专利名称：施用含硫醇化学保护化合物的方法
相关申请本申请要求在35 U.S.C.§119(e)规定下提交的美国临时专利申请No.60/199，936(2000年4月26日提交)和美国临时专利申请No.60/229，870(2000年8月30日提交)的权利，其公开内容在此引入作为参考。
联邦政府赞助的研究或开发本发明是在退伍军人事务部(The Department of VeteransAffairs)授权的、NIH部分支持的Grant No.NS33618下进行的。美国政府对本发明有一定的权利。
背景技术：
本发明部分地是基于发现了能显著影响N-乙酰半胱氨酸(NAC)有效生物分布的给药方法。本发明提供了一种用于治疗或减轻副作用的方法，所述副作用包括对头或颈部肿瘤进行细胞毒素癌症治疗所致的器官损伤。另外，可在实施动脉内操作时、之前或之后施用NAC或其他硫醇类，以提供保护作用而防止或减少器官损伤。
N-乙酰半胱氨酸(NAC)是半胱氨酸的类似物。将NAC给予哺乳动物后，它会脱去酰基并进入可形成谷胱甘肽的细胞合成途径。谷胱甘肽涉及的细胞途径可影响肿瘤对细胞毒素药物的抵抗力。用丁胱亚磺酰亚胺(buthionine sulfoximine，BSO)预处理以减少细胞内的谷胱甘肽，可增强化学治疗药物的细胞毒素特性。然而，减少细胞内的谷胱甘肽(gluthionine)，会增强化疗药物相关的系统毒性。因此，该操作应是剂量限制性的。如果用BSO来加强细胞毒素癌症治疗的细胞毒素性能，则不得不重新建立“正常”细胞的谷胱甘肽水平，以达到保护作用(Kamer等，Cancer Res.471593-1597，1987；Ozols等，Biochem.Pharm.36147-153，1987；McLellan等，Carcinogenesis172099-2106，1995；和Shattuck等，J.Parenteral EnteralNutrition 24228-233，1998)。采用含硫化学保护剂(硫、硫醇和硫醚化合物)模拟谷胱甘肽的一种或更多活性(例如，共轭、自由基清除和经由多药耐药相关蛋白质的药物流出)，有可能减少化疗药物的骨髓毒性。NAC和其他的硫醇剂例如STS的早期解毒活性与后来增加的谷胱甘肽水平无关。硫醇自身会因模拟胱甘肽的一些作用，例如自由基清除、抗氧化剂活性、化学共轭和激活流出泵，而表现出这些早期解毒作用。
伴随着任何化学保护剂的一个潜在问题是其可能对化疗或放疗的抗肿瘤作用产生减活作用。化学保护的目的是在不影响化疗或放疗效力的情况下减少不想要的毒性。
对于脑部肿瘤的化疗，必须增加向脑部肿瘤传送化疗，同时应阻断化学保护剂向其中的传递。另外，还应使化学保护剂靶向骨髓以防止骨髓抑制，并靶向肝、肾和肺以防止器官毒性。因此，需要改善化学保护剂的药动学和生物学分布，使其以某种组织特异性方式传送时更为有效。优选地，化学保护剂应最大化地传递到骨髓、胸部和腹部器官中，而最小化地传递到脑部。
目前，有超过十种的特定活性传送系统可将化合物从血液传送至脑部。另外，某些物质例如化学保护剂，只能极小量地经被动扩散而透过该屏障。脑部肿瘤的治疗尤为困难，因为血脑屏障(BBB)是一种能限制血液组分进入脑部的解剖学结构。因此，脑部肿瘤通常对化疗药的响应较低。有许多方法试图增加某些药物化合物在脑部组织中的生物利用度。其中一种技术是通过颈内动脉施用甘露醇，对BBB进行渗透修饰(Neuwelt等，Cancer Res.452827-2833，1985)。由于化疗药甲氨蝶呤难以进入脑肿瘤中(穿透BBB的量很低)，采用该技术可将其施用到试验性脑肿瘤中。由于颈总动脉内施用甘露醇所引起的渗透性皱缩，使BBB暂时性分裂(disruption)而增加了甲氨蝶呤向肿瘤中的传送。因此，糖(例如甘露醇)可引起BBB屏障功能的暂时破坏，这样可使那些不能穿透BBB的药物化合物在脑部达到较高浓度。对其他化疗药物也已进行了这种BBB通路技术的研究(Neuwelt等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 794420-4423，1982；Fortin D.McCormich C1，Remsen LG，Nixon R，Neuwelt EA，“普鲁泊福全身麻醉的大鼠模型经血脑屏障修饰后，联合给予磷酸依托泊苷与其他化疗药时出人意料的神经毒性，”Neurosurgery 47199-207，2000)。
化学保护的一个示例是US5,124,146中描述的药物中和技术，其中过量的毒性药物化合物被结合剂或中和剂“清除”或结合而不能穿透血脑屏障。该技术需要精确定时地施用药物中和剂。
几种含硫醇的化学保护剂，其中包括硫、硫醇、氨基硫醇或硫代酸酯部分。几种含硫醇的化学保护剂至少可对烷化剂化疗所致的一些系统毒性提供保护作用。这种含硫醇的化学保护剂包括N-乙酰半胱氨酸(NAC)、硫代硫酸钠(STS)、GSH乙酯、D-蛋氨酸和硫醇氨磷汀(Ethyol或WR2721)。目前，NAC标以唯一(orphan)适应证在美国销售，经口服或静脉内(i.v.)给药用于乙酰氨基酚过量。NAC在与钒酸盐化合物联合给药时表现为化学保护剂(US5,843,481；和Yarbo(编辑)Semin.Oncol.10-[增刊1]56-61，1983)。Ethyol也以通用名“氨磷汀”在美国销售。GSH乙酯是一种试验性硫醇，并没有销售用于临床，它是可直接转化成谷胱甘肽的硫醇类代表。
另外，NAC可作为粘膜调节剂用于慢性支气管炎的治疗(Grassi和Morandini，Eur.J.Clin.Pharmacol.9393-396，1976；Multicenter Study Group，Eur.J.Respir.Dis.61[增刊]93-108，1980；和Borman等，Eur.J.Respir.Dis.64405-415，1983)。
在血浆中，NAC可以其完整的还原形式以及各种氧化形式存在。通过与其他低分子量的硫醇(例如半胱氨酸和谷胱甘肽)反应，被氧化成为二硫化物。与血浆蛋白的硫醇基团反应，能使NAC氧化。当静脉内给药时，脑部NAC的浓度小于5％。然而，如果经动脉内途径给药，NAC则可穿透BBB。NAC可经肝和肾迅速地从血浆中清除。另外，NAC未显示有神经毒性特性。
有许多生物学分析方法可用来检测血浆中NAC，这包括Cotgreave和Moldeus，Biopharm.Drug Disp.8365-375，1987；Johansson和Westerlund，J.Chromatogr.385343-356，1986中的描述，同样也可测定其他形式的NAC。另外，半胱氨酸和胱氨酸已被鉴定为NAC的主要代谢产物。其中尿排泄物是无机硫酸盐，并伴有少量的氨基乙磺酸和原型NAC。按照American Regent Laboratories Shirley公司(纽约)生产的NAC商标标识，其产品为小瓶装的NAC无菌溶液，加水或软饮料稀释后可经口服给药。
另一个含硫醇的化学保护剂是硫代硫酸钠(STS)，其化学式为Na2S2O3，在临床上可用于氰化物中毒和顺铂导致的中毒性肾损伤。STS主要通过肾脏从循环中迅速地被清除。浓注的血浆半衰期约为17分钟。STS也可以大于40∶1(STS铂)的摩尔比与铂剂共价结合，使铂剂灭活。静脉注射给予STS时，其脑部浓度小于血液中浓度的5％，这表明其在脑部定位的能力很低。当动脉内(i.a.)施用时，在BBB破坏的30分钟内，增加脑部的STS水平会发生神经毒性副作用(癫痫发作)。
涉及动脉内导管插入术的诊断或治疗性操作，可因损伤而导致多种器官毒性、并发症和副作用。例如，放置动脉导管会使斑块从动脉壁上移开并聚集在别处，从而引起局部缺血。局部缺血会使自由基增加并导致细胞死亡。又例如放射线造影剂，即使采取了降低毒副作用的措施，放射线造影剂的中毒性肾损伤仍可导致急性肾衰竭。另一个例子是，在血管成形术操作中所用的动脉内导管插入术，其中的气囊导管插入动脉循环，然后抵达(与用于造影术的放射线造影剂一起)闭塞位置。在扩张闭塞动脉的过程中，可发生各种形式的组织损伤和炎症反应(例如再狭窄)，包括局部缺血的组织损伤。
动脉内导管插入术和放射线造影剂的毒副作用，尤其延长病人在医院的停留时间，增加了医药费用，并能致命。目前，在接受造影剂的糖尿病和已患肾疾病患者中，测得放射线造影剂所致急性肾衰竭的发病率高达50％，这可能与采用侵入性动脉内操作诊断和治疗持续发展性复杂疾病所致的发病率一样高。
放射线造影剂用于医学成像。医学成像是通过应用非手术技术产生的内脏和组织影像。造影剂是用来增强图象和增加靶器官与周围组织对比的化学品。施用放射线造影剂后，很难预防或减轻肾衰竭。已使用了钙通道拮抗药、腺苷拮抗药和多巴胺，但并未产生使人信服的有益迹象。
Tepel等提出，可每天口服约1200mg的N-乙酰半胱氨酸，即在施用放射线造影剂的前一天和当天口服分次剂量(Tepel等，NewEngland J.Med.，July 20，2000)。据信，对于那些伴有中度肾功能不全因此有高度危险的进行电子计算机断层照相术(CT)的患者而言，口服给药可防止其出现预期的肾功能衰退。
使用NAC，已成功地改善了试验性或临床所致心脏、肾脏、肺和肝脏的局部缺血再灌注反应综合征的毒性作用。据推测，NAC在每一综合征中的活性，均与其作为自由基清除剂或增加细胞还原能力的反应性巯基(sulphydryl)化合物的作用有关。NAC防止造影剂肾中毒作用的特殊机理至今仍不为人知。
因此，本领域需要开发出能更好地使用含硫醇化学保护剂(例如NAC和STS)以及利用其药动学特性的方法。同时，本领域也需要开发出更好和更高剂量的细胞毒治疗方案，用于头和颈部以及脑部肿瘤的治疗以避免因副作用而限制剂量。
本领域需要可用于动脉内导管插入术操作以减少器官毒性的化合物。对于伴有肾功能明显降低的糖尿病患者，由于血管造影术会给肾功能带来相当大的风险，因而时常推迟对其实施冠状血管造影，但是对保护剂进行靶向给药将使其特别受益。另外，本领域需要一种低成本化合物，它可普遍应用、易于施用且副作用很小。本领域也需要一种化合物和化合物的给药方法，所述化合物可用来减少或消除因动脉内操作所致的组织损伤。
此外，本领域需要开发出能更好地使用含硫醇放射线造影保护剂(例如NAC和STS)以及利用其药动学特性的方法。同时，本领域也需要开发出可防止导管插入术所致器官功能降低的更好的保护剂。本发明方法及药物组合物解决了先有技术中存在的这些和其他问题。
发明概述本发明提供用于定位施用含硫醇化学保护剂的方法和化合物，所述方法和化合物能治疗或减轻头或颈部脑肿瘤细胞毒素疗法所致的副作用。此外，本发明提供了用于向器官或组织定位施用含硫醇化学保护剂的方法和化合物，所述方法和化合物能防止诊断性或治疗性动脉内操作带来的损伤。所述方法包括在施用细胞毒素剂时、之前或之后经动脉内给予含硫醇化学保护剂。
在一个实施方案中，细胞毒素剂是癌症化疗剂。所述细胞毒素剂由于其系统性骨髓抑制副作用而需剂量限制。所述癌症化疗剂选自顺铂化合物，紫杉烷(taxane，例如紫杉醇)，甾体衍生物，抗代谢物，长春花生物碱，阿霉素(adriamycin)和阿霉素(doxorubicin)，依托泊苷，砷衍生物，嵌入剂，烷化剂(例如美法仑)及其组合。在给予含硫醇化学保护剂给药(之前，期间或之后)8小时之内施用该细胞毒素剂。在另一实施方案中，如果肿瘤位于头或颈部或脑部，可使所施用的大多数剂量细胞毒素剂直接到达头或颈部区域。
优选地，含硫醇化学保护剂选自N-乙酰半胱氨酸(NAC)，硫代硫酸钠(STS)，GSH乙酯，D-蛋氨酸，Ethyo1，及它们的组合。在一个实施方案中，通过导管插入术操作经由定位于降主动脉的管尖(tip)导管，施用无热原的含硫醇化学保护剂无菌溶液。在另一实施方案中，每次操作中该含硫醇化学保护剂的剂量约为200mg/m2-40g/m2。更优选地，每次操作中NAC的剂量约为400mg/m2-1200mg/m2，而STS的剂量约为5g/m2-40g/m2。
在一个实施方案中，动脉内导管定位于向可能受损的位置或器官供应血流的动脉。在另一实施方案中，动脉内给药定位于降主动脉。另一实施方案中，损伤是由于使用动脉内导管注射细胞毒素剂(包括放射线造影剂)所造成的。
在另一实施方案中，含硫醇化学保护剂是以无热原的、无氧化的无菌溶液形式给药，其中包含还原剂、保持pH在或接近生理pH的缓冲液、和金属螫合剂，所述螫合剂能与催化含硫醇化学保护剂氧化的金属离子结合。优选地，还原剂选自维生素E、生育酚、二硫苏糖醇、硫基乙醇、谷胱甘肽及其组合。优选地，缓冲液是相对无毒并可保持pH在6-8的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液)。含硫醇化学保护剂优选贮藏于充有惰性气体保护层的小瓶中。最优选地，惰性气体选自氩、氦、氮及其混合物。
本发明还提供一种药物组合物，可用于防止诊断或治疗性动脉内操作所带来的损伤，并可用于治疗位于头和颈部的脑肿瘤。所述化合物包括用于动脉内给药的第一种药物和用于动脉内给药的第二种药物。
优选地，第二种药物是含硫醇化学保护剂。在一个实施方案中，第二种药物被施用到降主动脉或更下端的血流处。
第一种药物被施用到颈总动脉或椎动脉。第一种药物是经动脉内传送以定位导管的放射线造影剂。在一个实施方案中，第一种药物在第二种药物(之前，期间或之后)的8小时内给药。在施用放射线造影之前至施用放射线造影剂8小时的时间内，经动脉内插入导管之后立即给予第二种药物。
在一个实施方案中，第二种药物是以无热原的无菌溶液形式给药。在另一个实施方案中，该溶液是非氧化的，其中含有还原剂、保持pH在或接近生理pH的缓冲液、和金属螫合剂，所述螫合剂能与催化含硫醇化学保护剂氧化的金属离子结合。优选地，还原剂选自维生素E、生育酚、二硫苏糖醇、硫基乙醇、谷胱甘肽及其组合。优选地，缓冲液是相对无毒并可保持pH在6-8的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液)。
在一个实施方案中，含硫醇化学保护剂优选贮藏于充有惰性气体保护层的小瓶中。最优选地，惰性气体选自氩、氦、氮及其混合物。优选地，含硫醇化学保护剂选自N-乙酰半胱氨酸(NAC)、硫代硫酸钠(STS)、GSH乙酯、D-蛋氨酸、Ethyol，及它们的组合。优选地，每次操作中含硫醇化学保护剂的剂量约为200mg/m2-2000g/m2。在另一优选的实施方案中，每次操作中NAC的剂量约为400mg/m2-1200mg/m2。
此外，NAC的优点在于可防止多种动脉内操作的毒性，其中包括但不限于放射线造影剂引起的毒性。
结合附图，参考下面优选实施方案的详细描述，将更好地理解本发明方法和化合物。下面的讨论是描述、说明和示例性的，并不对权利要求书所定义的保护范围作任何限制。
附图简述附
图1显示主动脉解剖图和安放用于施用含硫醇化学保护剂的导管的最高水平(top lever)。
附图2(A-C)是采用本发明方法左颈总动脉主动脉输注以及使用化疗和化学保护剂NAC对骨髓恢复和降低最低值的效力。具体地说，附图2A是对白细胞的作用，附图2B是对血小板的作用和附图2C是对粒细胞的作用。
附图3A显示了N-乙酰半胱氨酸化学保护剂的量/效关系。附图3B为D-蛋氨酸化学保护的量/效关系。采用WST比色分析法，以在1×104细胞/孔的96孔平皿中的培养LX-1 SCLC细胞，测定细胞毒性。用约90％化疗致死量(美法仑＝20μg/ml，卡铂＝200μg/ml，顺铂＝20μg/ml)处理细胞。附图3A、3B为单独或化疗后立即加入标示浓度的化学保护剂(分别为N-乙酰半胱氨酸和D-蛋氨酸)。数据以活细胞与未经处理的对照样品(未经化疗)的百分比表示，每个点代表4孔的均值±标准差(sd)。
图4A和4B显示了细胞增强作用和化学保护作用。附图4A为BSO和N-乙酰半胱氨酸对卡铂细胞毒性的效力。附图4B为BSO和N-乙酰半胱氨酸对磷酸依托泊苷细胞毒性的效力。使用WST比色分析法，以在1×104细胞/孔的96孔平皿中的培养LX-1 SCLC细胞，测定细胞毒性。BSO细胞增强作用是用100μM的BSO预保温18小时。化疗后立即加入化学保护剂。试验条件是对以下的量/效关系单独化疗(卡铂或磷酸依托泊苷)(m)、BSO细胞增强剂(E)、N-乙酰半胱氨酸援救(rescue)(1000g/ml N-乙酰半胱氨酸，n)，或BSO细胞增强剂和N-乙酰半胱氨酸援救(u)。数据以活细胞与未经处理的对照样品(未经化疗)的百分比表示，每个点代表4孔的均值±标准差。
附图5显示了在纤维母细胞中的细胞增强作用和化学保护作用。使用WST比色分析法，在1×104细胞/孔的96孔平皿中的GM294人纤维母细胞中，测定细胞毒性。在单独加入化疗剂(美法仑＝10μg/ml，卡铂＝100μg/ml，顺铂＝7.5μg/ml，磷酸依托泊苷100μg/ml)之前(白条)，或者在化疗剂与N-乙酰半胱氨酸援救(1000μg/ml N-乙酰半胱氨酸，斜线条)、BSO细胞增强剂(黑条)、BSO细胞增强剂和N-乙酰半胱氨酸援救(十字影线条)联用之前，用或不用100μM BSO对细胞预处理18小时。数据以活细胞与未经处理的对照样品(未经化疗)的百分比表示，每个点代表4孔的均值±标准差。
附图6显示了化疗细胞毒性援救对时间的依赖关系。使用WST比色分析法，在培养的LX-1 SCLC细胞(1×104细胞/孔的96孔平皿)中测定化疗细胞毒性。细胞经20μg/ml美法仑、200μg/ml卡铂、10μg/ml顺铂，或200μg/ml磷酸依托泊苷处理。然后，在化疗后立即(斜线条)、2小时后(黑条)或4小时后(十字影线条)，细胞接受2000μg/ml硫代硫酸钠，或者不接受保护剂(白条)。数据以活细胞与未经处理的对照样品(未经化疗)的百分比表示，每个点代表4孔的均值±标准差。
图7A和7B显示细胞增强作用和化学保护作用对细胞凋亡的影响。附图7A显示了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2的酶活性。附图7B为TUNEL染色的DNA片断。用或者不用100μM BSO对培养的LX-1 SCLC细胞预处理18小时，供细胞凋亡测定。试验条件是在采集之前，未加入(白条)、或加入美法仑(10μg/ml，斜线条)或美法仑(10μg/ml)加上N-乙酰半胱氨酸(1000μg/ml)(十字影线条)处理20小时。以相对于未处理对照样品的百分活性表示半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2活性(均值±标准差，n＝3)。以表现为阳性染色的细胞百分率表示TUNEL染色。
附图8显示NAC传送至大鼠脑的结果。以下列途径，将放射标记的NAC与未标记的低剂量NAC(140mg/kg)或高剂量NAC(1200mg/kg)联合输注给大鼠i.v.(白条)、动脉内进入右侧颈总动脉(斜线条)、动脉内经由左侧颈内动脉闭塞的左侧颈总动脉(主动脉输注，黑条)、和动脉(右侧颈总动脉)的BBBD(十字影线条)。组织匀浆中的放射性标记，用每克组织中14C-NAC的％给药剂量的均值和标准误表示(n＝3只大鼠/组)。与i.v.给药相比有显著性差异的以*P＜0.05和**P＜0.001表示。
附图9为表明NAC给药途径对死亡率的影响的试验(经或不经BSO处理)。采用Kaplan-Meier产品限度分析仪，分析由NAC化学保护剂引起的死亡率。在用化疗药(卡铂200mg/m2，磷酸依托泊苷100mg/m2，美法仑10mg/m2)治疗之前，对大鼠进行或不进行BSO处理(10mg/kgi.p.每日两次×3天，黑条)。化学保护剂由NAC(1200mg/m2)或NAC(1000mg/m2)加上STS(8g/m2)组成，经i.v.(n＝17BBSO，n＝8+BSO)或主动脉输注(n＝19BBSO，n＝28+BSO)。经Wilcoxon分析，P＝0.0014。
图10A-10D显示对化疗所致骨髓抑制的化学保护作用的试验结果。大鼠接受三种化疗药(卡铂200mg/m2、磷酸依托泊苷100mg/m2、美法仑10mg/m2)，加入(三角，方块)或不加(圆圈)化学保护剂。在化疗之前、在血细胞最低值(6天)和恢复期(治疗后9天)，对血细胞进行计数。在化疗之前30分钟经由主动脉输注给予NAC(1200mg/kg，三角)、或在化疗之前给予NAC和在化疗后立即给予STS(8g/m2)(方块)，以提供化学保护作用。在附图10B和10D中，动物在化疗之前接受BSO(10mg/kg i.p.×3天)。附图10A为没有BSO的粒细胞计数，附图10B为有BSO的粒细胞计数(均值±SEM，每组n＝6)，附图10C为没有BSO的血小板计数，附图10D为有BSO的血小板计数。采用Wilcoxon/Kruskal-Walliis等级和检验，测定相对于不含无保护剂组的显著性差异(*p＜0.05，**p＜0.01)。
发明详述本发明方法包括施用至少两种不同的药物来治疗脑部或头和颈部肿瘤。第一种药物是细胞毒素剂。在一个实施例中，细胞毒素剂是放射或化疗剂。这类放射或化疗剂通常对系统表现出剂量限制性的骨髓抑制副作用。如果骨髓抑制非常严重，不能产生足够的多谱系(lineage)的白细胞来协调免疫监视功能(以抵御病原体的攻击)，将危及病人生命。因此，任何能降低骨髓毒性或骨髓抑制的方法，可更大量或更有效地施用细胞毒素剂。
目前降低骨髓副作用的治疗包括谱系特异性的重组生长因子。这类生长因子包括用于红细胞的EPO(红细胞生成素)，和用于抗感染性白细胞的不同谱系的G-CSF(粒细胞集落刺激因子)或GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)。另外，TPO(血小板生成素)在临床试验中用来增强骨髓抑制病人的血小板反应。然而，这种生长因子会刺激谱系特异性前体细胞分裂并以谱系特异性途径成熟。因此，使用这类生长因子可使骨髓毒性得到更快地恢复，但是通常并不能降低毒性的最低值。这类生长因子能使病人忍受更大量的细胞毒治疗(其中骨髓抑制是限制性毒性)，但是一般并不能施用更高剂量的细胞毒素剂。
本发明方法可将更大剂量的细胞毒素剂直接传递到头和颈部肿瘤。具体地说，是经动脉内给予细胞毒素剂(化学化合物或者化合物的组合)，这样可使其一开始就直接进入头和颈部循环。这样，即可将最高浓度的细胞毒素剂直接传送到需要治疗的肿瘤位置中。与之相反的是，静脉内给药在骨髓中提供相同浓度的细胞毒素剂(例如全身剂量)时，即在骨髓出现了副作用。
含硫醇的化学保护剂是非特异性的化学保护剂。它们并不是专门针对“正常”组织或细胞，而是能保护正常组织和肿瘤组织。早期利用含硫醇化学保护剂的化学保护性能所作的尝试并不成功，这是由于其口服或全身给药后可被迅速代谢，并且对正常组织和肿瘤组织均有保护作用。全身给药包括静脉内给药。
本发明方法包括利用了双隔室药物动力学模型，该方法可导致全身组织的首过效应，从而防止大量或化学保护量的含硫醇化学保护剂经静脉循环系统进入全身循环。为了影响化学保护剂的效力，该方法利用了可到达低于心脏水平组织的唯一途径。这样，通过将一定量的细胞毒素剂区域化分配到肿瘤组织定位的脑部或头和颈部，而将一定量的化学保护剂重新分配到低于心脏水平的全身组织(大多数骨髓组织定位于此)，使头和颈部肿瘤得以治疗。
含硫醇化学保护剂的这种经非肝组织首过效应的能力是出人意料的。任何一种非组织吸收性的含硫醇化学保护剂一旦进入静脉循环，都将经肝脏首过效应被清除或通过肾脏清除迅速被消除。当未按本发明方法给药时，NAC经主动转运通过BBB。隔室化的一个示例是施用含硫醇化学保护剂进入降主动脉或更下端，以防止任何有效化学保护浓度的含硫醇化学保护剂抵达肿瘤组织所在的脑或头或颈部区域。组织迅速吸收含硫醇化学保护剂，促进了隔室化。为了使用含硫醇化学保护剂产生有益的治疗效益，需要进行隔室化。如果没有隔室化，将产生象含硫醇化学保护剂保护了肿瘤组织这种不需要的作用。当采用NAC为含硫醇化学保护剂时，NAC通过BBB后恢复了脑部肿瘤的谷胱甘肽水平，由此增加了肿瘤对细胞毒素药的抵抗性。
采用体外和体内模型，施用化疗剂和含硫醇化学保护剂NAC和STS，通过系列试验揭示了建立双隔室药物动力学模型的能力。然而，应当指出的是，放疗可以同样甚至比化疗剂更容易定位。组织培养药理学的研究表明，经NAC和STS处理能降低美法仑、卡铂和顺铂化疗带来的细胞杀伤。体内结果表明，定位施用NAC或STS仅产生较低的骨髓抑制且从化疗中恢复更快。另外，含硫醇化学保护剂NAC和STS联用中所观察到的协同作用结果表明，当按本发明方法联合施用含硫醇化学保护剂时，联用含硫醇化学保护剂能增强保护作用。
如附图所示1，在另一方法实施方案中，含硫醇化学保护剂经动脉内给予而直接进入全身。这样可向器官损伤部位(例如肾脏)提供最高浓度的含硫醇化学保护剂，以防止肾功能衰退。与之相比，口服给药作为一种全身给药方式，其施用的保护剂遍布全身各处(主要是肝)，因此需要更高剂量才能向肾脏提供足够剂量的保护剂(肾脏常常是放射线造影剂损伤的部位)。另外，含硫醇的化学保护剂并不专门针对正常组织或细胞，而是能保护正常组织和肿瘤组织。
本发明方法利用了双隔室药物动力学模型，该方法可导致全身组织的首过效应，从而防止大量或放疗保护剂量的含硫醇放射照相保护剂(特别示例为NAC和STS)经静脉循环系统进入全身循环。因此，就需要进入肾脏系统的唯一途径。通过将一定量放射线治疗剂区域化分配到需要进行放疗的区域，并将一定量的保护剂区域分配到肾脏系统，防止了肾功能下降。
如附图1所示，将一根导管经由股动脉插入循环系统。在第一个实施方案中，将导管插入身体并向体内施用一定剂量的放射线造影剂。从动脉内导管插入术之后(优选在造影剂之前)到给予放射线造影剂后约8小时之内的任何时间里，施用有效剂量的含硫醇保护剂(优选为NAC)。用于放射造影保护剂给药的导管，优选插入主动脉的动脉系统下游并直接进入肠系膜动脉系统。在施用放射线造影剂后约5小时内，将含硫醇化学保护剂引入体内，从而减少或消除与肾造影剂有关的肾衰竭或肾功能降低。
在另一实施方案中，将导管插入循环系统(例如，股动脉)，并将有效剂量的含硫醇保护剂引入体内。通过同样的导管施用放射线造影剂，并将导管定位于适合进行治疗或诊断性操作的位置。在给予放射线造影剂之前或之后5小时内的任何时间，通常可经由同样的动脉导管将含硫醇保护剂引入体内。优选地，可在操作中经由动脉导管一次或多次给予含硫醇保护剂。药物制剂本发明化合物的制剂和给药技术，可参见“Remington药物学”Mack Publishing Co.出版社，Easton，PA，最新版。适宜的给药途径是动脉内给药。
可用已知方法，例如常规的混合、溶解、乳化、包裹、包埋或冻干操作，制备本发明组合物和化合物。采用一种或更多生理学可接受的载体(包括可促进制备活性化合物可药用制剂过程的赋形剂和辅剂)，采用常规方法配制本发明药物组合物。可根据所选择的给药途径制备适宜的制剂。
可在水性溶液，优选在生理相容的缓冲液(例如Hank溶液、林格溶液或生理盐水缓冲液)中配制注射用的本发明化合物。该化合物可以制成经注射(例如，浓注或连续输液)给药的非肠道给药制剂。供注射的制剂可以是单位剂型形式(例如，安瓿或多次剂量容器)，其中可加入防腐剂。所述组合物可制成混悬液、溶液或含油或水性载体的乳剂，并且其中也可含有处方剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
非肠道给药的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水性溶液。另外，活性化合物也可制成适当的油性混悬注射液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油例如芝麻油、或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酸酯、或者脂质体。水性混悬注射液可包含增加混悬液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，混悬液中还含有适当的稳定剂或者可增加化合物溶解性以利于制成高度浓缩溶液制剂的试剂。
另外，活性成分可制成粉末形式，在使用前加入适当载体(例如无热原的无菌水)配制。在一个实施方案中，可将还原剂或抗氧化剂加至含硫醇保护剂的制剂中，以防止含硫醇保护剂氧化。这种抗氧化剂包括但不限于维生素E、生育酚、二硫苏糖醇、硫基乙醇、谷胱甘肽。在一个实施方案中，可将惰性或非氧化性气体加至用于动脉给药的小瓶中，所述气体的示例为氮、氩、氦及其组合/混合物。
治疗剂量是指能产生减少骨髓抑制发展或严重性效力的化合物用量。在另一实施方案中，通过在细胞培养物或实验动物上进行标准的药物学、药理学和毒理学操作，测定这类化合物的毒性和治疗效果，例如，测定LD50(总体中50％致死的剂量)和ED50(总体中50％治疗有效的剂量)。治疗指数是指产生毒性的剂量与有治疗效力剂量之间的比值，可以LD50/ED50来表示。优选具有高治疗指数的化合物。从细胞培养物测定或动物研究中所获得的数据，可以用于指导配制人用的剂量范围。优选地，所述化合物的剂量处于循环浓度范围之内，包括毒性很小或没有毒性的ED50剂量。根据所采用剂型和给药途径的不同，所述剂量可在上述范围内变化。医生可根据病人的状况，选择所需要的具体制剂、给药途径和剂量(例如，参见Fingl等的“治疗学的药理学基础”，第1章，1975)。
组合物的给药量，将取决于受治疗者的状况，例如可根据其体重、疾病的严重程度以及医师确定的给药方式和判断来确定。
本发明方法是经动脉内给予含硫醇化学保护剂，这样最初剂量的含硫醇化学保护剂可以足够高的浓度作用于全身组织，以提供化学保护作用并绕过静脉循环和被肝消除。NAC经主动转运通过BBB。在一个实施方案中，为了防止进入脑部，在经股动脉(transfemoral)颈总动脉/椎动脉放置导管灌注脑部之后，接着将导管抽回并放置于降主动脉中供NAC输注，这样用一根导管完成单一的外科操作。这样可将动脉导管操作的危险性降低到最小，并可将高浓度的NAC传送至外周组织和器官(但是不到达脑和头部)。合成每种含硫醇的化学保护剂例如NAC或STS，都可通过常规方法合成并以无菌溶液形式销售。
实施例1该实施例显示了在降主动脉植入导管进行NAC给药的大鼠体内的试验结果。将导管推至内、外颈总动脉交汇处(朝向主动脉)，对大鼠施用药物，并暂时封闭内部颈总动脉使物质不会进入脑部，这有利于实施有效的测量(左侧颈总动脉输注法)。对于患者而言，可经由股动脉进入并首先将导管经主动脉到达脑部，然后应将导管拉回至正好主动脉的位置以便于输注NAC。
将卡铂(200mg/m2)、美法仑(10mg/m2)和磷酸依托泊苷(100mg/m2)给予大鼠，进行治疗。在NAC动物中，在施用化疗剂之后，立即以左侧颈总动脉输注方法注入浓度为400-1200mg/m2的NAC。以试验之前的白细胞(wbc)和血小板(plt)为基值，在施用化疗剂(chemo)处理6天(d6)和9-11天(d9-11)后，进行计数。没有接受NAC的动物在第9-10天进行测试，而NAC动物在第10-11天接受测试。以1000s/μl血计数。表1所示的最初试验数据，提供了没有白细胞效应的初期结果。由于存在如下所示的显著效应，白细胞效应的缺乏并未再发生。
表1单用chemo wbc基值wbc d6wbc d9/10 plt基值 plt d6plt d9/10均值±sd 11.4±4.1 0.8±0.23.2±1.6778± 63±59164±91233数目 8 4 3 7 4 3chem+NAC wbc基值wbc d6wbc d10/11 plt基值 plt d6 plt d10/11均值±sd 7.9±2.1 0.5±0.24.8±0.7 817±142 101±48 1232**±167数目 5 4 3 5 4 3表2的数据显示其他结果。在NAC动物中，在化疗的30分钟前，通过左侧颈总动脉输注方法注入浓度为1200mg/m2的NAC。以试验之前的白细胞(wbc)和血小板(plt)为基线，在施用化疗剂处理6和9天后，进行计数。表1的数据显示，NAC治疗减少了白细胞和血小板的最低血细胞计数，并且化疗后血细胞计数迅速恢复。
表2单用chemo wbc基值wbc d6wbc d9 plt基值 plt d6plt d9均值±sd 6.4±0.3 1.6±0.4 5.2±0.7878±46187±70599±187数目 6 6 6 6 6 6chem+NAC wbc基值wbc d6wbc d9 plt基值 plt d6plt d9均值±sd 5.1±0.4 3.3±0.7 6.2±1.6721±59 388±95 1155±154数目 6 6 6 6 6 6
这些数据显示施用NAC可使血小板在化疗后迅速恢复。
另外，在存在和不存在BSO(丁胱亚磺酰亚胺)的情况下，采用同样剂量的同样化疗剂进行了试验，附图2A所示的结果表明，施用化学保护剂(单用NAC或与上面所示剂量的STS联用)促进了白细胞的恢复并升高了其最低值。对血小板和粒细胞也显示了类似的作用，结果分别见附图2B和2C。
实施例2该实施例显示了不同方法导管给药传送NAC的结果。在试验中，将放射标记的NAC经三种不同途径给予大鼠。对肝和肾组织、以及同侧和对侧的大脑半球进行放射性分析。结果以每克组织中注射的放射性剂量的百分率表示。途径为经静脉内(i.v.)、经动脉内进入右侧颈总动脉(i.a.)或颈内动脉闭塞的左侧颈总动脉和经主动脉输注(左侧颈总动脉输注)。经左侧颈总动脉输注的动脉内方法是将导管顶端置于降主动脉部位，并进行NAC给药。
途径 左半球 右半球 肝肾 数目i.v. 0.02 0.030.59 0.722i.a. 0.03 0.410.57 0.703左侧颈总动脉输注 0.04 0.040.29 1.422这些数据显示，经i.a.给药可向所输注的脑半球提供了更多的NAC。当i.v.给药，在脑部仅发现微量的NAC(注射剂量的0.03％，n＝2)。当放射性标记的NAC经动脉内输注到大鼠的右侧颈总动脉中以后，发现高水平的放射标记分布于右侧脑半球中。其中的传递量为注射剂量的0.41％(n＝3)，相当于在肝(注射剂量的0.57％)或肾(注射剂量的0.70％)中的水平。相比之下，左侧颈总动脉输注法可防止向脑部传送药物。左侧颈总动脉输注方法也改变了在外周组织中的生物分布，即向肝的传递量减小而向肾的传递量增加。不同给药方式可改变向组织中的传递，这可能是由于NAC是氨基酸有关的半胱氨酸，它可通过氨基酸转运蛋白而迅速地被组织结合。总之，NAC的给药方法显著地影响其生物分布。
实施例3该实施例测试了本发明方法用于动脉内输注(经左侧颈总动脉动脉，左侧颈内动脉闭塞)是否能降低NAC向脑部的传递以及是否能提高全身分配。本发明方法的脑部传递量为注射剂量的0.04％(n＝2)。
这些结果结合其他药理学和生理学数据均表明，在施用细胞毒素剂之前(优选30分钟之前)，给予一定剂量的N-乙酰半胱氨酸(可提供0.5mM-15.0mM、优选为5mM-12.5mM的NAC血清浓度)时，NAC显示出保护作用。通常，40.0mg/kg-1000mg/kg剂量的N-乙酰半胱氨酸，可向人和其他哺乳动物提供适当的血清浓度。
实施例4该实施例对本发明方法施用化疗剂(单独或联用)、单用NAC(1000-1200mg/m2，单用或联用)和NAC加上STS给药的骨髓毒性进行了比较。化疗剂是卡铂(200mg/m2)、美法仑(10mg/m2)和磷酸依托泊苷(100mg/m2)。大鼠中的STS剂量是8g/m2，该量与人用的20g/m2相当。给药方法是左侧颈总动脉输注法。表3a和3b是按骨髓细胞谱系表示的数据。
表3awbc wbc wbc血小板Plt pltchemo均值9.2 0.7 3.2759.0 63.3164.0sd 3.6 0.2 1.6260.5 59.091.0n 743 7 4 3chemo+ 均值7.1 1.4 5.2772.3 132.0 1559.0sd 2.7 1.1 1.7171.5 36.8567.1n 42 2 4 2 2chemo+ 均值9.5 2.8 8.6936.5 554.0 1950.0NAC+ sd 6.0 0.4 3.6186.0 147.1 134.4n 222 2 2 2表3bchemo+BSO wbc基值 wbc d6 wbc d9 plt基值 plt d6 plt d9均值±sd 6.8±0.80.8±0.2 5.4±1.1 930±63 92±28 387±139n11 11 6 11 11 6BSO+chem+NAC wbc基值 wbc d6 wbc d9 plt基值 plt d6 plt d9均值±sd 8.4±1.52.2±0.3 7.6±1.2 818±99 341±791560±194n99 6 99 6这些数据显示了本发明方法联合施用含硫醇化学保护剂STS和NAC的协同作用。
实施例5该实施例提供了联用紫杉烷(紫杉醇)、紫杉醇-细胞毒增强剂BSO和谷胱甘肽还原剂NAC体外对肿瘤细胞培养物的试验结果。1-10μM浓度的紫杉醇对培养的细胞表现出细胞抑制性(即肿瘤细胞不再生长也不被杀死)。20μM的紫杉醇开始具有细胞毒性，在30μM时对培养的肿瘤细胞中表现出完全的毒性。当肿瘤细胞是经BSO预处理的细胞时，加入5μM低剂量的紫杉醇即具有完全的体外细胞毒性。
NAC对单用紫杉醇时的量效关系没有影响。然而，NAC完全逆反了BSO处理后的增强毒性，将紫杉醇的浓度效应降至不含BSO时的水平。该试验重复2次，数据见表4。
表4处理紫杉醇剂量 活细胞(WST荧光)单用紫杉醇5 1.274±.07120 0.771±.056紫杉醇+NAC5 1.369±.06120 0.823±.094BSO+紫杉醇5 0.056±.004**20 0.045±.004**BSO+紫杉醇+NAC5 1.419±.095*20 0.732±.100**与BSO和紫杉醇有显著性差异**与单用紫杉醇有显著性差异实施例6抗细胞毒性的化学保护作用采用四种不同的含硫小分子量化学保护剂，评价了对于化疗细胞毒性获救的量/效关系。每种化疗剂的浓度足以导致约90％致死率(在缺乏BSO情况下)，其中美法仑为20μ/ml、卡铂为200μ/ml、顺铂为15μg/ml。，NAC是待试硫醇剂中最有效的(μg/ml水平)。附图3A和3B显示了N-乙酰半胱氨酸与D-蛋氨酸在保护作用的浓度依赖性方面的比较结果，表5为每种保护剂提供保护作用下的EC60。如附图3A和表5所示，与N-乙酰半胱氨酸同时施用，可使每种烷化剂的细胞毒性降低75-90％，但是与对抗铂剂的效果相比，N-乙酰半胱氨酸可更有效地对抗美法仑(EC50＝74±18μg/ml)。与之相反的是，D-蛋氨酸对顺铂毒性表现出较高的对抗作用(半数最高浓度为140±41μg/ml)，但是在其测试剂量(50-1000μg/ml)时却不再对抗美法仑毒性(如附图3B和表5所示)。试验中保护作用的最大范围在约70％-100％的范围内变化，并且对卡铂的保护作用始终低于顺铂或美法仑。与对抗顺铂或美法仑相比，所有待试试剂均需要明显更高的剂量才能抗卡铂。在μg/ml水平上，GSH乙酯是效果最差的保护剂。
每种化疗剂的用量均固定其在90％致死剂量。EC50的测量包括6个浓度(每一浓度有4孔)，对每种保护剂的每一量效关系测量2次。EC50浓度以μg/ml表示，为2个独立试验的均值±合并标准偏差。至于D-蛋氨酸与美法仑的联用，并没有发现保护作用。分别以美法仑相对于顺铂、顺铂相对于卡铂、和卡铂相对于美法仑，就每种化学保护剂对它们的保护作用进行了t-检验比较，并标示出相互间的显著性差异(**＝P＜0.01；***＝P＜0.001)。
表5.对抗化疗的细胞毒性化学化学保护剂EC50(μg/ml)治疗N-乙酰半胱氨酸硫代硫酸钠 D-蛋氨酸 GSH乙酯美法仑 74±18***110±78 无***303±124***顺铂151±15**86±76**140±41***530±30***卡铂200±15***442±203**379±123***995±48***实施例7细胞增强作用与和化学保护作用的组合在B.5LX-1细胞中，评价了BSO细胞增强作用和含硫醇化学保护作用对烷化剂化疗细胞毒性的量/效关系的影响。BSO细胞增强作用包括在化疗之前用100μM BSO预温育约18-24小时，援救包括在化疗后立即加入1000-2000μg/ml的含硫醇化学保护剂。如附图4A和表6所示，BSO始终降低细胞毒性的EC50，并增加了毒性最大值。附图4A为卡铂和N-乙酰半胱氨酸的具体情况。经BSO处理所致的谷胱甘肽耗损增加了卡铂的细胞毒性，使EC50降低48％(P＜0.01)。如表6所示，BS0对美法仑也具有相似的细胞增强作用(EC50降低53％，P＜0.001)，而对于顺铂，其EC50仅降低29％(P＜0.05)。N-乙酰半胱氨酸的化学保护阻断了卡铂毒性和BSO增强的细胞毒性。硫代硫酸钠和GSH乙酯等硫醇剂也具有类似的化学保护作用，但是D-蛋氨酸仅能有效地对抗铂剂。
同时，也评价了对非烷化剂化疗的细胞增强和化学保护作用。如附图4B所示，经BSO处理所致的谷胱甘肽耗损不能增强磷酸依托泊苷的细胞毒性，同时N-乙酰半胱氨酸也未能降低磷酸依托泊苷的细胞毒性。同样地，尽管BSO对源于胃的癌细胞表现出一定的增强作用(未给出数据)，但在B.5 LX-1细胞中也未发现对甲氨蝶呤或阿霉素的细胞增强或保护作用。有趣的是，虽然BSO没有改变紫杉醇的生长抑制剂量(大约10nM)，但是谷胱甘肽耗损却将紫杉醇的细胞毒性剂量由15μM改变为2μM，并且N-乙酰半胱氨酸完全逆反了这种增强的细胞毒性(数据未给出)。
在GM 294人纤维母细胞的细胞株中进行类似的试验，以确定在B.5 LX-1 SCLC细胞中发现的细胞增强和化学保护作用是否为一种普遍现象。未经或经化疗处理(用量约为在B.5 LX-1细胞中发现的最大剂量的一半)的细胞，经或不经BSO预处理。如附图3A和3B所示，尽管美法仑、顺铂和卡铂在纤维母细胞中的细胞毒性均稍微强于在肿瘤细胞中的细胞毒性，BSO增加了这三种烷化剂的毒性。在纤维母细胞中，N-乙酰半胱氨酸可部分至完成地化学保护以对抗由美法仑、顺铂和卡铂引起细胞毒性，并不受BSO处理的影响。如附图5所示，在纤维母细胞中，BSO的细胞增强作用和N-乙酰半胱氨酸的化学保护作用均不能影响磷酸依托泊苷的细胞毒性。
细胞毒性的半数最大浓度(EC50)以μg/ml表示。EC50的测量包括6个浓度(每一浓度有4孔)，对每种保护剂的每一量效关系测量3次。数据为3个独立试验的均值±合并标准偏差。P值用来表示BSO处理后EC50降低的显著性(*＝P＜0.05，**＝P＜0.01，***＝P＜0.001)。
表6.BSO对烷化基化疗中细胞毒性的影响化学疗法EC50(μg/ml)美法仑 顺铂卡铂不含BSO 13.8±1.8 8.9±2.4 103±21+BSO 6.4±0.6***6.4±0.9*55±15**实施例8对化疗细胞毒性进行化学保护剂援救的时间依赖性对化疗后需要延迟多长时间再加入化学保护剂以及保护剂的效力能保持多久进行了评价。细胞经大约90％致死率的化疗剂量处理，分别为美法仑20μg/ml、卡铂(200μg/ml)或顺铂(15μg/ml)。可在化疗同时或化疗后8小时内，加入含硫醇化学保护剂。如果延时2小时施用STS则降低其对美法仑的化学保护作用，而处理后延时4小时施用硫代硫酸钠对铂化疗仍具有保护作用，结果如附图6所示。同样地，延迟施用N-乙酰半胱氨酸和GSH乙酯，降低了它们对抗美法仑细胞毒性的保护活性，但是二者对抗铂细胞毒性的保护活性无变化。如果在施用美法仑的1小时之内(而不是2小时)分别加入三种试剂，则可提供完全的保护作用，结果如附图6所示。化学保护在任何时间段均都不能有效对抗磷酸依托泊苷的细胞毒性。
对D-蛋氨酸援救顺铂细胞毒性的时间依赖性也进行了评价。与硫代硫酸盐、N-乙酰半胱氨酸或GSH乙酯的化学保护作用不同，延时施用D-蛋氨酸的保护作用显著降低。与同时给予的最大保护相比，施用顺铂后延时2小时给予D-蛋氨酸，其保护作用降低41.2±10.2％，而延时4小时给予D-蛋氨酸，与同时给予的保护相比，则降低66.1±4.5％。与同时给予的保护相比，加入顺铂之前用D-蛋氨酸预处理30分钟，不会增加其保护作用。
实施例9细胞增强作用和化学保护作用对细胞凋亡的效力通过测量半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2的酶促活性和用原位TUNEL染色，对细胞凋亡进行评价。用美法仑处理的B.5 LX-1细胞其半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2活性增加，经BSO预处理后低浓度的美法仑即可使细胞的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2活性增强，如附图7A所示。酶活性的增加在试验间是变化的，在美法仑处理7-8小时后的50-100％至处理20-24小时后的250-600％范围中变化。TUNEL染色也证实了美法仑导致的细胞凋亡。附图7B所示的试验中，美法仑处理之后再经TUNEL染色，在3643细胞中29个是阳性染色，而在未处理对照品中4395细胞中7个是阳性染色，在美法仑之前经BSO处理可将1699细胞中的阳性染色细胞增加至800个。如附图7A所示的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2分析和附图7B所示的TUNEL染色分析所示，化学保护剂N-乙酰半胱氨酸降低了美法仑对细胞凋亡的作用。在两项分析中，采用低剂量的美法仑或用细胞毒性分析中所用的剂量进行1小时脉冲处理，可使活性升为最高。用细胞毒性剂量的美法仑连续处理实际上降低了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2活性和TUNEL染色。
与美法仑相比，顺铂和卡铂在诱发半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性方面的效力较低。超过一定剂量范围(100、150或200μg/ml卡铂，和5、10或15μg/ml顺铂)和时间(8、12、16、20、24小时)，每种铂剂都可使半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2活性增加50-100％。BSO处理不能显著增加半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活性。另外，施用N-乙酰半胱氨酸后，没有检测出半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶酶促活性的降低，而在经N-乙酰半胱氨酸处理的一些试验中，实际上增加了顺铂或卡铂诱发的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性。采用台盼蓝分离术，对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和TUNEL分析中所用的细胞样品进行了膜通透性评价。在产生半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2阴性结果的试验或TUNEL分析中，表明经卡铂或顺铂处理后非存活细胞的数目较高并可通过BSO处理而增加。
实施例10放射性标记的NAC的生物分布对NAC的给药方法及其生物学分布进行了实验。对逆行经由左颈外动脉(暂时性左侧颈内动脉闭塞)的动脉内输注进行了评价，基本上经由降主动脉灌注向脑部限制性给药。如附图8所示，当i.v.给予NAC时，通过测定每克组织中14C-NAC的给药剂量百分率，发现脑部仅有微量的NAC。经右颈内动脉进行动脉内给药，可使右侧大脑半球中的放射性标记水平较高，并且该量不会因BBBD而增加。然而，主动脉输注的NAC脑部给药量最低(如附图8所示)。在低剂量(140mg/kg)NAC的情况下，主动脉输注降低了向肝脏的传递但增加了向肾脏的传递，而在高剂量(1200mg/kg)NAC的情况下，向肝脏和肾脏中的传递则没有变化(未给出数据)。以1200mg/kg给药10分钟之后，通过检测血中剩余量的放射性标记，测定NAC的血清浓度为2.4 0.6mg/ml(n＝6)。
实施例11NAC的毒性加大给予大鼠的NAC剂量。化疗后立即i.v.给予初剂量为140-800mg/kg的NAC(n＝4)，大鼠可很好地耐受，但并未提供可检测到水平的骨髓保护作用。高于1200mg/kg的NAC表现出毒性(n＝3)，但是在1200mg/kg时无毒性。因此，采用1200mg/kg剂量的NAC供骨髓保护作用研究，但是在与STS联用给药时，NAC的剂量为1000mg/kg(出于容量上的考虑)。
检测了用于骨髓保护而输注的NAC的毒性。结果如附图9所示。NAC导致的死亡率明显取决于给药途径，i.v.给药的毒性明显高于主动脉输注(P＝0.0014)。用BSO进行预处理，显著增加了NAC的毒性。BSO处理后经i.v.给予NAC的动物组因死亡率过高而提前中止(中止规则是n＝4动物之内的死亡率为75％)。血压监测表明，在所有组中选择的动物中(n＝21)，大多数死亡的动物均经历了持续性急性低血压，这暗示出现了心脏毒性。然而，特别注意的是，化疗30分钟之前经主动脉输注施用1200mg/kg NAC(未经BSO处理)的12个动物中，既没有死亡也没有任何毒性迹象。
实施例12NAC对化疗导致骨髓毒性的效力对BSO处理和未经处理的动物，经i.a.给予卡铂、磷酸依托泊苷和美法仑，测定了对抗化疗导致骨髓毒性的化学保护作用。在化疗30分钟前或之后立即经i.v.或主动脉输注施用NAC(含有或不含STS)。与未施用化学保护剂的动物相比，施用了NAC的动物的最低血液计数(白细胞、粒细胞、血小板)提高，这显示了NAC的化学保护作用(参见表7和表8)。如附图10所示，不论动物是否经BSO预处理，这种化学保护作用均有效，化疗所致骨髓毒性的程度被降低到最低，并且促进其恢复到正常的血小板水平。
表7.对抗化疗所致骨髓抑制的保护作用处理 大鼠白细胞最低值 粒细胞最低值 血小板最低值无保护剂 N＝624.5±5.8 20.7±11.0 22.7±8.7Chemo后i.v.NAC N＝646.0±6.5*57.9±8.8*36.8±10.430分钟之前i.v.NACN＝851.4±9.4 93.5±28.1 53.3±12.7Chemo后主动脉输注NAC N＝625.9±4.9 36.6±17.0 26.8±9.330分钟之前主动脉输注NAC N＝669.7±19.3 206.2±125.1*59.3±17.930分钟之前主动脉输注NACN＝653.8±12.8*83.4±21.3*47.0±11.5+chemo后STS最低血液计数(基线百分比)为均值和标准误差*表示与无保护剂相比P＜0.05，Wilcoxon/Kruskal-Wallis等级和检验表8.对BSO-增强的化疗所致骨髓抑制的保护作用处理 大鼠 白细胞最低值粒细胞最低值血小板最低值无保护剂 N＝11 12.9±3.5 3.5±1.39.1±2.3chemo后主动脉输注NAC N＝7 13.9±4.2 19.8±14.7 11.7±3.530分钟之前主动脉注NACN＝9 20.1±2.7 115.4±68.8*23.1±6.230分钟之前主动脉输注NAC N＝7 30.5±6.5*121.0±40.2*39.0±7.4*+chemo后STS最低血液计数(基线百分比)为均值和标准误差*表示与无保护剂相比P＜0.05，Wilcoxon/Kruskal-Wallis等级和检验如附图10A和10C所示，在未经BSO处理的动物中，经主动脉输注NAC(1200mg/kg)进行预处理(含或不含STS)，是最好的处理方案。化疗之前30分钟经主动脉输注施用NAC，完全阻止了化疗所致粒细胞计数的减少(p＜0.05，如附图10A所示)，并降低血小板毒性(如附图10C所示)。
在经BSO预处理的动物中，约在化疗30分钟前经主动脉输注施用NAC，对粒细胞提供了良好的保护作用，但是最好的保护作用和最小的死亡率是化疗前经主动脉输注施用NAC和在化疗后立即施用STS所提供的(如图10B和10D所示)。化学保护剂联用方案(NAC和STS)显著地阻止了对粒细胞的毒性(p＜0.01，如附图10B所示)，并且与没有接受化学保护的动物相比，也显著地阻止了对血小板的毒性(p＜0.01，如附图10D所示)。化学保护也显著增强了血小板从化疗中的恢复。单用STS没有提供相应的骨髓保护作用(数据未给出)。
应当指出的是，上述讨论仅是描述性、说明性和示例性的，并不对所附任一权利要求所定义的范围作限制。
权利要求
1.一种用于治疗或减轻对脑、头或颈部肿瘤进行细胞毒素癌症治疗所致副作用的方法，包括给予细胞毒素剂和经动脉内施用含硫醇化学保护剂，其中化学保护剂的动脉内施用定位于降主动脉或降主动脉的更下端处。
2.如权利要求1的用于治疗或减轻对脑、头或颈部肿瘤进行细胞毒素癌症治疗所致副作用的方法，其中细胞毒素剂是癌症化学治疗剂。
3.如权利要求2的用于治疗或减轻对脑、头或颈部肿瘤进行细胞毒素癌症治疗所致副作用的方法，其中癌症化学治疗剂选自顺铂化合物、紫杉烷、甾体衍生物、抗代谢物，长春花生物碱，阿霉素和阿霉素、依托泊苷、砷衍生物、嵌入剂、烷化剂，以及它们的组合。
4.如权利要求1的用于治疗或减轻对脑、头或颈部肿瘤进行细胞毒素癌症治疗所致副作用的方法，其中在给予含硫醇化学保护剂8小时之内施用细胞毒素剂(放射或化学治疗剂)。
5.如权利要求1的用于治疗或减轻对脑、头或颈部肿瘤进行细胞毒素癌症治疗所致副作用的方法，其中施用的细胞毒素剂可使其所施用的大多数剂量直接到达肿瘤定位的头或颈部区域。
6.如权利要求1的用于治疗或减轻对脑、头或颈部肿瘤进行细胞毒素癌症治疗所致副作用的方法，通过导管插入术操作经由定位于降主动脉中的具有顶端的导管，施用无热原的无菌溶液中的含硫醇化学保护剂。
7.如权利要求1的用于治疗或减轻对头或颈部肿瘤进行细胞毒素癌症治疗所致副作用的方法，其中每次操作中含硫醇化学保护剂的剂量约为200mg/m2-40g/m2。
8.如权利要求1的用于治疗或减轻对头或颈部肿瘤进行细胞毒素癌症治疗所致副作用的方法，其中含硫醇化学保护剂选自N-乙酰半胱氨酸(NAC)、硫代硫酸钠(STS)、GSH乙酯、D-蛋氨酸、Ethyol，以及它们的组合。
9.如权利要求8的用于治疗或减轻对头或颈部肿瘤进行细胞毒素癌症治疗所致副作用的方法，其中每次操作中含硫醇化学保护剂的剂量约为400mg/m2-1200mg/m2，和STS的剂量约为5g/m2-40g/m2。
10.经动脉导管施用治疗脑、头或颈部肿瘤的药物组合物，包括被传递至颈总动脉的第一种药物；和传递到降主动脉或更下端处的第二种药物，其中第一种药物是用于癌症化疗且能导致全身性骨髓抑制副作用的细胞毒素化合物，第二种药物是含硫醇的化学保护剂。
11.如权利要求10的经动脉导管施用治疗脑、头或颈部肿瘤的药物组合物，其中第一种药物选自顺铂化合物、紫杉烷、甾体衍生物、抗代谢物，长春花生物碱，阿霉素和阿霉素、依托泊苷、砷衍生物、嵌入剂、烷化剂，以及它们的组合。
12.如权利要求10的经动脉导管施用治疗脑、头或颈部肿瘤的药物组合物，其中在给予第二种药物8小时之内(之前、期间或之后施用第一种药物，并且第二种药物是以无热原的无菌溶液形式施用。
13.如权利要求10的经动脉导管施用治疗头或颈部肿瘤的药物组合物，其中每次操作中含硫醇化学保护剂的剂量约为400mg/m2-1200mg/m2。
14.如权利要求10的经动脉导管施用治疗头或颈部肿瘤的药物组合物，其中含硫醇化学保护剂选自N-乙酰半胱氨酸(NAC)、硫代硫酸钠(STS)、GSH乙酯、D-蛋氨酸、Ethyol，以及它们的组合。
15.如权利要求14的经动脉导管施用治疗头或颈部肿瘤的药物组合物，其中每次操作中NAC的剂量约为400mg/m2-1200mg/m2。
16.向器官或组织区域定位施用含硫醇化学保护剂以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的方法，包括将动脉内导管定位于向可能受损的位置或器官供应血流的动脉；和经由定位的动脉导管施用含硫醇化学保护剂。
17.如权利要求16的向器官或组织区域定位施用含硫醇化学保护剂以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的方法，所述损伤是由于注入放射线造影剂以定位动脉内导管所造成的。
18.如权利要求16的向器官或组织区域定位施用含硫醇化学保护剂以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的方法，其中含硫醇的化学保护剂化合物选自N-乙酰半胱氨酸(NAC)、硫代硫酸钠(STS)、GSH乙酯、D-蛋氨酸、Ethyol，以及它们的组合。
19.如权利要求16的向器官或组织区域定位施用含硫醇化学保护剂以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的方法，其中通过导管插入术操作经由动脉内定位于循环系统某一位置的具有顶端的导管，施用在无热原、无氧化的无菌溶液中的含硫醇化学保护剂。
20.如权利要求16的向器官或组织区域定位施用含硫醇化学保护剂以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的方法，其中每次操作中含硫醇化学保护剂的剂量约为200mg/m2-40g/m2。
21.如权利要求18的向器官或组织区域定位施用含硫醇化学保护剂以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的方法，其中每次操作中含硫醇化学保护剂的剂量约为400mg/m2-1200mg/m2，和STS的剂量约为5g/m2-40g/m2。
22.如权利要求16的向器官或组织区域定位施用含硫醇化学保护剂以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的方法，其中含硫醇化学保护剂是以无热原、无氧化的无菌溶液形式给药，所述溶液中包含还原剂、保持pH在或接近生理pH的缓冲液和金属螫合剂，所述螫合剂能与催化含硫醇化学保护剂氧化的金属离子结合。
23.如权利要求22的向器官或组织区域定位施用含硫醇化学保护剂以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的方法，其中还原剂选自维生素E、生育酚、二硫苏糖醇、硫基乙醇、谷胱甘肽，以及它们的组合。
24.如权利要求22的向器官或组织区域定位施用含硫醇化学保护剂以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的方法，其中缓冲液是相对无毒并可保持pH为6-8的缓冲液。
25.如权利要求16的向器官或组织区域定位施用含硫醇化学保护剂以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的方法，其中含硫醇化学保护剂贮藏于充有惰性气体保护层的小瓶中。
26.如权利要求25的向器官或组织区域定位施用含硫醇化学保护剂以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的方法，其中惰性气体选自氩、氦、氮及它们的混合物。
27.用于治疗以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的药物组合物，包括用于动脉内给药的第一种药物或操作，和用于动脉内给药的第二种药物，其中第二种药物还包括还原剂或抗氧化剂。
28.如权利要求27的用于治疗以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的药物组合物，其中第一种药物是放射线造影剂。
29.如权利要求27的用于治疗以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的药物组合物，其中在施用第二种药物的8小时内给予第一种药物。
30.如权利要求27的用于治疗以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的药物组合物，第二种药物是以无热原的无菌溶液形式给药。
31.如权利要求27的药物组合物，其中第二种药物是含硫醇的化学保护剂。
32.如权利要求31的用于治疗以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的药物组合物，其中含硫醇保护剂选自N-乙酰半胱氨酸(NAC)、硫代硫酸钠(STS)、GSH乙酯、D-蛋氨酸、Ethyol，以及它们的组合。
33.如权利要求31的用于治疗以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的药物组合物，其中每次操作中含硫醇化学保护剂的剂量约为200mg/m2-2000mg/m2。
34.如权利要求32的用于治疗以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的药物组合物，其中每次操作中NAC的剂量约为400mg/m2-1200mg/m2。
35.如权利要求31的用于治疗以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的药物组合物，其中含硫醇化学保护剂是以无热原的含有还原剂的非氧化溶液形式给药。
36.如权利要求31的用于治疗以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的药物组合物，其中含硫醇化学保护剂是在保持pH在或接近生理pH的缓冲液中施用。
37.如权利要求31的用于治疗以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的药物组合物，其中含硫醇化学保护剂与金属螫合剂一起施用，所述螫合剂能与催化含硫醇化学保护剂氧化的金属离子结合。
38.如权利要求35的用于治疗以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的药物组合物，其中还原剂选自维生素E、生育酚、二硫苏糖醇、硫基乙醇、谷胱甘肽，以及它们的组合。
39.如权利要求36的用于治疗以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的药物组合物，其中缓冲液是相对无毒并可保持pH为6-8的缓冲液。
40.如权利要求31的用于治疗以防止诊断或治疗性动脉内操作所致损伤的药物组合物，其中含硫醇化学保护剂贮藏于充有惰性气体保护层的小瓶中。
41.如权利要求40的药物组合物，其中惰性气体选自氩、氦、氮，及其混合物。
42.向器官或组织定位施用含硫醇化学保护剂的方法，所述器官或组织选自肺、肝、肾。
全文摘要
一种施用含硫醇化学保护剂的方法，所述化学保护剂包括NAC(N－乙酰半胱氨酸)和STS(硫代硫酸钠)，所述方法能显著影响生物学分布并可防止诊断或治疗性动脉内操作所致的损伤。本发明提供了一种用于治疗或减轻对头或颈部肿瘤进行细胞毒素癌症治疗所致副作用的方法。经动脉内施用的含硫醇化学保护剂可在不同于肝的器官或组织中被迅速地首过吸收。
文档编号A61K33/04GK1443064SQ01810176
公开日2003年9月17日 申请日期2001年4月26日 优先权日2000年4月26日
发明者M·A·佩杰尔, L·穆多恩, E·A·纽威尔特 申请人:俄勒冈健康科学大学, 美国政府退伍军人事务部