Stub1基因突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了STUB1基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码STUB1突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法，筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的系统，以及用于筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的试剂盒。其中，该分离的编码STUB1突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.737C>T突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调症。
【专利说明】STUB1基因突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及STUB1基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离编码STUB1突 变体的核酸，分离的多肤，筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法， 筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的系统，用于筛选易患性腺发育不 全合并小脑共济失调症的生物样品的试剂盒，构建体W及重组细胞。
【背景技术】
[0002] 性腺发育不全合并小脑共济失调是一类临床罕见的综合征，其常表现为隐性遗传 模式或者散发，其发病特点包括：1、病人幼儿或青春期起病；2、病人主要表现为性腺发育 不全，不育，及逐渐进展的行走不稳；3、可合并其他症状如；痴呆、视网膜色素变性、脑白质 病变、锥体束受损、耳聋等，也可不合并上述症状；4、辅助检查结果可发现相关病人可表现 为低促性腺激素分泌不全性性腺发育不全或者高促性腺激素分泌不全性性腺发育不全，头 部MRI或者CT往往合并小脑萎缩。本类疾病自100余年前被英国著名学者Gordon化Imes 描述过之后，不断被报道，但相关机制尚不明确，致病基因的相关报道较少。
[0003] 因而，目前对性腺发育不全合并小脑共济失调症的研究尤其是致病基因的确定仍 有待深入。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种能够有效筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法。
[0005] 本发明是基于发明人的下列工作完成的；发明人通过外显子组测序联合候选基因 突变验证的方法确定了性腺发育不全合并小脑共济失调症的一个致病基因及其突变一 STUB1基因的C. 7370T突变。
[0006] 根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码STUB1突变体的核酸。根 据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID N0;1相比，具有C. 7370T突变，即相对于野生型 STUB1基因，本发明的STUB1基因突变体的第737位碱基从C突变为T。根据本发明的实施 例，发明人确定了 STUB1基因的突变体，该突变体与性腺发育不全合并小脑共济失调症的 发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可W有效地检测生物样品 是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调症。
[0007] 根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肤。根据本发明的实施例，与 SEQ ID NO ;2相比，所述分离的多肤具有P. T246M突变，即该突变是由于C. 7370T的杂合错 义突变而引起的，具体地，相对于野生型STUB1，本发明的分离的多肤（即STUB1突变体）的 第246位T突变为M。通过检测生物样品中是否表达该多肤，可W有效地检测生物样品是否 易患性腺发育不全合并小脑共济失调症。
[0008] 根据本发明的第H方面，本发明提出了一种筛选易患性腺发育不全合并小脑共济 失调症的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括W下步骤：从所述生物样品提 取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO ;1相 比，具有C. 7370T突变是所述生物样品易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的指示。通 过根据本发明实施例的筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法，可 W有效地筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品。
[0009] 根据本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选易患性腺发育不全合并小脑共济 失调症的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括；核酸提取装置，所述核酸提 取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与 所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，W便确定所述核酸样本的核酸序 列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，W便基于所述核酸样本的核酸 序列与SEQ ID N0;1相比，是否具有C.7370T突变，判断所述生物样品是否易患性腺发育 不全合并小脑共济失调症。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易患性腺发育不全合并 小脑共济失调症的生物样品的方法，从而可W有效地筛选易患性腺发育不全合并小脑共济 失调症的生物样品。
[0010] 根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易患性腺发育不全合并小脑 共济失调症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测STUB1基 因突变体的试剂，其中与SEQ ID N0;1相比，该STUB1基因突变体具有C. 7370T突变。利 用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症 的生物样品。
[0011] 根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构 建体包含前面所述的分离的编码STUB1突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受 体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗性腺发育不全合并小脑共济失调症的药 物。
[0012] 根据本发明的第走方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该 重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利 用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗性腺发育不全合并小脑共济失调症的药物。
[0013] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中：
[0015] 图1显示了根据本发明实施例的筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的 生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，
[0016] 图1A为根据本发明实施例的筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物 样品的系统的示意图，
[0017] 图1B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，
[0018] 图1C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；
[0019] 图2显示了根据本发明一个实施例的性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家 系的家系图；
[0020] 图3显示了根据本发明的一个实施例，性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家 系中患者及家系内正常人的STUB1基因C. 7370T突变位点的Sanger测序验证峰图；
[0021] 图4显示了根据本发明的一个实施例，STUB1蛋白第246位氨基酸位点在不同种 群间的序列保守性分析结果。
【具体实施方式】
[0022] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0023] STUB1基因突变体
[0024] 根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码STUB1突变体的核酸。根 据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID N0;1相比，具有C. 7370T突变。该突变位点在人 类参考基因组hgl9的位置为C虹16 =732232。在本文中所使用的表达方式"编码STUB1突 变体的核酸"，是指与编码STUB1突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别 限制，可W是任何包含与STUB1突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核巧酸和/或核糖核 巧酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编 码STUB1突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了 STUB1基因的突变体， 该突变体与性腺发育不全合并小脑共济失调症的发病密切相关，从而通过检测该突变体在 生物样品中是否存在，可W有效地检测生物样品是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调 症，也可W通过检测该突变体在生物体中是否存在，可W有效地预测生物体是否易患性腺 发育不全合并小脑共济失调症。
[0025] 对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包 括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况 下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID N0:1，实际 包括其互补序列。本领域技术人员还可W理解，利用一条链可W检测另一条链，反之亦然。
[0026] 该编码STUB1突变体的核酸，是本申请的发明人通过外显子组测序联合候选基因 突变验证的方法确定的性腺发育不全合并小脑共济失调症的致病基因STUB1及其致病突 变。该致病基因及致病突变位点在现有技术中并未被提到。
[0027] 其中，野生型STUB1基因的cDNA具有如下所示的核巧酸序列：
[002引 ATGAAGGGCAAGGAGGAGAAGGAGGGCGGCGCACGGCTGGGCGCTGGCGGCGGAAGCCCCGAGAAGAGC CCGAGCGCGCAGGAGCTCAAGGAGCAGGGCAATCGTCTGTTCGTGGGCCGAAAGTACCCGGAGGCGGCGGCCTGCTA CGGCCGCGCGATCACCCGGAACCCGCTGGTGGCCGTGTATTACACCAACCGGGCCTTGTGCTACCTGAAGATGCAGC AGCACGAGCAGGCCCTGGCCGACTGCCGGCGCGCCCTGGAGCTGGACGGGCAGTCTGTGAAGGCGCACTTCTTCCTG GGGCAGTGCCAGCTGGAGATGGAGAGCTATGATGAGGCCATCGCCAATCTGCAGCGAGCTTACAGCCTGGCCAAGGA GCAGCGGCTGAACTTCGGGGACGACATCCCCAGCGCTCTTCGAATCGCGAAGAAGAAGCGCTGGAACAGCATTGAGG AGCGGCGCATCCACCAGGAGAGCGAGCTGCACTCCTACCTCTCCAGGCTCATTGCCGCGGAGCGTGAGAGGGAGCTG GAAGAGTGCCAGCGAAACCACGAGGGTGATGAGGACGACAGCCACGTCCGGGCCCAGCAGGCCTGCATTGAGGCCAA GCACGACAAGTACATGGCGGACATGGACGAGCTTTTTTCTCAGGTGGATGAGAAGAGGAAGAAGCGAGACATCCCCG ACTACCTGTGTGGCAAGATCAGCTTTGAGCTGATGCGGGAGCCGTGCATCACGCCCAGTGGCATCACCTACGACCGC AAGGACATCGAGGAGCACCTGCAGCGTGTGGGTCATTTTGACCCCGTGACCCGGAGCCCCCTGACCCAGGAACAGCT CATCCCCAACTTGGCTATGAAGGAGGTTATTGACGCATTCATCTCTGAGAATGGCTGGGTGGAGGACTACTGA
[0029] 佛 QIDNOa)，
[0030] 其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：
[0031] MKGK邸KEGGA化GAGGGSP邸SPSA犯L邸QGN化FVG服YPEAAACYGRAITRNPLVAVYYTNRAL CYLKMQQHEQALADCRRALELDGQSVKAHF化GQCQLEMESYDEAIANLQRAYSLA邸QRLNFGDDIPSALRIAKK KRWNSIEERRI册ES化HS化SRLIAAERERELEECQRN肥GD抓DSHVRAQQACIEAKHDKYMADM呢LFSQVD 邸服邸DIPDYLCGKISFELMREPCITPSGITYD 服DI 邸HLQRVGH 抑 PVTRS化 TQEQLIPNLAMKEVIDAFI SENGWVEDY(SEQ ID NO ：2)〇
[003引本发明的STUB1基因突变体的cDNA序列如下所示：
[003引 ATGAAGGGCAAGGAGGAGAAGGAGGGCGGCGCACGGCTGGGCGCTGGCGGCGGAAGCCCCGAGAAGAGC CCGAGCGCGCAGGAGCTCAAGGAGCAGGGCAATCGTCTGTTCGTGGGCCGAAAGTACCCGGAGGCGGCGGCCTGCTA CGGCCGCGCGATCACCCGGAACCCGCTGGTGGCCGTGTATTACACCAACCGGGCCTTGTGCTACCTGAAGATGCAGC AGCACGAGCAGGCCCTGGCCGACTGCCGGCGCGCCCTGGAGCTGGACGGGCAGTCTGTGAAGGCGCACTTCTTCCTG GGGCAGTGCCAGCTGGAGATGGAGAGCTATGATGAGGCCATCGCCAATCTGCAGCGAGCTTACAGCCTGGCCAAGGA GCAGCGGCTGAACTTCGGGGACGACATCCCCAGCGCTCTTCGAATCGCGAAGAAGAAGCGCTGGAACAGCATTGAGG AGCGGCGCATCCACCAGGAGAGCGAGCTGCACTCCTACCTCTCCAGGCTCATTGCCGCGGAGCGTGAGAGGGAGCTG GAAGAGTGCCAGCGAAACCACGAGGGTGATGAGGACGACAGCCACGTCCGGGCCCAGCAGGCCTGCATTGAGGCCAA GCACGACAAGTACATGGCGGACATGGACGAGCTTTTTTCTCAGGTGGATGAGAAGAGGAAGAAGCGAGACATCCCCG ACTACCTGTGTGGCAAGATCAGCTTTGAGCTGATGCGGGAGCCGTGCATCATGCCCAGTGGCATCACCTACGACCGC AAGGACATCGAGGAGCACCTGCAGCGTGTGGGTCATTTTGACCCCGTGACCCGGAGCCCCCTGACCCAGGAACAGCT CATCCCCAACTTGGCTATGAAGGAGGTTATTGACGCATTCATCTCTGAGAATGGCTGGGTGGAGGACTACTGA
[0034] (SEQ ID NO ：3),
[0035] 其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：
[0036] MKGK邸KEGGA化GAGGGSP邸SPSA犯L邸QGN化FVG服YPEAAACYGRAITRNPLVAVYYTNRAL CYLKMQQHEQALADCRRALELDGQSVKAHF化GQCQLEMESYDEAIA化QRAYSLAKEQ化NFGDDIPSALRIAKK KRWNSI邸RRIH犯SELHSYLS化IAAERERELEECQRNHEGD抓DSHVRAQQACIEAKHDKYMADM呢LFSQVD 邸服邸DIPDYLCGKISFELMREPCIMPSGITYD 服DI 邸HLQRVGH 抑 PVTRS化 TQEQLIPNLAMKEVIDAFI SENGWVEDY(SEQ ID NO ：4)〇
[0037] 发明人发现的STUBl基因突变体与SEQ ID NO ;1相比，具有c. 737C〉T突变，即相 对于野生型STUB1基因，本发明的STUB1基因突变体的第737位碱基从C突变为T。由此， 其所编码的产物与野生型的STUB1相比，具有P. T246M突变，即该突变是由于C. 7370T的 杂合错义突变而引起的，具体地，相对于野生型STUB1，本发明的分离的多肤（即STUB1突变 体）的第246位T突变为M。
[0038] 目前已知，泛素蛋白酶体通路障碍可引起性腺发育不全合并脊髓小脑共济失调， 其中一种E3连接酶RNF213和一种去泛素酶0TUD4的基因突变都可W引起此类症状，但是 目前尚未见STUB1突变与性腺发育不全合并小脑共济失调症相关的报道。
[0039] 根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肤。根据本发明的实施例，与 野生型STUB1相比，该分离的多肤具有P. T246M突变，即该突变是由于C. 7370T的杂合错 义突变而引起的，具体地，相对于野生型STUBl，本发明的分离的多肤（即STUBl突变体）的 第246位T突变为M。根据本发明的一些具体示例，该多肤是由前述分离的编码STUB1突变 体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肤，可W有效地检测生物样品是否易 患性腺发育不全合并小脑共济失调症，也可W通过检测该些多肤在生物体中是否存在，可 W有效地预测生物体是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调症。
[0040] 根据本发明的第H方面，本发明提出了一种筛选易患性腺发育不全合并小脑共济 失调症的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括W下步骤：
[0041] 从所述生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特 别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品STUB1是否存在突变的核酸样本即 可。根据本发明的实施例，生物样品可W为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，优选 外周血。由此，可W方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患性腺发育不全合 并小脑共济失调症的生物样品的效率。根据本发明的实施例，该里所使用的术语"核酸样 本"应做广义理解，其可W是任何能够反映生物样品中STUB1是否存在突变的样本，例如可 W是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可W是该全基因组中包含STUB1编码序列 的一部分，可W是从生物样品中提取的总RNA，也可W是从生物样品中提取的mRNA。根据本 发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可W扩大生物样品的来源范围， 并且可W同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患性腺发育不全合并 小脑共济失调症的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样 本，从生物样品提取核酸样本可W进一步包括；从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为 mRNA ; W及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDM样本，所得到的cDNA样本构 成核酸样本。由此，可W进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易患性腺发育不全合并小 脑共济失调症的生物样品的效率。
[0042] 接下来，在得到核酸样本之后，可W对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核 酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备 并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可W通过测序方法，确定核酸样本的核酸序 列。根据本发明的实施例，可W用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的 实施例，可W采用第二代测序技术，也可W采用第H代W及第四代或者更先进的测序技术。 根据本发明的具体示例，可W利用选自ABI3730、化seq2000、S0LiD、454和单分子测序装置 的至少一种对核酸序列进行测序，优选ABI3730测序仪。由此，结合最新的测序技术，针对 单个位点可W达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用该些测 序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能 够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核 酸样本的核酸序列可W进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；W 及对所得到的核酸测序文库进行测序，W便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本 发明的一些实施例，可W采用选自ABI3730、化seq2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至 少一种对所得到的核酸测序文库进行测序，优选ABI3730测序仪。另外，根据本发明的实施 例，可W对核酸样本进行筛选，富集STUB1外显子，该筛选富集可W在构建测序文库之前， 构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样 本，构建核酸测序文库进一步包括：利用STUB1外显子特异性引物，对核酸样本进行PCR扩 增；W及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可W通过PCR扩增，富集STUBl 外显子，从而能够进一步提高筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的效 率。根据本发明的实施例，STUB1外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优 选实施例，该些STUB1外显子特异性引物具有SEQ ID NO ; 15和16所示的核巧酸序列：
[0043] 正向引物；5' -ATGAAGGGCAAGGAGGAGAAGGAGGGCGGCGC-3，（沈Q ID NO ;15);
[0044] 反向引物；5, -GTAGTCCTCCACCCAGCCATTCTCAGAGAT-3，（SEQ ID NO ;16)。
[0045] 发明人梅奇地发现，通过采用该些引物，可W在PCR反应体系中通过显著有效地 完成对STUB1外显子的扩增。需要说明的是，该些SEQ ID N0;15和SEQ ID N0;16所示的 核巧酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。
[0046] 关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可W根据不同 的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可W参见测序仪器的厂商例如Illumina公 司所提供的规程，例如参见 Illumina 公司 Multiplexing Sample Preparation Guide (Part#1005361;F'eb2010)或化ired-End SamplePr巧 Guide (Part#1005063;Feb2010)，通 过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不 受特别限制，可W采用商品化的核酸提取试剂盒进行。
[0047] 需要说明的是，在该里所使用的术语"核酸序列"应作广义理解，其可W是在对核 酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可W是直接 采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据（reads)作为核酸序列，只要该些核酸序 列中含有对应STUB1的编码序列即可。
[0048] 最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO ;1的序列相比对。如果在所得到的核酸序列中具有C.7370T突变，则指示生物样品 易患性腺发育不全合并小脑共济失调症。由此，通过根据本发明实施例的筛选易患性腺发 育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法，可W有效地筛选易患性腺发育不全合并小 脑共济失调症的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO ;1进行比对的 方法和设备并不受特别限制，可W采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例， 可W采用SOAP软件进行比对。
[0049] 需要说明的是，根据本发明实施例的"筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调 症的生物样品的方法"的用途不受特别限制，例如可W用作非诊断目的的筛选方法。
[0050] 筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的系统和试剂盒
[0051] 根据本发明的第四方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易患性腺发育 不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法的系统。
[0052] 参考图1，根据本发明的实施例，该筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的 生物样品的系统1000包括核酸提取装置100、核酸序列确定装置200 W及判断装置300。
[0053] 根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。如前所 述，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸样本， 则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102,其中，提取单元101用于 从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单元101相连，用于对RNA样本进行 反转录反应，W便获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。
[0054] 根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核 酸样本进行分析，w便确定核酸样本的核酸序列。如前所示，可w采用测序的方法确定核酸 样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可W进一步 包括；文库构建单元201 W及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核 酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，W便 获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述，可W通过PCR扩增，富集STUB1外显子， 进一步提高筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的效率。由此，文库构 建单元201可W进一步包括PCR扩增模块（图中未示出），在该PCR扩增模块中设置有STUB1 外显子特异性引物，W便利用STUB1外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，根 据本发明的具体实施例，STUB1外显子特异性引物具有如SEQ ID NO ;15和16所示的核巧酸 序列。根据本发明的实施例，测序单元202可W包括选自AB口730、HISEQ2000、S0LiD、454 和单分子测序装置的至少一种，优选ABI3730测序仪。由此，结合最新的测序技术，针对单 个位点可W达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用该些测序 装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高 后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。
[00巧]根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样 本的核酸序列进行比对，W便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO ;1的区别判断生物样 品是否易患性腺发育不全合并小脑共济失调症。具体地，基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO ;1相比，是否具有C. 7370T突变，判断生物样品是否易患性腺发育不全合并小脑共 济失调症。如前所述，根据本发明的一个实施例，核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO ;1相比， 具有C. 7370T突变，是生物样品易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的指示。如前所 述，根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO ;1进行比对的设备并不受特别限制，可 W采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可W采用SOAP软件进行比对。
[0056] 由此，利用该系统，能够有效地实施前述筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失 调症的生物样品的方法，从而可W有效地筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生 物样品。
[0057] 根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易患性腺发育不全合并小脑 共济失调症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易患性腺发育不全合 并小脑共济失调症的生物样品的试剂盒包括：适于检测STUB1基因突变体的试剂，其中与 SEQ ID NO ;1相比，该STUB1基因突变体具有C. 7370T突变。利用根据本发明的实施例的 试剂盒，能够有效地筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品。在本文中，所 使用的术语"适于检测STUB1基因突变体的试剂"应做广义理解，即可W是检测STUB1编码 基因的试剂，也可W是检测STUB1突变体多肤的试剂，例如可W采用识别特异性位点的抗 体。根据本发明的一个实施例，所述试剂为核酸探针或引物，优选地，所述核酸探针或引物 具有如SEQ ID NO ;15-16所示的核巧酸序列。由此，可W高效地筛选易患性腺发育不全合 并小脑共济失调症的生物样品。
[0058] 需要说明的是，在本文前面筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样 品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失 调症的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再费述。
[0059] 构建体及重组细胞
[0060] 根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构 建体包含前面所述的分离的编码STUB1突变体的核酸，即本发明的STUB1基因突变体。由 此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗性腺发 育不全合并小脑共济失调症的药物。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可W为 大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。
[0061] 在本发明中所使用的术语"构建体"是指该样的一种遗传载体，其包含特定核酸序 列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，W获得重组细胞。根据本发明的实施例，构 建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可W为质粒、瞻菌体、人工染色体、粘粒 (Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可W携带较大片 段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可W是环形质粒，也可W是线 性质粒，即可W是单链的，也可W是双链的。本领域技术人员可W根据需要进行选择。在本 发明中所使用的术语"核酸"可W是任何包含脱氧核糖核巧酸或者核糖核巧酸的聚合物，包 括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构 建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于 操作。
[0062] 根据本发明的第走方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该 重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。从而，本发明的重组细胞能够 表达构建体所携带的STUB1基因突变体。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细 胞，能够有效地筛选治疗性腺发育不全合并小脑共济失调症的药物。根据本发明的实施例， 受体细胞的种类不受特别限制，例如可W为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细 胞来源于非人哺乳动物。
[0063] 下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，该些实施例仅是说明性 的，而不能理解为对本发明的限制。
[0064] 若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手 段，可W参照《分子克隆实验指南》第H版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为 可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来 源、商品名W及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特 殊说明，均W首次标明的内容相同。
[0065] 实施例1确定性腺发育不全合并小脑共济失调症致病突变
[0066] 1、样本收集
[0067] 发明人收集到一个表现为性腺发育不全合并小脑共济失调的家系，其家系图见图 2。如图2所示，其中，0表示正常女性，□表示正常男性，表示男性患者，?表示女性患 者。
[0068] 发明人收集获得上述性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家系中患者及家系 内正常人的外周血样本。
[006引 2、全外显子组测序
[0070]发明人利用NimbleGenSeqCap EZ Human Exome Library v2. 0全外显子捕获平台 结合Solexa高通量测序技术，对上述性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家系中的两 名患者和一名家系内正常人的STUB1基因的外显子区域序列进行了测序。
[0071] 具体如下：
[0072] 2. 1DNA 提取
[0073] 采集图2所示性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家系中的两名患者（II-1和 II-2)和一名家系内正常人（II-3)的外周血，利用常规酷-氯仿法抽提外周血白细胞中的 基因组DNA，并利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得各基因组DNA的0〇26。/〇〇28。均 应位于1. 7-2. 0之间，浓度不少于200纳克/微升，总量不少于3微克。
[0074] 2. 2外显子捕获与测序
[00巧]利用超声波仪（CovarisS2, Massachusetts, USA)将各基因组DNA样本随机打断 成250-300bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接 头制备文库(可参见；http://www. illumina. com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明 书，通过参照将其全文并入本文)。文库经纯化后经过Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的 线性扩增与捕获试剂Biotin^ated DM Library进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩 增，文库检测合格后即可上机测序，W便获得原始测序数据。其中，测序平台为Illumina 化seq2000,读取长度为90bp，各样本的平均测序深度最少为90 X。
[0076] 3、变异检测、注释及数据库比较
[0077] 利用Illumina basecalling Softwarel. 7对上述获得的原始测序数据进行处 理，经过过滤去污染后，使用SOAPali即er/S0AP2 (可参见；Li R,Li Y,Kristiansen K,et al, SOAP:short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics2008, 24 (5):71 3-714 ;Li R, Yu C, Li Y, ea al, S0AP2:an improved ultrafast tool for short read alignment. Bioinformatics2009, 25 (15) : 1966-1967,通过参照将其全文并入本文）比 对到 UCSC 人类参考基因组化gl9, build37. 1，ht1:p://genome. UCSC. edu/)，W便获得比 对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp (可参见；Li R，Li Y，Fang X，Yang H, et al, SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing. Genome Res2009, 19化）=1124-1132,通过参照将其全文并入本文）确定祀区域的基因型。
[0078] 结果，在该些样本中，发明人发现：患者II-1的DNA样品中有96183个单核巧酸多 态性（SNPs)和7046处的插入/缺失；患者II-2的DNA样品中有98255个单核巧酸多态性 (SNPs)和7227处的插入/缺失；家系内正常人II-3的DNA样品中有98507个单核巧酸多 态性（SNPs)和7159处的插入/缺失。随后通过dbSNP数据库化ttp://hgdownload. cse. ucsc. edu/goldenPath/hgl9/dat油ase/s吨 135. txt. gz. )、HapMap 数据库 ncbi. nlm. nih. gov/hapmap)、千人基因组数据库lOOOgenomes. ebi. ac.址 / vollVf化）、炎黄数据库化ttp://yh. genomics, org. cn/)等公共数据库的过滤，去掉所有已 知的且在数据库中等位基因频率大于0. 005的变异。
[0079] 然后根据生物信息策略成功筛选到STUB1基因的一个T246M蛋白错义突变，即 P. T246M蛋白突变，其基因突变为C. 7370T。
[0080] 接着，发明人在500名家系外正常人中对上述基因突变进行了 Sanger测序验证， 结果，未发现相关基因变异，证实了上述突变的突变性。
[0081] 进一步，发明人对STUB1蛋白第246位氨基酸位点进行了相关序列保守性分析，结 果见图4。由图4可知，该位点在不同种群中高度保守，从而佐证了上述突变的致病性。
[0082] 综上所述，发明人认为，STUB1极有可能是性腺发育不全合并小脑共济失调症的致 病基因，而STUBl基因的c. 737C〉T突变为该病的致病突变。
[0083] 实施例2Sanger法测序验证1
[0084] 分别对实施例1中所述的性腺发育不全合并小脑共济失调症患者家系中的所有 家系成员（包括患者及家系内正常人）和500名家系外正常人的STUB1基因进行检测：针 对STUB1基因的7个外显子分别设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得 STUB1有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证STUB1基因与性腺发 育不全合并小脑共济失调症之间的相关性。
[0085] 具体方法步骤如下：
[0086] 1、DNA 提取
[0087] 按照实施例1中所述的提取DNA的方法，分别提取制备受试者外周静脉血中的基 因组DNA，备用。
[008引 2、引物设计及PCR反应
[0089] 首先，参考人类基因组序列数据库hgl9/build36. 3,设计得到具有SEQ ID NO: 5-14所示的核巧酸序列的STUBl基因外显子特异性引物，具体序列如下：
[0090] Exonl ：
[0091] 正向引物；5' -GGGGACAGGGAACTGGAG-3'（SEQ ID NO ;5)，
[0092] 反向引物；5' -CCCGAAGAGGAGCCAGAC-3'（SEQ ID NO ;6);
[0093] Exon2 ：
[0094] 正向引物；5' -ATTCTAGCCAGAGCGCAGAA-3'（SEQ ID NO ;7)，
[0095] 反向引物；5, -GGGCTTCACGTCACTCTCTG-3,（SEQ ID NO ;8);
[0096] Exon3 ：
[0097] 正向引物；5, -GGCCAGAGAGTGACGTGAA-3'（沈Q ID NO ;9)，
[0098] 反向引物；5, -TAAACGCTTGTGTCGGGAGT-3,（SEQ ID NO ;10);
[0099] Exon4, 5 ：
[0100] 正向引物；5, -ATCTGGCCAGGTCCATCTCT-3'（沈Q ID NO ;11),
[0101] 反向引物；5, -ACACGGTCAGAGGCTGAAAA-3,（SEQ ID NO ;12);
[0102] Exon6, 7 ：
[0103] 正向引物；5, -TTTTCAGCCTCTGACCGTGT-3,（SEQ ID NO ;13),
[0104] 反向引物；5' -GGGTGGCCAGGAACATAAAC-3,（SEQ ID NO ;14)。
[0105] 接着，分别按照W下配比配制各基因组DM样本的PCR反应体系W及进行PCR反 应：
[0106] 反应体系：
[0107]
【权利要求】
1. 一种分离的编码STUB1突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与SEQIDNO:1相比， 具有c. 737C>T突变， 任选地，所述核酸为DNA。
2. -种分离的多肽，其特征在于，与SEQIDN0:2相比，所述分离的多肽具有P.T246M 突变， 任选地，所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。
3. -种筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的方法，其特征在于， 包括以下步骤： 从所述生物样品提取核酸样本； 确定所述核酸样本的核酸序列； 所述核酸样本的核酸序列与SEQIDN0:1相比，具有c. 737C>T突变是所述生物样品易 患性腺发育不全合并小脑共济失调症的指示， 任选地，所述生物样本为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种， 任选地，所述核酸样本为全基因组DNA。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，从所述生物样品提取核酸样本进一步包 括： 从所述生物样品提取RNA样本，优选所述RNA样本为mRNA;以及 基于所述RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样 本。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，确定所述核酸样本的核酸序列进一步包 括： 针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果， 任选地，采用选自ABI3730、Hiseq2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种对所 述核酸测序文库进行测序，优选ABI3730测序仪， 任选地，针对所述核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括： 利用STUB1基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增；以及 针对所得到的扩增产物，构建所述核酸测序文库， 任选地，所述特异性引物具有如SEQIDN0:15-16所示的核苷酸序列。
6. -种筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的系统，其特征在于， 包括： 核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本； 核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核 酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列； 判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核 酸序列与SEQIDNO:1相比，是否具有c. 737C>T突变，判断所述生物样品是否易患性腺发 育不全合并小脑共济失调症， 任选地，所述核酸提取装置进一步包括： RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；以及 反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行反转 录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
7. 根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括： 文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测 序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果， 任选地，所述文库构建单元进一步包括： PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有STUB1基因外显子特异性引物，以便利用所 述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增， 任选地，所述特异性引物具有如SEQIDN0:15-16所示的核苷酸序列， 任选地，所述测序单元包括选自ABI3730、HISEQ2000、S0LiD、454和单分子测序装置的 至少一种，优选ABI3730测序仪。
8. -种用于筛选易患性腺发育不全合并小脑共济失调症的生物样品的试剂盒，其特征 在于，含有： 适于检测STUB1基因突变体的试剂，其中与SEQIDN0:1相比，所述STUB1基因突变体 具有c. 737C>T突变， 任选地，所述试剂为核酸探针或引物， 任选地，所述核酸探针或引物具有如SEQIDNO:15-16所示的核苷酸序列。
9. 一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的编码STUB1突变体的核酸。
10. -种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求9所述的构建体转化受 体细胞而获得的。
【文档编号】C07K14/47GK104513822SQ201310465540
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】戴兰兰, 蒋慧, 许予明, 史长河, 汪建, 杨焕明 申请人:深圳华大基因科技有限公司