变 是PEST结构域突变。在另一实施方式中，所述突变增加 NOTCH信号传导。在另一实施方式 中，所述突变包含在人N0TCH3基因的6622位的胞嘧啶插入。在又一实施方式中，所述突变 是在人N0TCH3基因的6096位的胞嘧啶（C)插入（C31突变）。
[0034] 在一个实施方式中，所述患者是人。在一个实施方式中，来自患者的肿瘤细胞中的 至少约0. 1%、至少约1%、至少约2%或至少约5%包含所述突变。在另一实施方式中，所 述N0TCH1抑制剂是γ -分泌酶抑制剂或抗N0TCH1抗体。在另一实施方式中，所述γ -分 泌酶抑制剂选自由以下物质组成的组：III-31-C ;N-[N-(3, 5-二氟苯乙酰基）-L-丙氨酰 基]S-苯基甘氨酸叔丁基酯）（DAPT);化合物E ;D-螺旋肽294 ;异香豆素；BOC-Lys(Cbz) Ile-Leu-环氧化物；和（Z-LL)2-酮。在另一实施方式中，所述抗N0TCH1抗体阻断了配体与 N0TCH1受体的结合。在另一实施方式中，所述抗N0TCH1抗体阻断了对N0TCH1受体的切割。
[0035] 在一个实施方式中，所述抗N0TCH1抗体包含含有⑶R氨基酸序列⑶R1(SEQ ID N0:5)、CDR2(SEQIDN0:6)和CDR3(SEQIDN0:7)的重链可变区，和含有CDR氨基酸序列 CDR1(SEQ ID N0:8)、CDR2(SEQ ID N0:9)和 CDR3(SEQ ID N0:10)的轻链可变区。在一个 实施方式中，抗N0TCH1抗体包含重链可变区序列SEQIDN0:14和轻链可变区序列SEQID N0:18。在另一实施方式中，所述抗N0TCH1抗体是0MP-52M51。
[0036] 在一个施方式中，所述N0TCH3抑制剂是γ -分泌酶抑制剂或抗N0TCH3抗体。在另 一实施方式中，所述分泌酶抑制剂选自由以下物质组成的组：m-31-C ;N-[N-(3, 5-二 氟苯乙酰基）-L-丙氨酰基]S-苯基甘氨酸叔丁基酯）（DAPT);化合物E ;D-螺旋肽294 ; 异香豆素；BOC-Lys(Cbz)Ile_Leu-环氧化物；和（Z_LL)2-酮。在另一实施方式中，所述抗 N0TCH3抗体阻断了配体与N0TCH3受体的结合。在另一实施方式中，所述抗N0TCH3抗体阻 断了对N0TCH3受体的切割。在另一实施方式中，所述抗N0TCH3抗体包含含有CDR氨基酸 序列 CDR1(SEQ ID N0:23)、CDR2(SEQ ID N0:24)和 CDR3(SEQ ID N0:25)的重链可变区，和 含有 CDR 氨基酸序列 CDR1(SEQ ID N0:26)、CDR2(SEQ ID N0:27)和 CDR3(SEQ ID N0:28) 的轻链可变区。（59R5)
[0037] 在一个实施方式中，所述患者包含三阴性乳腺癌细胞。
[0038] 在一个实施方式中，所述方法还包括施用第二治疗剂。
[0039] 在另一实施方式中，所述患者之前进行癌症治疗失败。在另一实施方式中，所述患 者具有化疗抗性乳腺癌。
[0040] 本发明还涉及一种鉴定测试化合物的方法，所述测试化合物抑制突变的NOTCH受 体的存在所诱导的异常细胞生长，所述方法包括：(a)将所述测试化合物与表达所述突变 NOTCH受体的细胞一起温育，所述温育在分泌酶的存在下进行；(b)将步骤（a)中的受 体活性的量与在不存在所述测试化合物时进行的温育的活性进行比较，其中，如果在存在 所述测试化合物时观察到的活性小于在不存在所述测试化合物时观察到的活性，则所述测 试化合物抑制细胞生长。
[0041] 本发明还涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含至少一种用于特异性地检测本发明的 突变NOTCH受体的试剂。在一个实施方式中，所述试剂是结合本发明的突变NOTCH受体的 抗体或核酸探针。
[0042] 本发明的其他目的和优点的一部分将在以下描述中阐述，一部分将通过所述描述 而变得清楚，或者可以通过实施本发明而理解。本发明的目的和优点可以借助于要素和组 合（特别是所附权利要求中指出的要素和组合）来实现和获得。应该理解的是，之前的总 体描述和之后的详细描述都仅仅是示例性和解释性的，而不会限制所要求保护的发明。
[0043] 本发明还提供对依赖于异常NOTCH活性来维持不受控生长的癌细胞组的鉴定。在 一些实施方式中，本发明证明这些细胞中的NOTCH I⑶水平高于对照样品的水平或高于其 他参照水平，并证明了肿瘤细胞中的NOTCH I⑶水平可以诊断性地用于鉴定可能对NOTCH 抑制剂治疗或对使NOTCH活性减少的其他因子产生响应的癌细胞。
[0044] 因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种对癌症患者群体分阶以用NOTCH抑制 剂进行治疗的方法，所述方法包括：(a)确定来自所述患者的肿瘤细胞中的NOTCH ICD水 平，和（b)基于肿瘤细胞中的NOTCH ICD水平将所述患者群体分阶。
[0045] 在另一实施方式中，本发明还涉及一种选择患者以用NOTCH抑制剂进行治疗的方 法，所述方法包括：(a)确定来自所述患者的肿瘤细胞中的NOTCH ICD水平，和（b)选择出 肿瘤细胞的NOTCH ICD水平高于对照样品的水平或高于参照水平的患者。本发明还提供 了一种选择癌症患者以用N0TCH1抑制剂（例如0MP-52M51)进行治疗的方法，所述方法包 括：(a)用抗N0TCH1 ICD抗体在免疫组织化学测定中确定来自所述患者的实体瘤细胞中的 N0TCH1 ICD水平；和（b)选择出实体瘤细胞在所述测定中得到的Η分数为约30以上（或 在所述测定中为约100以上）的患者来治疗。
[0046] 在另一实施方式中，本发明涉及一种确定被诊断为患有癌症的患者是否可能对基 于NOTCH抑制剂的治疗产生响应的方法，所述方法包括确定来自所述患者的肿瘤细胞中的 NOTCH ICD水平的步骤，其中，高于参照水平或高于对照样品水平的NOTCH ICD水平表示所 述患者可能对所述治疗产生响应。
[0047] 在另一实施方式中，本发明涉及一种确定被诊断为患有癌症的患者是否应该施用 NOTCH抑制剂的方法，所述方法包括确定来自所述患者的肿瘤细胞中的NOTCH ICD水平，其 中，高于参照水平或高于对照样品水平的NOTCH ICD水平预示着所述患者对NOTCH抑制剂 治疗具有有利的响应。
[0048] 在另一实施方式中，本发明涉及一种确定被诊断为患有癌症的患者是否应该继续 用NOTCH抑制剂进行治疗的方法，所述方法包括确定来自所述患者的肿瘤细胞中的NOTCH ICD水平，其中，高于参照水平或高于对照样品水平的NOTCH ICD水平表示所述患者可能对 NOTCH抑制剂治疗产生响应。
[0049] 在另一实施方式中，本发明涉及一种确定NOTCH抑制剂在治疗患者癌症中的治疗 功效的方法，所述方法包括确定来自所述患者的肿瘤细胞中的NOTCH ICD水平，其中，高于 参照水平或高于对照样品水平的NOTCH ICD水平表示所述NOTCH抑制剂具有治疗功效。
[0050] 在某些实施方式中，所述NOTCH I⑶是N0TCH1 I⑶。在替代性实施方式中，所述 NOTCH I⑶是N0TCH3 I⑶。在又一实施方式中，NOTCH I⑶水平是肿瘤细胞的细胞核中的 NOTCH I CD 水平。
[0051] 在另外的实施方式中，所述方法还包括从所述患者获得身体样品。在又一实施方 式中，所述样品是全血、血浆、血清或组织。
[0052] 在另外的实施方式中，所述癌选自由以下组成的组：肺癌、胃肠道癌、肾癌、卵巢 癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾脏癌、前列腺癌、甲状腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、多形 性成胶质细胞瘤、子宫颈癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、胆道癌以及头颈癌。在 又一实施方式中，所述癌是乳腺癌。在又一实施方式中，所述癌是小细胞癌、小细胞肺癌、胃 癌、食管癌、肝细胞癌或胆管上皮癌。
[0053] 在另外的实施方式中，使用特异性地结合NOTCH I⑶的试剂来确定NOTCH I⑶水 平。在又一实施方式中，所述试剂是抗NOTCH I⑶抗体。在又一实施方式中，所述抗NOTCH ICD抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
[0054] 在另外的实施方式中，所述试剂带有可检测标记。在又一实施方式中，所述标记 选自由免疫荧光标记、化学发光标记、磷光标记、酶标记、放射性标记、抗生物素蛋白/生物 素、胶体金颗粒、有色颗粒和磁性颗粒组成的组。
[0055] 在另外的实施方式中，所述NOTCH ICD水平通过放射性免疫测定、免疫荧光测定、 酶免疫测定、化学发光测定或免疫组织化学测定来确定。在又一实施方式中，所述NOTCH ICD水平（和/或与其进行比较的参照水平）用Η分数来表征。
[0056] 在另外的实施方式中，所述方法还包括对所述患者施用NOTCH抑制剂。
[0057] 在另一实施方式中，本发明涉及一种治疗具有实体瘤的患者的癌症的方法，所述 方法包括：(a)确定所述实体瘤细胞中的NOTCH ICD水平；和（b)对所述患者施用治疗有效 量的NOTCH抑制剂。在一些实施方式中，所述NOTCH I⑶是N0TCH1 I⑶，所述NOTCH抑制剂 是N0TCH1抑制剂（例如0MP-52M51)，并且经确定所述实体瘤细胞在使用抗N0TCH1 I⑶抗 体的免疫组织化学测定中的Η分数为约30以上。在某些替代性实施方式中，经确定所述实 体瘤细胞在所述测定中的Η分数为约100以上。
[0058] 在另外的实施方式中，所述NOTCH抑制剂是分泌酶抑制剂或抗NOTCH抗 体。在又一实施方式中，所述分泌酶抑制剂选自由以下物质组成的组 ：III-31-C; N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基）-L-丙氨酰基]S-苯基甘氨酸叔丁基酯）（DAPT);化合物E ; D-螺旋肤 294 ;异香?素；BOC-Lys (Cbz) Ile-Leu-环氧化物；和（Z-LL) 2_ 丽。
[0059] 在另外的实施方式中，所述抗NOTCH抗体是抗N0TCH1抗体。在又一实施方式中， 所述抗N0TCH1抗体阻断了配体与N0TCH1受体的结合。在又一实施方式中，所述抗N0TCH1 抗体阻断了对N0TCH1受体的切割。在一个实施方式中，所述抗N0TCH1抗体包含含有CDR氨 基酸序列 CDR1(SEQ ID N0:5)、CDR2(SEQ ID N0:6)和 CDR3(SEQ ID N0:7)的重链可变区， 和含有 CDR 氨基酸序列 CDR1(SEQ ID N0:8)、CDR2(SEQ ID N0:9)和 CDR3(SEQ ID N0:10) 的轻链可变区。在一个实施方式中，抗N0TCH1抗体包含重链可变区序列SEQ ID NO: 14和 轻链可变区序列SEQ ID N0:18。在另一实施方式中，所述抗N0TCH1抗体是0MP-52M51。
[0060] 在另外的实施方式中，所述抗NOTCH抗体是抗N0TCH3抗体。在又一实施方式中，所 述抗N0TCH3抗体阻断了配体与N0TCH3受体的结合。在又一实施方式中，所述抗N0TCH3抗 体阻断了对N0TCH3受体的切割。在又一实施方式中，所述抗N0TCH3抗体包含含有CDR氨基 酸序列 CDR1(SEQ ID N0:23)、CDR2(SEQ ID N0:24)和 CDR3(SEQ ID N0:25)的重链可变区， 和含有 CDR 氨基酸序列 CDR1 (SEQ ID NO :26)、CDR2 (SEQ ID NO :27)和 CDR3 (SEQ ID NO :28) 的轻链可变区。在一个实施方式中，抗N0TCH3抗体包含重链可变区序列SEQ ID N0:30和 轻链可变区序列SEQ ID NO: 32。在一个实施方式中，所述抗N0TCH3抗体是59R5。
[0061] 在另外的实施方式中，所述患者是人。
[0062] 在另一实施方式中，本发明涉及一种治疗具有实体瘤的患者的癌症的方法，所述 方法包括：对所述患者施用治疗有效量的N0TCH1抑制剂，其中所述患者中的实体瘤细胞 (a)包含水平高于参照水平或高于对照样品中发现的水平的N0TCH1ICD ;或（b)特征在于在 使用抗N0TCH1I⑶抗体的免疫组织化学测定中的Η分数为约30以上（或为约100以上）。
[0063] 在另外的实施方式中，所述N0TCH1抑制剂是分泌酶抑制剂或抗N0TCH1抗 体。在又一实施方式中，所述分泌酶抑制剂选自由以下物质组成的组 ：III-31-C; N-[N-(3, 5-二氟苯乙酰基）-L-丙氨酰基]S-苯基甘氨酸叔丁基酯）（DAPT);化合物E ; D-螺旋肤 294 ;异香?素；BOC-Lys (Cbz) Ile-Leu-环氧化物；和（Z-LL) 2_ 丽。
[0064] 在另外的实施方式中，所述抗N0TCH1抗体阻断了配体与N0TCH1受体的结合。在 又一实施方式中，所述抗N0TCH1抗体阻断了对N0TCH1受体的切割。在另一实施方式中， 所述抗N0TCH1抗体包含含有CDR氨基酸序列CDR1(SEQ ID N0:5)、CDR2(SEQ ID N0:6)和 CDR3 (SEQ ID NO :7)的重链可变区，和含有 CDR 氨基酸序列 CDR1 (SEQ ID NO :8)、CDR2 (SEQ ID NO:9)和 CDR3 (SEQ ID NO: 10)的轻链可变区。
[0065] 在另外的实施方式中，所述患者是人。
[0066] 在另外的实施方式中，所述方法还包括施用第二治疗剂。
[0067] 在另外的实施方式中，所述患者之前进行癌症治疗失败。在又一实施方式中，所述 患者包含三阴性乳腺癌细胞。在又一实施方式中，所述患者具有化疗抗性乳腺癌。
[0068] 在另外的实施方式中，所述患者具有小细胞癌、小细胞肺癌、胃癌、食管癌、肝细胞 癌或胆管上皮癌。
[0069] 在另外的实施方式中，使用特异性地结合NOTCH I⑶的试剂来确定NOTCH I⑶水 平。在又一实施方式中，所述试剂是抗NOTCH I⑶抗体。在又一实施方式中，所述抗NOTCH ICD抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
[0070] 在另外的实施方式中，所述试剂带有可检测标记。在又一实施方式中，所述标记 选自由免疫荧光标记、化学发光标记、磷光标记、酶标记、放射性标记、抗生物素蛋白/生物 素、胶体金颗粒、有色颗粒和磁性颗粒组成的组。
[0071] 在另外的实施方式中，所述NOTCH ICD水平通过放射性免疫测定、免疫荧光测定、 酶免疫测定、化学发光测定或免疫组织化学测定来确定。在又一实施方式中，所述NOTCH ICD水平用Η分数表征。

【专利附图】

【附图说明】
[0072] 图1 :新鉴定的0ΜΡ-Β40和0MP-B37N0TCH突变的示意性图示。（Α)0ΜΡ-Β40突变 的特征为在人N0TCH1基因的7279位核苷酸处的鸟嘌呤（G)的杂合性缺失。该缺失引起 N0TCH1的PEST结构域的阅读框移码（G2427fs)。（Β) 0ΜΡ-Β37突变的特征为在人N0TCH3基 因的6622核苷酸处的胞嘧啶（C)的纯合性插入，这引起PEST结构域的2208位氨基酸处的 阅读框移码（P2208fs) oNOTCH的示意性图示采用自Weng等，Science 306:269-271(2004)。
[0073] 图2 :含有0MP-B40或0MP-B37突变的异种移植物肿瘤中的NOTCH表达分析。（A) 抗N0TCH1. I⑶抗体与切下的N0TCH1胞内结构域（N0TCH1. I⑶）发生特异性反应，并且在 0MP-B40异种移植物肿瘤的细胞核组分中检测到截短的切下的N0TCH1胞内结构域。（B)抗 N0TCH3. I⑶抗体与切下的N0TCH3. I⑶发生特异性反应，并且在0MP-B37异种移植物肿瘤的 细胞核组分中检测到截短的切下的N0TCH3. I⑶。（C)截短的N0TCH1I⑶和截短的N0TCH3I⑶ 主要见于0MP-B40和0MP-B37异种移植物肿瘤的细胞核组分中。这两种肿瘤系分别携带有 N0TCH1和N0TCH3的PEST结构域的突变。在携带野生型N0TCH1的0MP-C31和0MP-0V38异 种移植物肿瘤中未检测到核N0TCH1 I⑶和N0TCH3 I⑶，但0MP-C31在N0TCH3基因中含有 6172insC(het) [P2033fs]突变。
[0074] 图3 :0MP-B40乳腺肿瘤中N0TCH1拮抗剂的活性。（A)0MP-B40肿瘤中0MP-52M51 人源化抗N0TCH1抗体的剂量依赖性活性。（B)将抗N0TCH1抗体0MP-52M51、紫杉醇或 0MP-52M51与紫杉醇的组合施用至0MP-B40异种移植物小鼠。单独的或与紫杉醇组合的 0MP-52M51都极大地减少了异种移植物动物中的肿瘤体积。（C和D)在具有N0TCH1激活性 突变的乳腺癌模型中，0MP-52M51抗N0TCH1抗体阻断了 N0TCH1. I⑶的累积。如IHC测定 所检测到的，用作单独试剂或与紫杉醇组合的0MP-52M51抗N0TCH1抑制了 N0TCH1. I⑶的 累积。
[0075] 图4 :经抗N0TCH1治疗的0MP-B40乳腺肿瘤的致瘤性。将来自经对照抗体治疗的 肿瘤和经0MP-52M51人源化抗N0TCH1抗体治疗的肿瘤的肿瘤细胞各自注入10只小鼠中。 在不进行进一步治疗的情况下使肿瘤生长92天。在注射了经对照抗体治疗的细胞的10只 小鼠中，每一只中都出现了 0MP-B40肿瘤生长；而在注射了之前经0MP-52M51治疗的细胞的 10只小鼠中，仅有2只在第92天产生可检出的肿瘤生长，这表明0MP-52M51治疗减少了上 述细胞的后续致瘤性。
[0076] 图5 :0MP-B37乳腺肿瘤中N0TCH2/3拮抗剂的活性。对0MP-B37异种移植物小鼠 施用抗N0TCH2/3抗体59R5或对照抗体。与施用对照抗体时相比，59R5极大地减少了异种 移植物动物中的肿瘤体积。
[0077] 图6 :0MP-B37乳腺肿瘤中抗N0TCH2/3抗体的活性。对0MP-B37异种移植物小鼠 施用抗N0TCH2/3抗体59R5、紫杉醇或59R5与紫杉醇的组合。（A)单独的或与紫杉醇组合 的59R5都极大地减少了异种移植物动物中的肿瘤体积。（B) 59R5抗N0TCH2/3抗体增加了 E钙黏蛋白的表达，表明上皮间质转化（EMT)的逆转。
[0078] 图 7 : (A) 0MP-C31 中 N0TCH3 移码突变的 Sanger 色谱图。（B)肺 _01246 中 N0TCH1 错义突变的Sanger色谱图。（C)乳腺_H12932T中N0TCH1错义突变的Sanger色谱图。NOTCH 的示意性图示采用自Weng等，Science 306:269-271(2004)。
[0079] 图8 :通过免疫组织化学对激活的NOTCH 1-1⑶进行核定位。
[0080] 图9 : (A)实体肿瘤中的N0TCH1. I⑶筛选。显示了 Η分数彡30的样品的频率。（B) 食管癌样品的Nl. I⑶IHC分析。（C)胃癌中的N0TCH1. I⑶筛选。显示了 Η分数彡30的样 品的频率。
[0081] 图10 :0MP-LU61小细胞肺癌中0ΜΡ-52Μ51人源化抗N0TCH1抗体的活性。
[0082] 图11 :0MP-C63结肠癌中0MP-52M51人源化抗N0TCH1抗体的活性。
[0083] 图12 :0MP-C11、0MP-C20和0MP-C40肿瘤细胞中，与伊立替康组合的0MP-52M51人 源化抗N0TCH1抗体的活性。
[0084] 图13 :对N0TCH1和N0TCH3突变蛋白的萤光素酶测定。（A)用编码N0TCH1全长野 生型（N0TCH1_WT)或N0TCHl_G2427fs突变（0MP-B40)多肽的DNA瞬时转染PC3细胞。在不 存在外源性配体时评估了 NOTCH信号传导所介导的萤光素酶活性。（B)用编码N0TCH3全长 野生型（N0TCH3_WT)、N0TCH3_P2033fs 突变（0MP-C31)或 N0TCH3_P2208fs 突变（0MP-B37) 多肽的DNA瞬时转染PC3细胞和A549细胞。在不存在外源性配体时评估了 NOTCH萤光素 酶活性。（C)用编码N0TCH3_P2033fs(0MP-C31)多肽的DNA瞬时转染了的PC3细胞中的 JAGl(l-500ng/30yL)的剂量响应曲线。（D)用编码 N0TCH3_P2208fs(0MP-B37)的 DNA 瞬 时转染了的PC3细胞中的JAG1 (l-500ng/30 μ L)的剂量响应曲线。* =使用t检验时NOTCH 全长野生型相对于N3.突变的p值〈.05。
[0085] 图14 :A2G1抗N0TCH1抗体的治疗抑制了 0MP-B40乳腺肿瘤模型中的肿瘤生长和 N0TCHI I⑶的累积，并与用γ分泌酶抑制剂（GSI)进行治疗时相比胃肠道毒性的严重程度 更低。
[0086] 图15 :0MP-C31结肠肿瘤中59R5抗N0TCH2/3抗体的活性。
[0087] 图16 :根据萤光素酶报道测定中的测量，52M51抗N0TCH1抗体抑制了 G2427fs(0MP-B40)和R2328W勵了011_突变多肽的活性。图16A和B显示了在浓度逐渐增加 的52M51抗体的存在下，在分别用DLL4和JAG1刺激后，在表达G2427fs(0MP-B40)N0TCHl_ 突变多肽的PC3细胞中观察到的萤火虫萤光素酶与海肾萤光素酶的活性比。图16C和D显 示了在浓度逐渐增加的52M51抗体的存在下，在分别用DLL4和JAG1刺激后，在表达R2328W N0TCH1_突变多肽的PC3细胞中观察到的萤火虫萤光素酶与海肾萤光素酶的活性比。图 16A-D都还包括了用不表达重组N0TCH1多肽的对照PC3细胞获得的数据。
[0088] 图17 :0MP-B37乳腺肿瘤中N0TCH2/3拮抗剂的活性。在具有N0TCH3激活性突变 的乳腺癌模型中，0MP-59R5抗N0TCH2/3抗体阻断了 N0TCH3. I⑶的累积。

【具体实施方式】 [0089] I.定义
[0090] 为了本发明的目的，以下定义了如下术语。
[0091] 应该注意的是，术语"一个"或"一种"实体是指一个或多个该实体，例如"一种 NOTCH受体多肽"理解为代表包含NOTCH受体氨基酸的一种或多种多肽。因此，本文中术语 "一种"（或"一个""一种或多种"和"至少一种"能够互换使用。
[0092] 如本文所用，术语"多肽"意在涵盖单数的"多肽"以及复数的"多肽"，并且是指由 通过酰胺键（也称为肽键）线性连接的单体（氨基酸）组成的分子。术语"多肽"是指两 个以上氨基酸的任何一条或多条链，并不是指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、 "蛋白质"、"氨基酸链"或任何其他用于指代两个以上氨基酸的一条或多条链的术语也包括 在"多肽"的定义内，并且术语"多肽"可以用来代替任何这些术语或与之互换使用。术语 "多肽"还意在指多肽在表达后的经修饰产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺 化、被已知的保护性/封闭性基团衍生化、蛋白水解性切割或被非天然存在的氨基酸修饰。 多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但不必从指定的核酸序列翻译得到。其 可以以任何方式产生，包括化学合成。
[0093] "分离的"生物组分（例如核酸分子或蛋白）已经基本上被分离出或纯化出，从 而已离开该组分所天然存在的有机体的细胞中的其他生物组分，即其他染色体和染色体外 DNA和RNA、蛋白和细胞器。已经"分离的"的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的 核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达而制备的核酸和蛋白质以及化学 合成的核酸。
[0094] 当以单数或复数形式使用时，术语"多核苷酸"通常是指任何多聚核糖核苷酸或多 聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的RNA或DNA或是经修饰的RNA或DNA。因此，例如， 本文定义的多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、包括单链和双链区域的DNA、单链和双 链RNA、包括单链和双链区域的RNA、包含DNA和RNA的杂交分子（其可以为单链的或更通 常为双链的，或包括单链和双链区域）。因此，出于稳定性或其他原因而修饰了主链的DNA 或RNA是在本文中该术语所意指的"多核苷酸"。此外，包含不常见碱基（例如肌苷）或经 修饰的碱基（例如氚化碱基）的DNA或RNA也包括在本文定义的术语"多核苷酸"内。通 常，术语"多核苷酸"包括未经修饰的多核苷酸的所有经化学修饰、酶修饰和/或代谢学修 饰的形式。多核苷酸可以通过各种方法制备，包括以体外重组DNA为媒介的技术和在细胞 和有机体中表达DNA。
[0095] 当用于描述目标物时，本文所用的术语"天然存在的"或"野生型"是指该目标物 可以在自然界中发现。例如，如下多肽或多核苷酸序列是野生型的：其存在于有机体（包括 病毒）中，可以从天然来源分离出并且尚未在实验室中被人类有意修饰，等等。
[0096] 本文所用的"突变"是指通过体细胞突变而产生的变异，例如，在给定受试对象中 仅出现在疾病细胞中的非先天性变异。此类体细胞获得性变异的实例包括经常导致各种参 与癌症发展的基因的功能改变的点突变。突变类型包括碱基替换点突变（即转换或颠换）、 缺失和插入。错义突变是将另一种氨基酸引入所编码的蛋白的序列中的突变，无义突变是 引入新终止密码子的突变。对于插入或缺失，突变可以是框内（不改变总体序列的框）或 移码突变，其可导致大量密码子的错读（经常因在替代性框中存在终止密码子而导致所编 码产物的异常终止）。本发明的突变可发现于受试对象的一个等位基因上（杂合子）或全 部两个等位基因上（纯合子）。影响NOTCH受体的结构域、特别是PEST结构域（富含脯氨 酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸）的功能的激活性突变可以包括通过截短而消除一部分或全 部结构域的突变（例如无义突变或移码突变）。激活性突变还可以包括位于结构域本身中 (例如在PEST结构域内）的阻碍结构域功能的错义突变。
[0097] "激活性突变"是使NOTCH组成性地活跃、对配体刺激过度敏感或异常表达的体细 胞突变。在一些实施方式中，激活性突变引起增加的NOTCH信号传导。NOTCH信号传导的量 可以通过本领域已知的方法确定。简言之，将来自突变NOTCH多肽的信号传导的量与来自 野生型NOTCH多肽的NOTCH信号传导的量进行比较。本文所用的"增加的NOTCH信号传导" 或"增强的NOTCH信号传导"是指与含有野生型NOTCH多肽的细胞中的NOTCH信号传导相 t匕，在含有突变NOTCH多肽的细胞中NOTCH信号传导的量更高。可以使用本领域已知的多 种方法来检测NOTCH信号传导。示例性方法包括但不限于NOTCH I⑶蛋白质印迹或免疫组 织化学（IHC)(参见Wu等，Nature, 464:1052-1059 (2010))。通常，正常组织中的表达/信 号传导是比较用的标准，用来确定高于正常水平的信号传导。在一些实施方式中，使用来自 与所关注的细胞邻近的正常组织的细胞来确定信号传导水平。在一些NOTCH ICD测定中， 正常组织中的NOTCH ICD水平检测不到，因此高于背景的任何信号将认为是增加的。
[0098] 本文所用的术语"可操作地连接"是指设定组件的位置以使得它们的关系允许它 们以计划的方式发挥功能。控制序列与编码序列"可操作地连接"是以下述方式连接：在与 控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
[0099] 本文所用的术语"控制序列"是指实现其所连接的编码序列的表达和加工所必需 的多核苷酸序列。此类控制序列的性质视宿主有机体而有所不同；在原核生物中，此类控制 序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，此类控制序列通常 包括启动子和转录终止序列。术语"控制序列"意图至少包括对于表达和加工而言必须存 在的所有组件，并且还可以包括在存在时会带来益处的其他组件，例如前导序列和融合伴 侣序列。
[0100] 两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的相似性以两个序列之间的相似程度表达， 还称作"序列同一性"。序列同一性通常以百分比同一性（或相似性或同源性）来度量，该 百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法比对时，人NOTCH受体和相应的cDNA或基 因序列的同源物或直系同源物会拥有相对高度的序列同一性。当直系同源蛋白或基因或 cDNA源自亲缘关系更接近的物种（例如人和黑猩猩序列）时，与亲缘关系更远的物种（例 如人和秀丽隐杆线虫（C.elegans)序列）相比，同源性会更为显著。
[0101] 用于进行比较的序列比对方法是本领域公知的。以下文献描述了多种程序和比 对算法：Smith 和 Waterman Adv. Appl. Math. 2:482, 1981 ;Needleman 和 Wunsch J. Mol. Biol. 48:443, 1970 ;Pearson 和 Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988 ;Higgins 和 Sharp Gene，73:237-244,1988 ;Higgins 和 Sharp CABI0S 5:151-153, 1989 ;Corpet 等 Nuc. Acids Res.16, 10881-90, 1988 ;Huang 等 Computer Appls. in the Biosciences 8:155-65,1992;以及 Pearson 等 Meth. Mol. Bio. 24:307-31,1994。Altschul 等 J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990对序列比对方法和同源性计算进行了详细的考量。
[0102] NCBI Basic Local A1 ignment Search Tool (BLAST) (Altschul 等 J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)可获自多种来源，包括美国国家生物技术信息中心 (NCBI, Bethesda, Md.)和互联网，以与序列分析程序 blastp、blastn、blastx、tblastn 和 tblastx关联使用。举例而言，为了比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列，使用利用设为默 认参数的默认BL0SUM62矩阵（空位存在罚分为11，每个残基空位罚分为1)的Blast 2序 列功能。当比对短肽（少于约30个氨基酸）时，使用采用设为默认参数的PAM30矩阵（起 始空位罚分为9,延伸空位罚分为1)的Blast 2序列功能来进行比对。
[0103] 两个核酸分子紧密相关的另一指征是这两个分子在严格条件下相互杂交。严格条 件是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。通常，将严格条件选择为比在确定的 离子强度和pH下的特定序列的热解链温度（Tm)低约5°C?20°C。Tm是使50%的靶序列与 完全匹配的探针或互补链保持杂交的温度（在确定的离子强度和pH下）。核酸杂交条件和 严格度的计算可参见Sambrook等（见Molecular Cloning:A Laboratory Manual, CSHL, New York,1989)和 Tijssen(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes 第 1 部分，第 2 章，Elsevier, New York, 1993)。在严格条件下与人NOTCH受体编码序列杂交的核酸分子通常会在50°C的 2 XSSC洗涤条件下与基于人NOTCH多核苷酸或基于NOTCH多核苷酸的选定部分的探针杂 交。
[0104] 由于遗传密码的简并性，不显示高度序列同一性的核酸序列也可以编码相似的氨 基酸序列。应该理解的是，可以使用该简并性来改变核酸序列从而产生全都编码基本上相 同的蛋白的多种核酸分子。
[0105] 在本发明的背景下，提到在任何特定NOTCH受体中列出的"至少一种"、"至少两 种"、"至少三种"突变等时，是指所列出突变的任一种或任何组合和所有组合。
[0106] "NOTCH"是调节许多细胞过程、特别是发育时的细胞过程的膜结合转录因子。在响 应于配体结合时，其胞内结构域（ICD)通过两种蛋白酶而释放。所释放的胞内结构域进入 细胞核，并且与DNA结合蛋白相互作用，从而激活转录。NOTCH的胞外结构域和关联蛋白含 有最多36个EGF样结构域，之后是三个notch (DSL)结构域。胞内结构域（ICD)含有六个 锚蛋白重复和包括PEST结构域的羧基末端延伸。N0TCH1和N0TCH2I⑶另外包含反式激活 结构域（TAD)。"NOTCH"涵盖NOTCH受体家族的所有成员。对NOTCH信号传导途径和受其 影响的状况的描述可例如参见W098/20142和W0 00/36089。
[0107] 本文所用的" NOTCH抑制剂"、" NOTCH拮抗剂"、"抗NOTCH治疗剂"或"抗NOTCH 齐Γ包括部分或完全阻断、抑制或中和NOTCH途径的生物活性的任何化合物。示例性 的NOTCH抑制化合物包括但不限于γ -分泌酶抑制剂，例如III-31-C ;N-[N-(3, 5-二氟 苯乙酰基）-L-丙氨酰基]S-苯基甘氨酸叔丁基酯）（DAPT);化合物E ;D-螺旋肽294 ; 异香豆素；BOC-Lys (Cbz) Ile-Leu-环氧化物；和（Z_LL)2-酮（参见 Kornilova 等，J. Biol. Chem. 278:16479-16473(2003));以及描述于以下文献的那些化合物：TO01/90084、 TO 02/30912、TO 01/70677、TO 03/013506、TO 02/36555、TO 03/093252、TO 03/093264、 TO 03/093251、 TO 03/093253、TO 2004/039800、TO 2004/039370、TO 2005/030731、 TO 2005/014553、 TO 2004/089911、TO 02/081435、TO 02/081433、TO 03/018543、TO 2004/031137、TO 2004/031139、TO 2004/031138、W02004/101538、TO 2004/101539 和 TO 02/47671以及美国专利申请第2003/0114496号。具体的Y-分泌酶抑制剂还描述 于美国专利第6, 984, 663和7, 304, 094号。具体的抗体NOTCH抑制剂描述于本文以及TO 2010/005566和W0 2010/005567,所有这些文献都通过援引并入本文。NOTCH抑制剂还包括 NOTCH配体拮抗剂。
[0108] "NOTCH抑制剂"、"NOTCH拮抗剂"、"抗NOTCH治疗剂"或"抗NOTCH剂"还涵盖结 合NOTCH受体的抗体。术语"抗体"是指免疫球蛋白分子，其通过免疫球蛋白分子的可变区 内的至少一个抗原识别部位或抗原结合部位来识别并特异性地结合靶标，例如蛋白质、多 肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或者它们的组合。本文所用的术语"抗体"涵盖了完整 的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段（例如Fab、Fab'、F(ab'）2和Fv片段）、单链 Fv(SCFv)突变抗体、多特异性抗体（例如由至少两个完整抗体产生的双特异性抗体）、嵌合 抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原识别部位的融合蛋白、和包含抗原识别部位的 任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展现所需的生物活性即可。抗体可以是免 疫球蛋白的五个主要类别中的任一个：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或者，基于其重链恒定区 的身份（分别称作α、δ、ε、γ和μ )，可以是其亚类（同型）（例如，IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4、IgAl和IgA2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同且公知的亚基结构以及三维构造。 抗体可以是裸抗体，或缀合至其他分子，包括但不限于毒素和放射性同位素。
[0109] 术语"抗体片段"是指完整抗体的一部分，并且指完整抗体的抗原决定性可变区。 抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F (ab'）2和Fv片段、线性抗体、单链抗体以及由抗 体片段形成的多特异性抗体。
[0110] 术语"单克隆抗体"是指参与高特异性地识别并结合单一抗原决定簇或表位的同 种抗体群体。这与多克隆抗体相反，多克隆抗体通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体 的混合物。术语"单克隆抗体"涵盖了完整和全长的单克隆抗体以及抗体片段（例如，Fab、 ?813'、？(313'）2、？￥片段）、单链（8〇?￥)突变抗体、包含抗体部分的融合蛋白、和包含抗原识 别部位的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子。此外，"单克隆抗体"是指以多种方式制造的 此类抗体，所述方式包括但不限于杂交瘤产生、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。
[0111] 本文使用的术语"人源化抗体"是指非人类（例如鼠类）抗体的形式，其为含有最 小限度非人类（例如鼠类）序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段。
[0112] 术语"人抗体"是指由人产生的抗体或使用本领域已知的任何技术制造的具有对 应于人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义包括完整或全长抗体及其片段。
[0113] 术语"嵌合抗体"是指免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两个以上物种的抗体。通 常，轻链和重链的可变区对应于源自一个哺乳动物物种（例如，小鼠、大鼠、兔等）的具有所 需特异性、亲和力和/或能力的抗体可变区，而恒定区与源自另一物种（通常是人类）的抗 体中的序列同源，从而避免在该物种中引发免疫应答。
[0114] 术语"表位"或"抗原决定簇"在本文中可互换使用，是指能够被特定抗体识别并 特异性结合的抗原部分。当抗原是多肽时，表位既可由连续的氨基酸形成（通常称为"线性 表位"），也可由通过蛋白的三级折叠而并置的不连续氨基酸形成（通常称为"构象表位"）。 由连续氨基酸形成的表位在蛋白变性时通常会保留，而通过三级折叠形成的表位在蛋白变 性时通常会丧失。表位通常包括处在独特空间构象中的至少3个、或更常见的至少5个或 8?10个氨基酸。
[0115] 术语"特异性地结合"或"特异性结合"是指与其它物质（包括非关联蛋白）相比， 结合剂或抗体与表位或蛋白质的反应或缔合更为频繁、更为迅速、更为持久、亲和力更高或 以上的一些组合。在某些实施方式中，"特异性地结合"是指例如抗体与蛋白结合的K D为约 0. ImM以下，更通常小于约1 μ M。在某些实施方式中，"特异性地结合"是指抗体与蛋白结合 的KD有时为至少约0. 1 μ Μ以下，有时为至少约0. 01 μ Μ以下。
[0116] 本文所用的术语"分阶"是指根据特定的疾病状态或状况的特征将受试对象分成 不同类别或阶层。例如，对罹患NOTCH介导的癌症的受试对象群体进行分阶包括基于突变 的存在（肿瘤分类）和/或基于疾病的严重性（例如轻度、中期和晚期等）分类受试对象。
[0117] 术语"受试对象"是指任何动物（例如，哺乳动物），包括但不限于人、非人灵长类 和啮齿动物等，其是特定治疗的接受者。通常，对于人类受试对象，在本文中术语"受试对 象"和"患者"可互换使用。本文中用于获得定量和定性数据的"正常"受试对象或来自"正 常"受试对象的样品是指已经由或会由医师评估为不具有NOTCH介导的细胞增殖紊乱或以 异常NOTCH信号传导为特征的紊乱的受试对象。
[0118] "对照样品"是指来自可比较的对照细胞（通常无疾病）的单独样品。其可以来自 同一受试对象，或来自正常的或不具有用来获得患病样品或测试样品的相同疾病的另一受 试对象。
[0119] 本文使用术语"预后"来指对癌症可导致的死亡或进展的可能性的预测，包括肿瘤 疾病（例如NOTCH介导的癌症）的复发、转移性扩展和药物抗性。本文所用的术语"预测" 是指作出受试对象的后果具有显著增强或下降的可能性（有利的预后或不利的预后）的决 定。其还可以包括NOTCH抑制剂可以是治疗有效的或未发现其具有治疗性的可能性。该 术语还用于指以下情况的可能性：患者对药物或药物组产生有利或不利的响应以及这些响 应的程度；或患者在手术除去原发性肿瘤和/或化学治疗后会存活一定时间且癌症不会复 发。本发明的预测性方法可在临床上用于通过为任何具体患者选择最恰当的治疗模式而作 出治疗决定。因此，在预测患者是否可能有利地响应于基于NOTCH的治疗方案（例如使用 给定药物或药物组合（例如Y分泌酶抑制剂或其他NOTCH抑制剂）的化学治疗）时，或在 预测用NOTCH抑制剂进行治疗方案后和/或终止化学治疗或其他治疗模式后患者是否可能 长期存活时，本发明的预测性方法是有价值的工具。
[0120] 术语"癌症"或"癌变"是指或描述通常以不受控的细胞生长为特征的哺乳动物中 的生理学状况。
[0121] 癌症的"病理学"包括使患者的健康受损的所有现象。这包括但不限于异常或不 受控的细胞生长、转移、干扰相邻细胞的正常功能、以异常水平释放细胞因子或其他分泌产 物、炎性或免疫响应的抑制或恶化、瘤形成、癌变前期、恶性肿瘤、对周围或远端组织或器官 (例如淋巴结）的侵袭，等等。可以使用表明对患者有益的任何终点来评估"患者响应"，包 括但不限于：（1)对肿瘤生长的某种程度的抑制，包括减缓和完全遏制生长；（2)肿瘤细胞 数量减少；（3)肿瘤尺寸减小；(4)抑制（即，减少、减缓或完全停止）了肿瘤细胞浸润到相 邻外周器官和/或组织；（5)抑制（即，减少、减缓或完全停止）了转移；(6)抗肿瘤免疫响 应增强，其可能但不一定导致肿瘤的消退或排斥；（7)与肿瘤相关的一种或多种症状的某 种程度的缓解；（8)治疗后存活时间的延长；和/或（9)治疗后给定时间点的死亡率下降。
[0122] "肿瘤辅助疗法"是在原始（主要）疗法之前的附加或辅助疗法。肿瘤辅助疗法包 括例如化学疗法、放射疗法和激素疗法。因此，可以在手术前施用化学疗法以使肿瘤收缩， 从而使手术能够更有效，或在之前不可手术的肿瘤的可能情况下施用化学疗法。
[0123] 如本文所用的术语"响应"是指根据RECIST(实体瘤中的响应评价标准），患者 或肿瘤在施用试剂后显示出完全响应或部分响应。本文所用的术语"非响应"是指根据 RECIST，患者或肿瘤在施用试剂后显示出稳定的疾病或进行性疾病。RECIST描述于例如 Therasse 等，2000 年 2 月，〃New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors，〃J. Natl. Cancer Inst. 92 (3) :205-216,通过援引将其全部内容并入本 文。示例性试剂包括针对NOTCH多肽的特异性结合剂，包括但不限于抗NOTCH抗体。
[0124] "紊乱"是任何可受益于一种或多种治疗的状况。这包括慢性和急性紊乱或疾病， 包括使哺乳动物倾向于患有所讨论的紊乱的那些病理状况。本文中待治疗的紊乱的非限制 性实例包括良性和恶性肿瘤，特别是乳腺癌、直肠癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、 肾脏癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌或膀胱癌。
[0125] "治疗"或"疗法"是指治疗性治疗和预防性或防御性措施。术语"治疗有效量"是 指对于治疗哺乳动物的疾病或紊乱有效的药物的量。在癌症情况下，以非限制性实例而言， 治疗有效量的抗NOTCH治疗可以：减少癌细胞的数量；减少肿瘤尺寸；抑制（即某种程度上 减缓，优选是停止）癌细胞浸润到周围器官中；抑制（即某种程度上减缓，优选是停止）肿 瘤转移；某种程度上抑制肿瘤生长；和/或某种程度上缓解与所述紊乱有关的一种或多种 症状。在所述药物可以预防癌细胞生长和/或杀死存在的癌细胞的情况下，其可以是细胞 生长抑制剂和/或细胞毒剂。对于癌症治疗，体内功效可以例如通过评估肿瘤负荷或体积、 疾病进展时间（TTP)和/或确定应答率（RR)来测量。
[0126] II.激活性NOTCH突变的鉴定
[0127] 本文公开了 NOTCH受体中的突变，这些突变引起激活的NOTCH蛋白的产生，进而导 致受体信号传导增加。这些突变与例如癌症等肿瘤形成性疾病相关，由此可用来例如评估 癌症患者是否会对NOTCH拮抗剂疗法产生响应。
[0128] 在哺乳动物中，NOTCH 家族有 4 个成员：N0TCH1 (TAN1)、N0TCH2、N0TCH3 和 N0TCH4/Int-4。人NOTCH蛋白的示例性序列包括但不限于：人N0TCH1，由Genbank登录号 NM_017617. 3所示的mRNA序列编码，并具有Genbank登录号NP_060087所示的氨基酸序 列；人N0TCH2,由Genbank登录号NM_024408所示的mRNA序列编码，并具有Genbank登录 号NP_077719所示的氨基酸序列；人N0TCH3,由Genbank登录号NM_000435. 2所示的mRNA 序列编码，并具有Genbank登录号NP_000426所示的氨基酸序列；和人N0TCH4,由Genbank 登录号NM_004557所示的mRNA序列编码，并具有Genbank登录号NP_004548所示的氨基酸 序列。N0TCH1?4的代表性野生型序列分别示于SEQ ID NO: 1?4。使用NM_017617. 3作 为参照序列来确定本文提供的N0TCH1突变的位置。使用NM_000435. 2作为参照序列来确 定本文提供的N0TCH3突变的位置。核苷酸位置的编号始于NOTCH起始密码，其中起始ATG 密码子的腺嘌呤（例如NM_〇17617. 3的第1位残基和NM_000435. 2的第77位残基）对应 于第1位。
[0129] NOTCH在细胞表面表达为单次跨膜的异二聚体受体。配体也是DSL(Delta/ Serrate/LAG-2)家族的跨膜蛋白，其不仅能在相邻细胞上表达，还能在表达NOTCH受体的 同一细胞上表达。受体-配体相互作用触发了在接近跨膜结构域的胞外S2位点处和在S3 位点处的蛋白水解。据认为，TNF-α转化酶（TACE)和早老蛋白（presenillirO-l依赖性 Y -分泌酶分别负责S2和S3位点处的蛋白水解加工。最终的切割释放了羧基末端胞内结 构域（ICD)，其包含侧接有核定位信号的7个锚蛋白重复序列、富脯氨酸-谷氨酸-丝氨 酸-苏氨酸（PEST)结构域和反式激活结构域（TAD)。然后ICD转移至细胞核，募集例如 mastermind 和 p300 等共激活剂，并与 CSL(CBF/Suppressor of Hairless/LAG-1)因子结 合。在不存在NOTCH信号传导时，与辅阻遏剂联结的CSL蛋白遏制靶基因转录。因此，NOTCH 信号传导将对CSL靶基因的转录遏制转换成对其的转录激活。
[0130] 因此，在一个实施方式中，本发明涉及肿瘤细胞的鉴定，所述肿瘤细胞的至少一部 分含有导致NOTCH信号传导增加的激活性NOTCH突变。在一个实施方式中，所述突变是 NOTCH的PEST结构域突变。PEST结构域突变是在最小PEST结构域本身内出现的突变，以 及在该结构域的上游出现并导致PEST结构域消除（例如插入终止密码子）或导致会改变 PEST结构域序列的移码的突变。最小PEST结构域序列示于表1中。在另一实施方式中，所 述突变位于NOTCH的反式激活结构域（TAD)。
[0131] 表：最小NOTCH受体PEST结构域
[0132]

【权利要求】
1. 一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码突变的人N0TCH1受体，其中，所述多核苷 酸包含在人N0TCH1基因的7279位核苷酸处的缺失。
2. 如权利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含在7279位核苷酸处的鸟嘌呤（G) 缺失。
3. -种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码突变的人N0TCH3受体，其中，所述多核苷 酸包含在人N0TCH3基因的6622位的插入。
4. 如权利要求3所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含在6622位的胞嘧啶（C)插入。
5. -种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码突变的人N0TCH3受体，其中，所述多核苷 酸包含在人N0TCH3基因的6096位的插入。
6. 如权利要求5所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含在6096位的胞嘧啶（C)插入。
7. -种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码突变的人N0TCH1受体，其中，所述多核苷 酸包含在人N0TCH1基因的6733位的替换。
8. 如权利要求7所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含在6733位的腺嘌呤（A)或胞嘧啶 (C)。
9. 一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码突变的人N0TCH1受体，其中，所述多核苷 酸包含在人N0TCH1基因的6788位的替换。
10. 如权利要求9所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含在6788位的腺嘌呤（A)。
11. 一种分离的多肽，所述多肽由权利要求1?10中任一项所述的多核苷酸编码。
12. -种载体，所述载体包含权利要求1?10中任一项所述的多核苷酸。
13. -种用权利要求12所述的载体转化了的宿主细胞。
14. 一种鉴定展示出增加的NOTCH受体信号传导的实体瘤细胞的方法，所述方法包括 鉴定所述细胞是否在人N0TCH1的富脯氨酸-谷氨酸-丝氨酸-苏氨酸（PEST)结构域或在 人N0TCH1的TAD结构域中含有突变，其中，所述实体瘤细胞选自由以下肿瘤组成的组：神经 胶质瘤、胃肠道肿瘤、肾肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、结直肠肿瘤、子宫内膜肿瘤、肾脏肿瘤、前 列腺肿瘤、甲状腺肿瘤、成神经细胞瘤、胰腺肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、子宫颈肿瘤、胃肿 瘤、膀胱肿瘤、肝细胞瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤、黑素瘤、胆道肿瘤以及头颈肿瘤。
15. -种鉴定展示出增加的NOTCH受体信号传导的实体瘤细胞的方法，所述方法包括 鉴定所述细胞是否含有人N0TCH2的PEST结构域的突变，其中，所述实体瘤细胞选自由以下 肿瘤组成的组：肺肿瘤、神经胶质瘤、胃肠道肿瘤、肾肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、结直肠肿瘤、 子宫内膜肿瘤、肾脏肿瘤、前列腺肿瘤、甲状腺肿瘤、成神经细胞瘤、胰腺肿瘤、多形性成胶 质细胞瘤、子宫颈肿瘤、胃肿瘤、膀胱肿瘤、肝细胞瘤、结肠肿瘤、黑素瘤、胆道肿瘤以及头颈 肿瘤。
16. -种鉴定展示出增加的NOTCH受体信号传导的实体瘤细胞的方法，所述方法包括 鉴定所述细胞是否含有N0TCH3的PEST结构域的突变，其中，所述实体瘤细胞选自由以下肿 瘤组成的组：肺肿瘤、神经胶质瘤、胃肠道肿瘤、肾肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、结直肠肿瘤、子 宫内膜肿瘤、肾脏肿瘤、前列腺肿瘤、甲状腺肿瘤、成神经细胞瘤、胰腺肿瘤、多形性成胶质 细胞瘤、子宫颈肿瘤、胃肿瘤、膀胱肿瘤、肝细胞瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤、黑素瘤、胆道肿瘤 以及头颈肿瘤。
17. -种鉴定展示出增加的NOTCH受体信号传导的实体瘤细胞的方法，所述方法包括 鉴定所述细胞是否含有N0TCH4的PEST结构域的突变，其中，所述实体瘤细胞选自由以下肿 瘤组成的组：肺肿瘤、神经胶质瘤、胃肠道肿瘤、肾肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、结直肠肿瘤、子 宫内膜肿瘤、肾脏肿瘤、前列腺肿瘤、甲状腺肿瘤、成神经细胞瘤、胰腺肿瘤、多形性成胶质 细胞瘤、子宫颈肿瘤、胃肿瘤、膀胱肿瘤、肝细胞瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤、黑素瘤、胆道肿瘤 以及头颈肿瘤。
18. 如权利要求14?17中任一项所述的方法，其中，所述突变是错义、无义或移码突 变。
19. 如权利要求18所述的方法，其中，所述突变是所述PEST结构域的移码或无义突变。
20. 如权利要求19所述的方法，其中，所述突变是在人N0TCH1基因的7279位核苷酸处 的缺失。
21. 如权利要求20所述的方法，其中，所述突变是在人NOTCH1基因的7279位核苷酸处 的鸟嘌呤（G)缺失（B40突变）。
22. 如权利要求18所述的方法，其中，所述突变是所述TAD结构域的错义突变。
23. 如权利要求22所述的方法，其中，所述突变是在人NOTCH1基因的6733位核苷酸处 的替换。
24. 如权利要求23所述的方法，其中，所述突变是在人NOTCH1基因的6733位核苷酸处 替换为腺嘌呤（A)或胞嘧啶（C)。
25. 如权利要求22所述的方法，其中，所述突变是在人NOTCH1基因的6788位核苷酸处 的替换。
26. 如权利要求25所述的方法，其中，所述突变是在人NOTCH1基因的6788位核苷酸处 替换为腺嘌呤（A)。
27. 如权利要求18所述的方法，其中，所述突变是在人NOTCH3基因的6622位的插入。
28. 如权利要求27所述的方法，其中，所述突变是在人NOTCH3基因的6622位的胞嘧啶 (C)插入（B37突变）。
29. 如权利要求18所述的方法，其中，所述突变是在人NOTCH3基因的6096位的插入。
30. 如权利要求29所述的方法，其中，所述突变是在人NOTCH3基因的6096位的胞嘧啶 (C)插入。
31. 如权利要求14?30中任一项所述的方法，其中，使用抗NOTCH抗体或在严格条件 下与具有所述突变的NOTCH多核苷酸杂交的核酸探针来确定所述突变的存在。
32. 如权利要求31所述的方法，其中，所述抗体或核酸探针带有可检测的标记。
33. 如权利要求32所述的方法，其中，所述标记选自由免疫荧光标记、化学发光标记、 磷光标记、酶标记、放射性标记、抗生物素蛋白/生物素、胶体金颗粒、有色颗粒和磁性颗粒 组成的组。
34. 如权利要求14?33中任一项所述的方法，其中，通过放射性免疫测定、蛋白质印迹 测定、免疫荧光测定、酶免疫测定、免疫沉淀测定、化学发光测定、免疫组织化学测定、斑点 印迹测定或狭缝印迹测定来确定所述突变的存在。
35. 如权利要求14?30中任一项所述的方法，其中，通过RT-PCR来确定所述突变的存 在。
36. 如权利要求14?33中任一项所述的方法，其中，通过微阵列来确定所述突变的存 在。
37. 如权利要求14?30中任一项所述的方法，其中，通过直接核酸测序来确定所述突 变的存在。
38. -种对癌症患者群体分阶以用NOTCH抑制剂进行治疗的方法，所述方法包括：(a) 确定来自所述患者的肿瘤细胞是否含有人NOTCH受体的PEST结构域或TAD结构域的激活 性突变，和（b)基于所述突变的存在或不存在将所述患者群体分阶。
39. -种选择患者以用NOTCH抑制剂进行治疗的方法，所述方法包括：(a)确定来自所 述患者的肿瘤细胞是否含有人NOTCH受体的PEST结构域或TAD结构域的激活性突变，和 (b)选择出其肿瘤细胞含有所述突变的患者。
40. -种确定被诊断为患有癌症的患者是否可能对基于NOTCH抑制剂的治疗产生响应 的方法，所述方法包括确定来自所述患者的肿瘤细胞是否含有人NOTCH受体的PEST结构域 或TAD结构域的激活性突变的步骤，其中，所述突变的存在表明所述患者可能对治疗产生 响应。
41. 一种确定是否应该向被诊断为患有癌症的患者施用NOTCH抑制剂的方法，所述方 法包括确定来自所述患者的肿瘤细胞是否含有人NOTCH受体的PEST结构域或TAD结构域 的激活性突变，其中，所述突变的存在预示着所述患者对NOTCH抑制剂治疗具有有利的响 应。
42. -种确定被诊断为患有癌症的患者是否应该继续用NOTCH抑制剂进行治疗的方 法，所述方法包括确定来自所述患者的肿瘤细胞是否含有人NOTCH受体的PEST结构域或 TAD结构域的激活性突变，其中，任一突变的存在表明所述患者可能对治疗产生响应，其中， 所述突变的存在预示着所述患者对所述NOTCH抑制剂的治疗具有有利的响应。
43. -种确定NOTCH抑制剂在治疗患者的癌症中的治疗功效的方法，所述方法包括确 定来自所述患者的肿瘤细胞是否含有人NOTCH受体的PEST结构域或TAD结构域的激活性 突变，其中，所述突变的存在表明所述NOTCH抑制剂具有治疗功效。
44. 如权利要求38?43中任一项所述的方法，其中，所述突变增加 NOTCH信号传导。
45. 如权利要求38?44中任一项所述的方法，其中，来自所述患者的肿瘤细胞中的至 少约0. 1 %、至少约1 %、至少约2%或至少约5%包含所述突变。
46. 如权利要求38?45中任一项所述的方法，其中，所述NOTCH受体是N0TCH1或 N0TCH3。
47. 如权利要求38?46中任一项所述的方法，其中，所述突变是错义、无义或移码突 变。
48. 如权利要求47所述的方法，其中，所述突变是所述PEST结构域的移码或无义突变。
49. 如权利要求48所述的方法，其中，所述突变是在人N0TCH1基因的7279位核苷酸处 的缺失。
50. 如权利要求49所述的方法，其中，所述突变是在人N0TCH1基因的7279位核苷酸处 的鸟嘌呤（G)缺失（B40突变）。
51. 如权利要求47所述的方法，其中，所述突变是所述TAD结构域的错义突变。
52. 如权利要求51所述的方法，其中，所述突变是在人N0TCH1基因的6733位核苷酸处 的替换。
53. 如权利要求52所述的方法，其中，所述突变是在人N0TCH1基因的6733位核苷酸处 替换为腺嘌呤（A)或胞嘧啶（C)。
54. 如权利要求51所述的方法，其中，所述突变是在人N0TCH1基因的6788位核苷酸处 的替换。
55. 如权利要求54所述的方法，其中，所述突变是在人N0TCH1基因的6788位核苷酸处 替换为腺嘌呤（A)。
56. 如权利要求48所述的方法，其中，所述突变是在人N0TCH3基因的6622位的插入。
57. 如权利要求56所述的方法，其中，所述突变是在人N0TCH3基因的6622位的胞嘧啶 (C)插入（B37突变）。
58. 如权利要求48所述的方法，其中，所述突变是在人N0TCH3基因的6096位的插入。
59. 如权利要求58所述的方法，其中，所述突变是在人N0TCH3基因的6096位的胞嘧啶 (C)插入。
60. 如权利要求38?59中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述患者获得身体样 品。
61. 如权利要求60所述的方法，其中，所述样品是全血、血浆、血清或组织。
62. 如权利要求38?61中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自由以下癌组成的组： 肺癌、胃肠道癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾脏癌、前列腺癌、甲状腺癌、 成神经细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、子宫颈癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、黑 素瘤、胆道癌以及头颈癌。
63. 如权利要求62所述的方法，其中，所述癌症是乳腺癌。
64. 如权利要求38?63中任一项所述的方法，其中，使用抗NOTCH抗体或在严格条件 下与具有所述突变的NOTCH多核苷酸杂交的核酸探针来确定所述突变的存在。
65. 如权利要求38?94中任一项所述的方法，其中，所述抗体或核酸探针带有可检测 的标记。
66. 如权利要求65所述的方法，其中，所述标记选自由免疫突光标记、化学发光标记、 磷光标记、酶标记、放射性标记、抗生物素蛋白/生物素、胶体金颗粒、有色颗粒和磁性颗粒 组成的组。
67. 如权利要求38?66中任一项所述的方法，其中，通过放射性免疫测定、蛋白质印迹 测定、免疫荧光测定、酶免疫测定、免疫沉淀测定、化学发光测定、免疫组织化学测定、斑点 印迹测定或狭缝印迹测定来确定所述突变的存在。
68. 如权利要求38?67中任一项所述的方法，其中，通过RT-PCR来确定所述突变的存 在。
69. 如权利要求38?67中任一项所述的方法，其中，通过微阵列来确定所述突变的存 在。
70. 如权利要求38?63中任一项所述的方法，其中，通过直接核酸测序来确定所述突 变的存在。
71. 如权利要求38?70中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述患者施用NOTCH 抑制剂。
72. 如权利要求38?71中任一项所述的方法，其中，所述NOTCH抑制剂是γ-分泌酶 抑制剂或抗NOTCH抗体。
73. 如权利要求72所述的方法，其中，所述γ-分泌酶抑制剂选自由以下物质组成的 组：III-31-C ;N-[N-(3, 5-二氟苯乙酰基）_L_丙氨酰基]S-苯基甘氨酸叔丁基酯）（DAPT); 化合物E ;D_螺旋肤294 ;异香?素；BOC-Lys (Cbz) Ile-Leu-环氧化物；和（Z_LL)2-丽。
74. 如权利要求72所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体是抗N0TCH1抗体。
75. 如权利要求74所述的方法，其中，所述抗N0TCH1抗体阻断配体与N0TCH1受体的结 合。
76. 如权利要求74所述的方法，其中，所述抗N0TCH1抗体阻断对N0TCH1受体的切割。
77. 如权利要求76所述的方法，其中，所述抗N0TCH1抗体包含：含有CDR氨基酸序列 CDR1(SEQ ID N0:5)、CDR2(SEQ ID N0:6)和 CDR3(SEQ ID N0:7)的重链可变区，和含有 CDR 氨基酸序列 CDR1(SEQ ID N0:8)、CDR2(SEQ ID N0:9)和 CDR3(SEQ ID N0:10)的轻链可变 区。
78. 如权利要求72所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体是抗N0TCH3抗体。
79. 如权利要求78所述的方法，其中，所述抗N0TCH3抗体阻断配体与N0TCH3受体的结 合。
80. 如权利要求78所述的方法，其中，所述抗N0TCH3抗体阻断对N0TCH3受体的切割。
81. 如权利要求80所述的方法，其中，所述抗N0TCH3抗体包含：含有CDR氨基酸序列 CDR1(SEQ ID N0:23)、CDR2(SEQ ID N0:24)和 CDR3(SEQ ID N0:25)的重链可变区，和含有 CDR 氨基酸序列 CDR1(SEQ ID N0:26)、CDR2(SEQ ID N0:27)和 CDR3(SEQ ID N0:28)的轻 链可变区。
82. 如权利要求38?81中任一项所述的方法，其中，所述患者是人。
83. -种治疗具有实体瘤的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有 效量的N0TCH1抑制剂，其中，所述患者中的至少一个实体瘤细胞包含人N0TCH1基因中的激 活性突变。
84. -种治疗具有乳腺肿瘤的患者的乳腺癌的方法，所述方法包括向所述患者施用治 疗有效量的N0TCH1抑制剂，其中，所述患者中的至少一个乳腺肿瘤细胞包含人N0TCH1基因 中的激活性突变。
85. -种治疗具有实体瘤的患者的癌症的方法，所述方法包括：a)确定来自所述患者 的肿瘤细胞是否含有人N0TCH1受体的激活性突变；和b)向所述患者施用治疗有效量的 N0TCH1抑制剂。
86. 如权利要求83?85中任一项所述的方法，其中，所述激活性突变是PEST结构域突 变。
87. 如权利要求83?85中任一项所述的方法，其中，所述激活性突变是TAD结构域突 变。
88. 如权利要求83?87中任一项所述的方法，其中，所述突变增加 NOTCH信号传导。
89. 如权利要求88所述的方法，其中，所述突变包括在人N0TCH1基因的7279位核苷酸 处的鸟嘌呤缺失。
90. 如权利要求88所述的方法，其中，所述突变包括在人N0TCH1基因的6733位核苷酸 处替换为腺嘌呤（A)或胞嘧啶（C)。
91. 如权利要求88所述的方法，其中，所述突变包括在人N0TCH1基因的6788位核苷酸 处替换为腺嘌呤（A)。
92. -种治疗具有实体瘤的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有 效量的N0TCH3抑制剂，其中，所述患者中的至少一个实体瘤细胞包含人N0TCH3基因中的激 活性突变。
93. -种治疗具有乳腺肿瘤的患者的乳腺癌的方法，所述方法包括向所述患者施用治 疗有效量的N0TCH3抑制剂，其中，所述患者中的至少一个乳腺肿瘤细胞包含人N0TCH3基因 中的激活性突变。
94. 一种治疗具有实体瘤的患者的癌症的方法，所述方法包括：a)确定来自所述患者 的肿瘤细胞是否含有人N0TCH3受体的激活性突变；和b)向所述患者施用治疗有效量的 N0TCH3抑制剂。
95. 如权利要求92?94中任一项所述的方法，其中，所述激活性突变是PEST结构域突 变。
96. 如权利要求92?95中任一项所述的方法，其中，所述突变增加 NOTCH信号传导。
97. 如权利要求96所述的方法，其中，所述突变包括在人N0TCH3基因的6622位的胞嘧 陡插入。
98. 如权利要求96所述的方法，其中，所述突变包括在人N0TCH3基因的6096位的胞嘧 陡插入。
99. 如权利要求83?98中任一项所述的方法，其中，来自所述患者的肿瘤细胞中的至 少约0. 1 %、至少约1 %、至少约2%或至少约5%包含所述突变。
100. 如权利要求83?91中任一项所述的方法，其中，所述N0TCH1抑制剂是γ -分泌 酶抑制剂或抗N0TCH1抗体。
101. 如权利要求100所述的方法，其中，所述分泌酶抑制剂选自由以下物质组成的 组：III-31-C ;N-[N-(3, 5-二氟苯乙酰基）_L_丙氨酰基]S-苯基甘氨酸叔丁基酯）（DAPT); 化合物E ;D_螺旋肤294 ;异香?素；BOC-Lys(Cbz) Ile-Leu-环氧化物；和（Z_LL)2-丽。
102. 如权利要求100所述的方法，其中，所述抗N0TCH1抗体阻断配体与N0TCH1受体的 结合。
103. 如权利要求100所述的方法，其中，所述抗N0TCH1抗体阻断对N0TCH1受体的切 割。
104. 如权利要求103所述的方法，其中，所述抗N0TCH1抗体包含：含有CDR氨基酸序 列 CDR1(SEQ ID N0:5)、CDR2(SEQ ID N0:6)和 CDR3(SEQ ID N0:7)的重链可变区，和含有 CDR 氨基酸序列 CDR1(SEQ ID N0:8)、CDR2(SEQ ID N0:9)和 CDR3(SEQ ID N0:10)的轻链 可变区。
105. 如权利要求92?98中任一项所述的方法，其中，所述N0TCH3抑制剂选自由γ-分 泌酶抑制剂或抗N0TCH3抗体组成的组。
106. 如权利要求105所述的方法，其中，所述Υ-分泌酶抑制剂选自由以下物质组成的 组：III-31-C ;Ν-[Ν-(3, 5-二氟苯乙酰基）_L_丙氨酰基]S-苯基甘氨酸叔丁基酯）（DAPT); 化合物E ;D_螺旋肤294 ;异香?素；BOC-Lys (Cbz) Ile-Leu-环氧化物；和（Z_LL)2-丽。
107. 如权利要求105所述的方法，其中，所述抗N0TCH3抗体阻断配体与N0TCH3受体的 结合。
108. 如权利要求105所述的方法，其中，所述抗N0TCH3抗体阻断对N0TCH3受体的切 割。
109. 如权利要求107所述的方法，其中，所述抗NOTCH3抗体包含：含有CDR氨基酸序 列 CDR1(SEQ ID NO:23)、CDR2(SEQ ID NO:24)和 CDR3(SEQ ID NO:25)的重链可变区，和含 有 CDR 氨基酸序列 CDR1(SEQ ID NO:26)、CDR2(SEQ ID NO:27)和 CDR3(SEQ ID NO:28)的 轻链可变区。
110. 如权利要求83?109中任一项所述的方法，其中，所述患者是人。
111. 如权利要求83?110中任一项所述的方法，其中，所述患者包含三阴性乳腺癌细 胞。
112. 如权利要求83?111中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括施用第二治疗 剂。
113. 如权利要求83?112中任一项所述的方法，其中，所述患者之前进行癌症治疗失 败。
114. 如权利要求83?113中任一项所述的方法，其中，所述患者具有化学治疗抗性乳 腺癌。
115. -种鉴定测试化合物的方法，所述测试化合物抑制突变的NOTCH受体的存在所诱 导的异常细胞生长，所述方法包括：(a)使所述测试化合物与表达由权利要求1?10中任 一项所述的多核苷酸编码的突变NOTCH受体的细胞一起温育，所述温育在γ -分泌酶的存 在下进行；(b)将步骤（a)中的受体活性的量与在不存在所述测试化合物时进行的温育的 活性进行比较，其中，如果在存在所述测试化合物时观察到的活性小于在不存在所述测试 化合物时观察到的活性，则所述测试化合物抑制细胞生长。
116. -种试剂盒，所述试剂盒包含至少一种用于特异性地检测本发明的突变NOTCH受 体的试剂。
117. 如权利要求116所述的试剂盒，其中，所述试剂是结合本发明的突变NOTCH受体的 抗体或核酸探针。
118. -种选择癌症患者以用N0TCH1抑制剂进行治疗的方法，所述方法包括：(a)用抗 N0TCH1ICD抗体在免疫组织化学测定中确定来自所述患者的实体瘤细胞中的N0TCH1ICD水 平；和（b)选择其实体瘤细胞在所述测定中得到的Η分数为约30以上的患者以进行治疗。
119. 一种选择癌症患者以用NOTCH抑制剂进行治疗的方法，所述方法包括：(a)确定来 自所述患者的实体瘤细胞中的NOTCH ICD水平；和（b)选择其实体瘤细胞的NOTCH ICD水 平高于参照水平的患者以进行治疗。
120. -种确定被诊断为患有癌症的患者是否可能对基于NOTCH抑制剂的治疗产生响 应的方法，所述方法包括确定来自所述患者的实体瘤细胞中的NOTCH ICD水平的步骤，其 中，高于参照水平的NOTCH ICD水平表示所述患者可能对治疗产生响应。
121. -种确定是否应该向被诊断为患有癌症的患者施用NOTCH抑制剂的方法，所述方 法包括确定来自所述患者的实体瘤细胞中的NOTCH I⑶水平，其中，高于参照水平的NOTCH ICD水平预示着所述患者对NOTCH抑制剂治疗具有有利的响应。
122. -种确定被诊断为患有癌症的患者是否应该继续用NOTCH抑制剂进行治疗的方 法，所述方法包括确定来自所述患者的实体瘤细胞中的NOTCH I⑶水平，其中，高于参照水 平的NOTCH ICD水平表示所述患者可能对用所述NOTCH抑制剂进行的治疗产生响应。
123. -种确定NOTCH抑制剂在治疗患者的癌症中的治疗功效的方法，所述方法包括确 定来自所述患者的实体瘤细胞中的NOTCH ICD水平，其中，高于参照水平的NOTCH ICD水平 表示所述NOTCH抑制剂具有治疗功效。
124. 如权利要求118?123中任一项所述的方法，其中，所述NOTCH I⑶是N0TCH1I⑶ 或 N0TCH3ICD。
125. 如权利要求118?124中任一项所述的方法，其中，所述NOTCH I⑶的水平是肿瘤 细胞的细胞核中的水平。
126. 如权利要求118?125中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述患者获得身 体样品。
127. 如权利要求126所述的方法，其中，所述样品是全血、血浆、血清或组织。
128. 如权利要求118?127中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自由以下癌组成的 组：肺癌、胃肠道癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾脏癌、前列腺癌、甲状腺 癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、子宫颈癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、 黑素瘤、胆道癌以及头颈癌。
129. 如权利要求128所述的方法，其中，所述癌症是乳腺癌。
130. 如权利要求128所述的方法，其中，所述癌症是小细胞癌、小细胞肺癌、胃癌、食管 癌、肝细胞癌或胆管上皮癌。
131. 如权利要求118?130中任一项所述的方法，其中，使用与NOTCH I⑶特异性结合 的试剂来确定NOTCH I⑶水平。
132. 如权利要求131所述的方法，其中，所述试剂是抗NOTCH ICD抗体。
133. 如权利要求132所述的方法，其中，所述抗NOTCH ICD抗体是多克隆抗体或单克隆 抗体。
134. 如权利要求131?133中任一项所述的方法，其中，所述试剂带有可检测的标记。
135. 如权利要求134所述的方法，其中，所述标记选自由免疫突光标记、化学发光标 记、磷光标记、酶标记、放射性标记、抗生物素蛋白/生物素、胶体金颗粒、有色颗粒和磁性 颗粒组成的组。
136. 如权利要求118?135中任一项所述的方法，其中，所述NOTCH I⑶水平通过放射 性免疫测定、免疫荧光测定、酶免疫测定、化学发光测定或免疫组织化学测定来确定。
137. 如权利要求118?135中任一项所述的方法，其中，所述NOTCH I⑶水平由Η分数 来表征。
138. 如权利要求118?137中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述患者施用 NOTCH抑制剂。
139. -种治疗具有实体瘤的患者的癌症的方法，所述方法包括： (a) 确定所述实体瘤细胞中的NOTCH ICD水平；和 (b) 向所述患者施用治疗有效量的NOTCH抑制剂。
140. 如权利要求118?139中任一项所述的方法，其中，所述NOTCH抑制剂是γ-分泌 酶抑制剂或抗NOTCH抗体。
141. 如权利要求140所述的方法，其中，所述γ-分泌酶抑制剂选自由以下物质组成的 组：III-31-C ;Ν-[Ν-(3, 5-二氟苯乙酰基）_L_丙氨酰基]S-苯基甘氨酸叔丁基酯）（DAPT); 化合物E ;D_螺旋肤294 ;异香?素；BOC-Lys (Cbz) Ile-Leu-环氧化物；和（Z_LL)2-丽。
142. 如权利要求140所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体是抗N0TCH11抗体。
143. 如权利要求142所述的方法，其中，所述抗N0TCH1抗体阻断配体与N0TCH1受体的 结合。
144. 如权利要求142所述的方法，其中，所述抗N0TCH1抗体阻断对N0TCH1受体的切 割。
145. 如权利要求144所述的方法，其中，所述抗N0TCH1抗体包含：含有CDR氨基酸序 列 CDR1(SEQ ID N0:5)、CDR2(SEQ ID N0:6)和 CDR3(SEQ ID N0:7)的重链可变区，和含有 CDR 氨基酸序列 CDR1(SEQ ID N0:8)、CDR2(SEQ ID N0:9)和 CDR3(SEQ ID N0:10)的轻链 可变区。
146. 如权利要求140所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体是抗N0TCH3抗体。
147. 如权利要求146所述的方法，其中，所述抗N0TCH3抗体阻断配体与N0TCH3受体的 结合。
148. 如权利要求146所述的方法，其中，所述抗N0TCH3抗体阻断对N0TCH3受体的切 割。
149. 如权利要求148所述的方法，其中，所述抗N0TCH3抗体包含：含有CDR氨基酸序 列 CDR1(SEQ ID N0:23)、CDR2(SEQ ID N0:24)和 CDR3(SEQ ID N0:25)的重链可变区，和含 有 CDR 氨基酸序列 CDR1(SEQ ID N0:26)、CDR2(SEQ ID N0:27)和 CDR3(SEQ ID N0:28)的 轻链可变区。
150. 如权利要求118?149中任一项所述的方法，其中，所述患者是人。
151. -种治疗具有实体瘤的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有 效量的N0TCH1抑制剂，其中，所述患者中的实体瘤细胞的N0TCH1ICD水平高于参照水平。
152. 如权利要求151所述的方法，其中，所述N0TCH1抑制剂是γ -分泌酶抑制剂或抗 N0TCH1 抗体。
153. 如权利要求152所述的方法，其中，所述γ-分泌酶抑制剂选自由以下物质组成的 组：III-31-C ;N-[N-(3, 5-二氟苯乙酰基）_L_丙氨酰基]S-苯基甘氨酸叔丁基酯）（DAPT); 化合物E ;D_螺旋肤294 ;异香?素；BOC-Lys(Cbz) Ile-Leu-环氧化物；和（Z_LL)2-丽。
154. 如权利要求152所述的方法，其中，所述抗N0TCH1抗体阻断配体与N0TCH1受体的 结合。
155. 如权利要求152所述的方法，其中，所述抗N0TCH1抗体阻断对N0TCH1受体的切 割。
156. 如权利要求155所述的方法，其中，所述抗N0TCH1抗体包含：含有CDR氨基酸序 列 CDR1(SEQ ID N0:5)、CDR2(SEQ ID N0:6)和 CDR3(SEQ ID N0:7)的重链可变区，和含有 CDR 氨基酸序列 CDR1(SEQ ID N0:8)、CDR2(SEQ ID N0:9)和 CDR3(SEQ ID N0:10)的轻链 可变区。
157. 如权利要求151?156中任一项所述的方法，其中，所述患者是人。
158. 如权利要求151?157中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括施用第二治疗 剂。
159. 如权利要求151?158中任一项所述的方法，其中，所述患者之前进行癌症治疗失 败。
160. 如权利要求151?159中任一项所述的方法，其中，所述患者包含三阴性乳腺癌细 胞。
161. 如权利要求151?160中任一项所述的方法，其中，所述患者具有化学治疗抗性乳 腺癌。
162. 如权利要求151?159中任一项所述的方法，其中，所述患者具有乳腺癌、小细胞 癌、小细胞肺癌、胃癌、食管癌、肝细胞癌或胆管上皮癌。
163. 如权利要求139?150中任一项所述的方法，其中，使用与NOTCH I⑶特异性结合 的试剂来确定NOTCH I⑶水平。
164. 如权利要求163所述的方法，其中，所述试剂是抗NOTCH ICD抗体。
165. 如权利要求164所述的方法，其中，所述抗NOTCH ICD抗体是多克隆抗体或单克隆 抗体。
166. 如权利要求163?165中任一项所述的方法，其中，所述试剂带有可检测的标记。
167. 如权利要求166所述的方法，其中，所述标记选自由免疫突光标记、化学发光标 记、磷光标记、酶标记、放射性标记、抗生物素蛋白/生物素、胶体金颗粒、有色颗粒和磁性 颗粒组成的组。
168. 如权利要求139?150或163?167中任一项所述的方法，其中，所述N0TCHI⑶ 水平通过放射性免疫测定、免疫荧光测定、酶免疫测定、化学发光测定或免疫组织化学测定 来确定。
169. 如权利要求139?150或163?167中任一项所述的方法，其中，所述N0TCHI⑶ 水平由Η分数来表征。
170. 如权利要求139-145、150或163-169中任一项所述的方法，其中，（a)所述NOTCH I⑶是N0TCH1I⑶，（b)所述NOTCH抑制剂是N0TCH1抑制剂，并且（c)确定所述实体瘤细胞 在使用抗N0TCH1I⑶抗体进行的免疫组织化学测定中的Η分数为约30以上。
171. 如权利要求139?145、150或163?170中任一项所述的方法，其中，所述患者具 有乳腺癌、小细胞癌、小细胞肺癌、胃癌、食管癌、肝细胞癌或胆管上皮癌。
172. 如权利要求118?145、150或163-170中任一项所述的方法，其中，所述患者之前 进行癌症治疗失败。
173. 如权利要求129或131?145、150或163?170中任一项所述的方法，其中，所述 癌症是三阴性乳腺癌和/或化学治疗抗性乳腺癌。
174. 如权利要求118?138或151?162中任一项所述的方法，其中，所述参照水平由 Η分数来表征。
175. 如权利要求151?162中任一项所述的方法，其中，所述患者中的实体瘤细胞的特 征在于：在使用抗N0TCH1ICD抗体进行的免疫组织化学测定中，Η分数为约30以上。
176. 如权利要求118?145、150?173或175中任一项所述的方法，其中，所述NOTCH 抑制剂是包含重链可变区序列SEQIDN0:14和轻链可变区序列SEQIDN0:18的抗N0TCH1 抗体。
177. 如权利要求176所述的方法，其中，所述NOTCH抑制剂是0MP-52M51。
178. 如权利要求83?91、99-104或110-114中任一项所述的方法，其中，所述患者具 有乳腺癌、小细胞癌、小细胞肺癌、胃癌、食管癌、肝细胞癌或胆管上皮癌。
【文档编号】C07H21/00GK104105702SQ201280067236
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2012年11月14日 优先权日:2011年11月16日
【发明者】J·A·卡隐, 汪敏, A·M·卡保恩, T·C·霍伊 申请人:昂考梅德药品有限公司