氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸基因编码荧光探针及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸基因编码荧光探针及其制备方法和应用。一方面，本发明涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的检测探针，具体涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组荧光融合蛋白检测探针。在一个具体方面，本发明涉及氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的重组荧光融合蛋白检测探针。本发明也涉及上述检测探针的制备方法及其分别在检测NAD+中的应用。
【专利说明】氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸基因编码荧光探针及其制备 方法和应用
[0001] 本申请是申请号201110288807.6,申请日为2011年9月26日，名为"烟酰胺腺嘌 呤二核苷酸基因编码荧光探针及其制备方法和应用"的发明专利申请的分案申请。母案的 全部内容在此通过引用全文纳入本文用于所有目的。
【技术领域】
[0002] 本发明涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的检测探针，具体涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 的重组荧光融合蛋白检测探针。在一个具体方面，本发明涉及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸（NADH)的重组荧光融合蛋白检测探针；在另一个具体方面，本发明涉及氧化型烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸（NAD+)的重组荧光融合蛋白检测探针；在又一方面，本发明涉及还原型和氧 化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比率的重组荧光融合蛋白检测探针。本发明也涉及上述检测探 针的制备方法及其分别在检测NADH、NAD+和NADH/NAD+比率中的应用。
【背景技术】
[0003] NAD+及NADH作为辅酶，是呼吸链的重要组成部分，它参与了呼吸链中的电子传递 过程（Rich, P. R?等，Biochem Soc Trans. 2003, V. 31 (6)，pp. 1095-1105)。在呼吸链的氧 化还原反应中，NAD+作为质子的载体，当其接受了其他分子传递过来的一个电子后，由最初 的氧化态转变为还原态，该反应的最终产物为NADH，而NADH可以作为还原剂向其他分子 提供电子（Belenky, P?等，Trends in Biochemical Sciences. 2007, V. 32(1)，pp. 12-19)。 近来的研究表明，NAD(H)不仅参与能量代谢、物质合成以及抗氧化作用，还涉及到体内的 钙稳态、基因表达、免疫作用以及细胞衰老与死亡等等，而NAD(H)在其中均有着至关重要 的作用，因此NAD(H)本身及其代谢所涉及的众多酶类也成为了药物设计的靶标（Sauve，A. A?等，J Pharmacol Exp Ther. 2008, V. 324(3)，pp. 883-893)。
[0004] 但是，大多数活细胞内的NAD⑶的总量大约为KT6M?10_3M，而且NAD+/NADH的 比例也随着细胞内状态不同而不尽相同（Lin, S.J.等，Current Opinion in Cell Biolo gy. 2003, V. 15(2)，pp. 241-246)，因此这给NAD (H)的测定带来了极大的不便。较早的检测 方法主要是利用NADH在340nm紫外光区有特征吸收，由此建立了紫外分光光度法，该方法 存在两个主要的缺陷：1、有效灵敏度受仪器精密度所限，约为KT 7M ;2、在复杂体系中，不能 有效地区分NADH与NADPH。随后，根据NAD+作为辅酶，在电子传递过程中接受电子转变为 NADH的特性，发展出了一系列酶学检测方法。其他如HPLC分析、电化学法、毛细管电泳、荧 光成像等方法也常见诸于各种文献报道中。然而，大部分的方法或者对单个细胞中靶标分 子的灵敏度不足，或者不能进行亚细胞器定位。特别需要指出的是，这些现有方法均存在 一个主要的缺陷，即需要对样品进行裂解、分离、纯化等操作，而NADH本身又极易氧化，在 一系列繁琐的操作中极易将误差引入，导致最终显示的结果与实际存在出入。另外，这些 现有方法不能应用于活体动物或细胞，不能进行实时地检测，这限制了这些方法在临床疾 病诊断及药物前体研究等邻域的应用。目前在活体或细胞上只能采用NADH自发荧光来检 测（Zhang, Q. H?等，Science. 2002, V. 295(5561)，pp. 1895-1897)，而这种传统方法存在以 下严重缺陷：首先，已知细胞对NAD+/NADH和NADP+/NADPH的调控是相对独立的，正常状态 下NAD+/NADH的比例大约在700:1，而NADP+/NADPH的比例在1:200 ;其次，它们的氧化还原 势存在着巨大的区别，这反映出NADH与NADPH分别在能量代谢与合成代谢中扮演截然不同 的角色；第三，NADH与NADPH自发荧光完全不可区分，利用自发荧光进行成像测量获得的结 果是NADH与NADPH之和，鉴于NADH含量很低且大部分以蛋白质结合形式存在，所以NADH 自发荧光数据实质反映的是蛋白质结合的NADPH的浓度（Zhang，Q.H.等，Science. 2002， V. 295 (5561)，pp. 1895-1897);第四，由于NADH激发波长位于紫外区（340nm)且自发荧光较 弱，需要复杂昂贵的仪器如用于临床监测的仪器CritiView，再加上紫外光对组织的穿透力 很弱并会造成细胞损伤，这些光学特性严重制约了自发荧光监测的应用。
[0005] 因此，本领域亟需发展一种特异性NADH检测技术，特别是一种适合生理水平和亚 细胞水平的特异性NADH检测技术。
[0006] 而相对于传统的小分子染料检测技术以及迅速发展的量子点检测技术，荧光蛋白 检测技术在大多数的活体细胞成像方面具有独一无二的压倒性优势，它能够通过遗传导入 至细胞、组织乃至整个器官中，因此荧光蛋白能够作为一个全细胞标记物或基因启动激活 的指示器。
[0007] 绿色突光蛋白最初是从维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria)中提取，野 生型的AvGFP由238个氨基酸构成，分子量约为26kD。当前的研究确认，天然GFP蛋白中第 65?67位的三个氨基酸Ser-Tyr-Gly能够自发形成一个突光生色基团：对-轻基苯亚甲 基咪唑啉酮（p-hydroxybenzylideneimidazolinone)，是其主要的发光位置。野生型AvGFP 的光谱特征十分复杂，其荧光激发的主峰在395nm处，而在475nm处另有一个附峰，后者振 幅强度约为前者的1/3。在标准的溶液条件下，395nm处的激发可产生508nm处的发射， 而475nm处的激发产生的最大发射波长位于503nm(Heim，R?等，Proc Natl Acad Sci U S A. 1994, V. 91(26)，pp.12501-12504)。
[0008] 随着对GFP蛋白突变的研究日渐深入，利用分子生物学技术，目前已经发展出多 种表现突出的GFP衍生物，通过在野生型GFP基础上进行不同的单点突变或者组合，可获得 诸如增强型GFP(S65T，F64L)、YFP(T203Y)、CFP(Y66W)等。而借助对GFP蛋白序列的重新 排列，将原第145-238位氨基酸部分作为新蛋白的N端，原第1-144位氨基酸作为新蛋白的 C端，两片段间通过一小段具有柔性的短肽链连接，形成一个对空间变化敏感的环状排列荧 光蛋白（circular permutation fluorescent protein)，在此基础上对原蛋白 T203Y进行 的点突变就形成了环状排列的黄色荧光蛋白cpYFP(Nagai，T.等，Proc Natl Acad Sci U S A. 2001，V. 98 (6)，pp. 3197-3202)。
[0009] 由于对荧光蛋白研究日益深入，相关的一些基于荧光的分析检测技术也获得了进 一步的发展。例如当前常用的荧光共振能量转移（FRET)技术，该技术主要原理是当两个荧 光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态， 在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生 能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发 态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特 征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭）。当前对绿色荧光蛋白的进一步研究发 现，衍生自绿色荧光蛋白突变体的青色荧光蛋白（CFP)和黄色荧光蛋白（YFP)是一对表现 出色的供体/受体对。CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近 时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基 团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的 能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。因此 现有研究报道利用基因工程重组手段将期望研究的蛋白基因两端分别与CFP与YFP融合表 达出一个全新的融合蛋白，该蛋白与其专一性的靶标分子的结合所产生的空间变化即通过 荧光的变化所直观地显现。
[0010] 因此，本文所用的荧光蛋白序列可以来自于维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria)的荧光蛋白及其衍生物，包括但不局限于这些突变体：黄色荧光蛋白（YFP)、绿 色荧光蛋白（GFP)、青色荧光蛋白（CFP)等的序列，其中优选黄色荧光蛋白YFP的序列，更优 选环状排列的黄色荧光蛋白cpYFP的序列。
[0011] 本技术中所涉及的另一蛋白，YdiH蛋白（又称为Rex蛋白）是一种本领域已知的 细菌转录抑制蛋白，分子量为23 kDa，它能调控发酵和厌氧呼吸。常见的YdiH蛋白来自嗜 热水生菌（Thermus aquaticus)(SEQ ID NO:I NCBI GenBank :AF061257.1)、天蓝色链霉 菌（Streptomyces coelicolor) (SEQ ID NO :2 NCBI GenBank :AL939116. 1)或枯草芽抱杆 菌（Bacillus subtilis)(SEQ ID NO :3 NCBI GenBank :AL009126. 3)，YdiH 蛋白首次获得 鉴定是Brekasis和Paget等人于2003年在天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor)中 发现的，这是一种广泛存在于革兰氏阳性菌中的一种对氧化还原敏感的调控蛋白。对于天 蓝色链霉菌（S. coelicolor) YdiH(Rex)蛋白的研究显示，这是一种典型的含有Rossmann结 构域的NAD(H)结合蛋白。其中关键的Rossmann结构域是一种主要存在于核苷酸结合蛋 白中的蛋白质超二级结构，是典型的辅因子NAD(H)结合结构域，以各类辅因子NAD结合蛋 白为代表。该结构主要由6个0折叠通过2对a螺旋以有序的形式组 成。因为每个Rossmann结构域只能结合一个核苷酸分子，因此类似NAD这类的二核苷酸结 合蛋白的结构域中存在两个成对的Rossmann部分。当前研究显示天蓝色链霉菌YdiH(Rex) 蛋白能够直接感应胞质NADH/NAD+比率的变化，而在有氧环境下，当细胞内NADH/NAD+比率 处于低水平时，YdiH(Rex)蛋白可抑制其祀基因（cydABC、nuoA_D和rexhemAO))的转录， 而NADH/NAD+比率的升高能够使Rex从其操纵子位点解离，在这一动态过程中YdiH(Rex) 蛋白的空间构象会随着环境的变化而发生改变（Brekasis，D.等，EMBO J. 2003, V. 22(18)， pp. 4856-4865)。因此Rex蛋白是一个很好的细胞内NADH检测探针的候选者。同时，最近 Wang等人对枯草芽孢杆菌YdiH(Rex)蛋白进行结晶并对其作用机理和功能进行了部分研 究，结果显示源自枯草芽孢杆菌的YdiH(Rex)蛋白是一个同源二聚体蛋白，由两个功能结 构域构成，其中N端结构域（1-85位残基）是一个DNA结合域，而C端结构域（86-215位 残基）是一个典型的Rossmann折叠，它能够结合NADH(Wang, E.等，Mol Microbiol. 2008， V. 69(2), pp. 466-478) 〇
[0012] 虽然YdiH(Rex)蛋白本身对环境内的氧化还原状态敏感，但是其自身发生的变化 并不能直观的显示出并被外界所捕获，而借助于荧光蛋白这一工具，我们可以很好地通过 将两者进行融合表达，获得一个全新的基因编码的荧光探针，利用YdiH(Rex)蛋白感受环 境内氧化还原状态的变化并将这一变化传递至荧光蛋白，通过荧光蛋白产生荧光与否以及 荧光的强弱，对环境中氧化还原状态改变进行实时且直观地描述。
[0013] 综上所述，我们认为，利用包含YdiH蛋白的重组荧光融合蛋白能够满足在生理水 平和亚细胞水平上检测NADH的迫切需要。
[0014] 不应认为对本文所述参考文献的引用或讨论意味着承认这些参考文献是本发明 的现有技术。
【发明内容】
[0015] 下文以及本申请权利要求中提及具体序列信息时，各"SEQ ID No"后所列编号均 为母案：中国专利申请201110288807. 6中的序列编号。由于内容删减，相关序列在本申请 所提受的序列表中的编号有所调整，具体对应关系如下表。
[0016]
【权利要求】
1. 一种遗传编码的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+荧光探针，其内含有 (1) 对环境内NAD+敏感的多肽，和 (2) 通过光谱性质的改变对环境内NAD+进行表现的部分，该部分是荧光蛋白序列或其 衍生物。
2. 如权利要求1所述的NAD+荧光探针，所述荧光探针的氨基酸序列选自序列表中的序 列 31-40,即中国专利申请 201110288807. 6 中 SEQ ID NO :129 和 141-149 中的一种。
3. -种核酸序列，其核苷酸序列编码权利要求1或2所述的荧光探针。
4. 一种核酸序列，所述核酸序列与权利要求3所述的核酸序列互补。
5. -种表达载体，其包含与表达控制序列操作性连接的如权利要求3所述的核酸序 列。
6. -种宿主细胞，其包含权利要求3所述的核酸序列或权利要求5所述的表达载体。
7. -种制备权利要求1或2所述荧光探针的方法，包括以下步骤： (1) 将权利要求5所述的表达载体转移到宿主细胞中， (2) 在适合所述宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞，和 (3) 由所述宿主细胞分离所述荧光探针或融合蛋白。
8. 权利要求1或2所述的荧光探针或权利要求7所述方法制备的荧光探针在检测氧化 型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的应用。
9. 一种检测试剂盒，其包含权利要求权利要求1或2所述的荧光探针或权利要求7所 述方法制备的荧光探针。
【文档编号】C12N15/62GK104277120SQ201410499267
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2011年9月26日 优先权日:2011年9月26日
【发明者】杨弋, 赵玉政, 呼庆勋 申请人:华东理工大学