一种用于表达lncRNA的慢病毒载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种用于表达lncRNA的慢病毒载体及其应用，所述慢病毒载体的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，以pLL3.7质粒为骨架，以luc2基因替换质粒EGFP基因，以核苷酸序列为SEQIDNO.4的合成序列替换mU6启动子序列；所述慢病毒载体用于lncRNA异位表达，不产生任何有效的细胞免疫应答，可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，转基因表达能持续数月，且引入luc2基因，不需要外源性激发光，避免对体内正常细胞造成损伤，有利于长期观察。
【专利说明】—种用于表达IncRNA的慢病毒载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，特别是一种用于表达IncRNA的慢病毒载体及其应用。技术背景
[0002]长链非编码RNA( long noncoding RNA,以下简称IncRNA)是一类长度大于200nt且不表现任何蛋白质编码潜能的非编码RNA (ncRNA)。IncRNA在结构上类似于信使RNA(mRNA),但序列中不存在开放阅读框(open reading frame, 0RF)。许多已知的IncRNA由RNA聚合酶(RNA polymerase II,RNA polll)转录并经可变剪切形成，通常被多聚腺苷酸化。IncRNA基因转录水平低于蛋白质编码基因，广泛存在于基因间内含子以及蛋白质编码基因的反义链中，有些与蛋白质编码基因或非编码基因相重叠，有些仅在特定的组织中被优先转录。Kapranov等提出在人类细胞中，除核糖体RNA和线粒体RNA外,绝大部分RNA是未知功能的ncRNA，其中主要是IncRNA。目前已确定的IncRNA，多数通过顺式作用调控基因的表达，影响表观遗传转录转录后等过程，参与生物体的胚胎发育组织分化器官形成等基本生命活动。与miRNA相比，IncRNA序列更长空间结构更复杂，因此信息含量更加丰富；其参与表达调控的分子机制也更加多样，不仅可以通过直接结合来激活或抑制靶基因的表达，还能参与组蛋白修饰募集调控因子等；IncRNA作用范围也更加广泛，在染色质水平、表达水平和翻译水平均可发挥调控作用。虽然目前已确定的IncRNA很多，但对其在生命活动过程中的具体调控机制及功能模式仍不清楚。最新发现，IncRNA在一些复杂疾病(如癌症、神经系统疾病等)的发生过程中异常表达，具有促使或抑制疾病发生的作用。因此，研究IncRNA对于认识生命体复杂而多层次的调控体系提高人类预防和治疗疾病的能力以及探索生物进化规律等都具 有积极的生物学意义。
[0003]目前IncRNA的表达，多以真核质粒载体实现。但是真核质粒载体存在转染效率低，不易构建稳定细胞系等缺点，因此提供一种可以实现IncRNA稳定的异位表达的载体，是本领域一直亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004]针对上述IncRNA表达载体存在转染效率低、不易构建稳定细胞系的问题，构建一种添加人EF-1a启动子序列和SV40 polyA转录终止信号序列的慢病毒载体，实现IncRNA稳定的异位表达，本发明是这样实现的:
一种用于表达IncRNA的慢病毒载体，其特征在于，以pLL3.7质粒为骨架，以luc2基因(NCBI中GI =212717248)替换质粒EGFP基因，以核苷酸序列为SEQ ID N0.4的合成序列替换质粒mU6启动子序列,所述慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。
[0005]本发明中所述luc2 (NCBI中GI =212717248)基因是以SEQ ID N0.1为上游引物，SEQ ID N0.2为下游引物，以pmirGLO质粒为模板扩增获得。
[0006]本发明中，用于表达IncRNA的慢病毒载体在IncRNA异位表达中的应用。
[0007]本发明中，用于表达IncRNA的慢病毒载体在LncRNA MEG3 (NCBI中NR_002766.2)异位表达中的应用。
[0008]本发明的优点在于:
1、相对于目前常用的真核表达质粒，以慢病毒作为表达载体，不产生任何有效的细胞免疫应答，可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，转基因表达能持续数月，且无可观察到的病理学现象。
[0009]2、荧光素酶(Luciferase)基因(luc2基因)，表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg2+离子存在的条件下消耗ATP发生氧化反应，在体外利用敏感的CXD设备形成图像，可以实时连续动态监测体内的各种生物学过程，减少实验动物数量，降低个体间差异的影响，具有较高的敏感性，并且不需要外源性激发光，避免对体内正常细胞造成损伤，有利于长期观察。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为pLL3.7质粒结构示意图。 [0011]图2为pLL3.7_luc2质粒结构示意图。
[0012]图3为pLnc_luc2质粒结构示意图。
[0013]图4为pLnc-luc2_MEG3质粒结构不意图。
[0014]图5为MEG3表达量表达量示意图。
[0015]图6为荧光检测MEG3表达量示意图。
[0016]
【具体实施方式】
[0017]实施例涉及材料:
pmirGLO 质粒(pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector, E1330)、pGEM-T Easy Vector System (E1910)由 Promega 公司购入；
感受态细胞DH5 a (CB101-03)和质粒小提试剂盒(型号DP103)由天根生化科技有限公司购入；
Taq Plus DNA Polymerase (PC1200)由北京索莱宝公司购入；
快速DNA产物纯化试剂盒(CW2301)由北京康为世纪公司购入；
T4 DNA Ligase (2011A) ,PrimeScrip RT Reagent Kit(RR037Q)由 TAKARA 公司购入；限制性内切酶 Nhe I (R0131S)、EcoR I (R0101S)、XbaI (R0145S)、NotI (R0189S)、BamH I (R0136S)和 Xho I (R0146S)酶由 NEB 公司购入；
pLL3.7 质粒、HEK-293T、pCMV — VSV — G 和 pCMV — dR8.91 由本室保存；
U251细胞由南京医科大学姚堃教授赠予； polybrene (sc-134220)由 Santa Cruz 公司购入；
RNeasy Mini Kit (74104)由 Qiagen 公司购入；
DMEM 高糖培养基(I 1965-084)和 FBS (10099141)由 Life Technologies 公司购入； AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AP-GX-4)由Axygen公司购入；
胰酶细胞消化液(C0201)和荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG005)由碧云天公司购
Λ；实施例培养基配方:
LB液体培养基:
配制每升培养基，在900 ml去离子水中加入:胰化蛋白胨IOg,酵母提取物5g,NaCl5g，摇动容器直至溶质溶解，用去离子水定容至1L，在用5mol/L NaOH调pH至7.0 ;在121°C下蒸汽灭菌20min ；
LB固体培养基:
在900 ml去离子水中加入:胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，琼脂粉15g，用去离子水定容至lL，5mol/L NaOH调pH至7.0，121°C蒸汽灭菌20min，待冷却至55°C时加入氨苄青霉素至终浓度100 μ g/ml，倾倒入无菌平板内，待凝固成LB固体培养基。
[0018]DMEM完全培养基(含10%FBS) =DMEM高糖培养基与FBS按体积比9:1混合而成； 实验设备:
PCR仪为C1000 Touch?,伯乐牛命医学产品(h.海)有限公司:
突光测定仪 Turner DesignsTD-20/20 (E2041)购自 Promega 公司；
实施例涉及引物序列:
SEQ ID N0.1: 5 ' CGGCTAGCATGGAAGATGCCAAAAACATTA 3 '；
SEQ ID N0.2: 5 ' CGGAATTCTTACACGGCGATCTTGCCGCCC 3 '；
SEQ ID N0.7 5 ' GGGCATTAAGCCCTGACCTT 3'；
SEQ ID N0.8 5 ' CCTTGGGGAGGGAAACACTC 3'。
[0019]实施例1慢病毒载体的构建 l、pLL3.7-luc2 的构建
1.1 PCR 反应:
以pmirGLO质粒为模板，上游引物SEQ ID N0.1，下游引物SEQ ID N0.2扩增luc2 ；PCR 反应体系 40KL,其中 Taq Plus DNA Polymerase 2M-L, Master mix 12M-L, pmirGLO质粒 2μ?，10Mmol/L SEQ ID N0.1 2μ?, 10Mmol/L SEQ ID N0.2 2μ?, ddH20 20μ? ；
PCR反应程序:94°C预变性3 min; 94°C变性30 s，58°C退火30s，72°C延伸60s，共进行30个循环；72°C复性IOmin ；
1.2凝胶电泳:
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，120V, 30min,依照说明书，用快速DNA产物纯化试剂盒回收目的片段，获得纯化PCR产物；
1.3克隆载体的构建
在0.2ml PCR管中加入5 μ L步骤1.2获得的纯化PCR产物、I μ L 10Χ Ligationbuffer,3 μ L PGEM T Easy VectorU μ L Τ4 DNA Ligase，4°C下连接过夜，次日获得连接产物；
1.4感受态细菌的转化
1.4.1取5 UL步骤1.3获得的连接产物，加入50 μ L感受态细胞DH5 α，混匀后冰浴30min，后42°C热击90s，再冰浴3min，加入500 μ L LB液体培养基，混匀后37°C，200rpm/min震荡培养45min，获得转化后的连接产物；
1.4.2 将 x-gal 40 μ L (20mg/ml)和 IPTG 4μ L (200mg/ml)涂布于 LB 固体培养基上，加入200 μ L步骤1.4.1获得的转化后的连接产物，37°C倒置培养20h，培养基上生成白色菌落，这些白色菌即具有重组质粒；
1.5鉴定
随机挑取步骤1.4.2获得的2个菌落，分别接种于2mL LB液体培养基中，在37°C，250rpm/min条件下震荡培养过夜，次日依照说明书，使用质粒小提试剂盒获得重组质粒DNA;然后由金斯瑞生物科技有限公司对所获得的的重组质粒DNA进行测序验证，其序列与NCBI中GI =212717248序列相同，确定为luc2基因。
[0020]1.6 重组 pLL3.7 质粒
1.6.1对步骤1.5获得重组质粒DNA和pLL3.7 (其质粒结构如图1所示)质粒分别进行Nhe I和EcoR I双酶切，酶切体系分别为:
重组质粒 DNA 6 μ L (310ng/y L) +IOx buffer 2 μ L+Nhe I I μ L+EcoR I Iμ L+ddH20 10 μ L ；
pLL3.7 质粒(300ng/y L) 10 μ L+10x buffer 2 μ L+Nhe I I μ L+EcoR I I μ L+ddH206 μ L ；
将上述反应体系分别于37°C，反应4h，后进行琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，后使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，分别按照说明书回收电泳产物，即分别为重组质粒DNA酶切后纯化产物和PLL3.7质粒酶切后纯化产物；
1.6.2在0.2ml PCR管中加入5 μ L步骤1.6.1获得的重组质粒DNA酶切后纯化产物、I μ L IOX Ligation buffer,3 μ L步骤1.6.1获得的pLL3.7质粒酶切后纯化产物、IUL T4 DNA Ligase，4°C下连接过夜，次日获得连接产物；取10 yL连接产物，加入50 μ L感受态细胞DH5 α，混匀后冰浴30min，后42°C热击90s，再冰浴3min，加入500 μ L LB液体培养基，混匀后37°C，200rpm/min震荡培养45min后获得菌液；取200 μ L获得的菌液涂布于LB固体培养基上，37°C倒置培养20h，培养基上生成菌落。
[0021]1.6.3 鉴定:
随机挑取步骤1.6.2获得的2个菌落，分别接种于2mL LB液体培养基中，在37°C，250rpm/min条件下震荡培养过夜，次日依照其说明，使用质粒小提试剂盒提取重组质粒，浓度为270ng/y L ;然后将获得的重组质粒交由金斯瑞生物科技有限公司完成测序，其序列如SEQ ID N0.3所示， 申请人:将其命名为pLL3.7_luc2，其质粒结构如图2所示。
[0022]2、pLnc_luc2 构建
2.1依人EF-1 α启动子序列、SV40 polyA转录终止信号序列及Xba I和Not I酶切位点序列设计合成序列,其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，交由金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成；
2.2对步骤2.1获得的的合成产物和步骤1.6.获得的pLL3.7_luc2质粒进行双酶切:酶切体系分别为:
合成产物 6 μ L (150 ng/μ L) +IOx buffer 2 μ L+Xba I I μ L+Not I I μ L+ddH2010μ L ；
pLL3.7-luc2 质粒 10 μ L (300 ng/μ L) +IOx buffer 2 μ L+Xba I I μ L+Not II μ L+ddH20 6 μ L ；
将上述酶切体系分别置于37°C反应4h，后进行琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，再使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，按照试剂盒操作要求回收电泳产物，获得合成序列酶切后纯化产物和PLL3.7-luc2质粒酶切后纯化产物；
在0.2ml PCR管中加入5 μ L合成序列酶切后纯化产物、I μ L IOX Ligation buffer、3 yL pLL3.7-luc2质粒酶切后纯化产物、I μ L T4 DNA Ligase，4°C下连接过夜，次日获得连接产物；取10 UL连接产物，加入50 μ L感受态细胞DH5 α，混匀后冰浴30min，后42°C热击90s，再冰浴3min，加入500 μ L LB液体培养基，混匀后37°C，200rpm/min震荡培养45min后获得菌液；取200 μ L获得的菌液涂布于LB固体培养基上，37°C倒置培养20h，培养基上生成菌落。
[0023]鉴定:随机挑取生成的2个菌落，分别接种于2mL LB液体培养基中，在37°C，250rpm/min条件下震荡培养过夜，次日依照其说明使用质粒小提试剂盒获得目的质粒，浓度为250ng/ μ L ;将目的质粒交由金斯瑞生物科技有限公司对目的基因进行测序，其序列如SEQ ID N0.5所示， 申请人:将其命名为pLnc-luc2，其质粒结构如图3所示。
[0024]
实施例2 pLnc_luc2质粒表达LncRNA MEG3
LncRNA MEG3质粒(NCBI中NR_002766.2)由金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成。
[0025]1、对LncRNA MEG3质粒和实施例1获得的pLnc_luc2质粒进行BamH I和Xho I双酶切，反应体系如下:
LncRNA MEG3 质粒 6 μ L(260ng/μ L)+10x buffer 2 μ L+BamH I I μ L+Xho I I μ L+ddH2010μ L ；
pLnc_luc2 质粒 10 μ L(320ng/μ L)+10x buffer 2 μ L+ BamH I I μ L+Xho I I μ L+ddH206 μ L ；
将上述反应体系分别置于37 V反应4h，后进行琼脂糖凝胶电泳，120V,30min,电泳后，使用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒，按照说明书，回收电泳产物，获得LncRNA MEG3 DNA酶切后纯化产物和pLnc-luc2质粒酶切后纯化产物；
鉴定:在0.2ml PCR管中加入5 μ LLncRNA MEG3 DNA酶切后纯化产物、I μ L IOXLigation buffer、3 μ LpLnc_luc2质粒酶切后纯化产物、I μ L T4 DNA Ligase, 4°C下连接过夜，次日获得连接产物；取10 UL连接产物，加入50 μ L感受态细胞DH5 α，混匀后冰浴30min，后42°C热击90s，再冰浴3min，加入500 μ L LB液体培养基，混匀后37°C，200rpm/min震荡培养45min，获得菌液；取200 μ L获得的菌液涂布于LB固体培养基上，37°C倒置培养20h，培养基上生成菌落。
[0026]随机挑取生成的2个菌落，分别接种于2mL LB液体培养基中，在37°C，250rpm/min条件下震荡培养过夜，次日使用质粒小提试剂盒，依照说明书，获得重组质粒DNA，其浓度为350 ng/μ L ;将重组质粒交由金斯瑞生物科技有限公司完成测序，其序列如SEQ ID N0.6所示，从核苷酸序列中可以看出，MEG3基因已经插入到pLnc-lUc2质粒中， 申请人:将该重组质粒自命名为pLnc-luc2-MEG3，其结构如图4所示。
[0027]2、细胞培养及病毒包装
2.1细胞培养及pLnc-luc2-MEG3病毒包装
在6孔细胞培养板中每孔接种约I X IO6个HEK-293T细胞，分别加入2mL DMEM完全培养基，37 °C，5%C02培养24h，当细胞汇合度达到80%~90%时，按照I ipof ectin2000 Transfection Reagent 说明书(Life Technologies, 11668019)将三质粒系统(pLnc-luc2-MEG3,1.5 g; pCMV - VSV - G, 0.5 g; pCMV — dR8.91，I g)转染至 HEK-293T细胞中，转染48h后，收集培养上清液，4°C下，3000g离心lOmin，去除细胞碎片，然后将所得上清液用0.22 μ m滤膜过滤，滤液即为pLnc-luc2-MEG3病毒液；
2.2细胞培养及pLnc-luc2病毒包装
在6孔细胞培养板中每孔接种约IX IO6个HEK-293T细胞，分别加入2mL DMEM完全培养基，37°C，5%C02培养24h，当细胞汇合度达到80%~90%时，按照Iipofectin 2000Transfection Reagent 说明书(Life Technologies, 11668019)将三质粒系统(pLnc_luc2,1.5 g; pCMV - VSV - G,0.5 g; pCMV — dR8.91，I g)转染至 HEK-293T 细胞中，转染 48h后，收集培养上清液，4°C下，3000g离心lOmin，去除细胞碎片，然后将上清液用0.22 μ m滤膜过滤，滤液即为pLnc-luc2病毒；
3、慢病毒感染U251细胞
3.1取步骤2.1获得的pLnc-luc2-MEG3病毒液0.2 ml，加入I ml的DMEM高糖培养基稀释病毒，在加入终浓度为5μ g / ml的polybrene,获得含pLnc_luc2_MEG3病毒的DMEM
培养基；
3.2接种U251细胞于6孔板，1O5个/孔，分别加入DMEM完全培养基2 ml/孔，37°C，5%C02培养24h，待细胞 密度约为50%时，去除培养基，分别加入步骤3.1获得的含pLnc-luc2-MEG3病毒的DMEM培养基，Iml/孔，培养24h后，去除含pLnc-luc2_MEG3病毒的DMEM培养基培养基，分别加入DMEM完全培养基，2 ml/孔；再分别每孔加入Iml的胰酶细胞消化液，待细胞消化后，用DMEM完全培养基稀释成20个/ml，用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为I个/孔，37°C，5%C02培养7天；选择只有一个集落生长的孔，待集落布满孔底的1/3~1/2时，传代入六孔板，即为pLnc-luc2-MEG3载体过表达细胞克隆株；
3.3取步骤2.2获得的pLnc-luc2病毒液0.2 ml，加入I ml的DMEM高糖培养基稀释病毒，在加入终浓度为5 μ g / ml的polybrene,获得含pLnc_luc2病毒的DMEM培养基；
3.4接种U251细胞于6孔板，IO5个/孔，加入DMEM完全培养基2 ml/孔，37°C，5%C02培养24h，待细胞密度约为50%时，去除培养基，加入步骤3.3获得的含pLnc-luc2病毒的DMEM培养基，Iml/孔，培养24h后，去除含pLnc_luc2病毒的DMEM培养基，加入DMEM完全培养基，2 ml/孔；再每孔加入Iml的胰酶细胞消化液，待细胞消化后，用DMEM完全培养基稀释成20个/ml，用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为I个/孔，370C，5%C02培养7天。选择只有一个集落生长的孔，待集落布满孔底的1/3~1/2时，传代入六孔板，即为pLnc-luc2载体过表达细胞克隆株；
4、荧光定量PCR检测MEG3基因表达量
分别接种U251细胞、步骤3.4获得的pLnc-luc2载体过表达细胞和步骤3.2获得的pLnc-luc2-MEG3载体过表达细胞于培养瓶(25cm2生长面积)中，分别编号1_3，在细胞铺满80%~90%瓶底面积时，依照说明书，分别用RNeasy Mini Kit提取各组细胞的总RNA，利用PrimeScrip RT Reagent Kit 将总 RNA 逆转录为 cDNA (依照 PrimeScrip RT Reagent Kit说明书)，分别以1-3组细胞的cDNA为模板，上游引物SEQ ID N0.7，下游引物SEQ ID N0.8，利用 SYBR Primescript RT-PCR Kit (依照 Primescript RT-PCR Kit 说明书)，依照表 I 所示反应体系检测各组细胞MEG3基因相对表达量。[0028]表1 MEG3基因检测20μ?体系中各组分
【权利要求】
1.一种用于表达IncRNA的慢病毒载体，其特征在于，以pLL3.7质粒为骨架，以luc2基因替换质粒EGFP基因，以核苷酸序列为SEQ ID N0.4的合成序列替换mU6启动子序列，所述慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。
2.根据权利要求1所述的用于表达IncRNA的慢病毒载体，其特征在于，所述luc2基因是以SEQ ID N0.1为上游引物，SEQ ID N0.2为下游引物，以pmirGLO质粒为模板扩增获得。
3.如权利要求1所述的用于表达IncRNA的慢病毒载体在IncRNA异位表达中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，所述IncRNA为LncRNAMEG3。
【文档编号】C12N15/867GK103834692SQ201410068610
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】陈云, 林喆, 孙倍成, 唐俊伟, 万昕, 卓晗, 夏阳 申请人:南京医科大学