具有改善的稳定性的基于纤连蛋白的支架蛋白质的制作方法

专利名称：具有改善的稳定性的基于纤连蛋白的支架蛋白质的制作方法
具有改善的稳定性的基于纤连蛋白的支架蛋白质相关申请本申请要求2010年5月26日提交的美国临时申请61/348，647和2010年5月26日提交的美国临时申请61/348，663的权益，本文通过提述并入其全部内容。介绍基于纤连蛋白的支架(fibronectin-based scaffolds)是一类能够进化从而结合任何感兴趣的化合物的蛋白质。这些蛋白质一般利用衍生自III型纤连蛋白(Fn3)或Fn3样域，以天然的或工程化抗体(即多克隆、单克隆或单链抗体)特征性的方式发挥功能，并且具有结构上的优势。具体地说，这些抗体模拟物的结构已经被设计以实现最优的折叠、稳定性和溶解性，即使在通常会在抗体中导致结构和功能丧失的条件下也是如此。基于纤连蛋白的支架蛋白的一个例子是Adnecins (Adnexus, Bristol-Myers Squibb的全资子公司)。纤连蛋白(fibronectin)是一种在胞外基质的形成以及细胞-细胞相互作用中扮演关键角色的大蛋白；它由三种类型(Ι、Π和III型)的小结构域的多个重复组成(Baronet al.，1991)。Fn3本身是一个大亚家族的范式，该家族包括细胞粘附分子、细胞表面激素和细胞因子受体、分子伴侣、以及糖类结 合域等的部分。综述可见Bork&Doolittle, ProcNatl Acad Sci USA.1992 Octl;89(19):8990-4;Bork et al., J Mol Biol.1994Sep30;242(4):309-20;Campbell&Spitzfaden, Structure.1994Mayl5;2(5):333-7;Harpez&Chothia, J Mol Biol.1994Mayl3;238(4):528-39)。纤连蛋白III型(Fn3)域包括，以从N 而到C 而的顺序:β或β样链Α;环AB; β或β样链B ;环BC ; β或β样链C ;环CD ; β或β样链D ;环DE ; β或β样链E ;环EF ;β或β样链F ;环FG;以及β或β样链G。环AB、BC、CD、DE、EF和FG中的任何和所有可参与结合靶物。BC、DE和FG环都与来自免疫球蛋白的互补决定区(CDR)结构和功能上类似。美国专利7，115，396描述了其中对BC、DE和FG环的改变导致高亲和力的TNFa结合物的Fn3域蛋白。美国申请公开2007/0148126描述了其中对BC、DE和FG环的改变导致高亲和力的VEGFR2结合物的Fn域蛋白。蛋白质药物可能在其生产、纯化、保存和递送中伴随着物理和化学上的不稳定性。这些不稳定性问题可能对蛋白质治疗剂的生物学性质造成不利的影响，从而降低该蛋白质治疗剂的效力。Sola, 2009, J.Pharm Sci，98 (4): 1223-1245。由此，获得稳定性改善(例如断裂和/或聚集减少)的、能够用于治疗和诊断目的的改良的纤连蛋白域支架蛋白是有利的。发明概述本申请的一个方面提供新的基于纤连蛋白的支架蛋白，它们的稳定性增加，包括断裂减少和/或聚集减少。在一些实施方案中，本文中提供的基于纤连蛋白的支架蛋白包含纤连蛋白III型第10(1QFn3)域，其中该1QFn3域包含与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性的氨基酸序列，并且以小于IOOnM的Kd结合靶分子，且其中该kiFM域还包含C端尾，所述C端尾不含有DK序列。在示例性的实施方案中，所述C端尾包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述C端尾还包含半胱氨酸残基。在其他实施方案中，所述C端尾包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。 在特定的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白结合不被野生型kiFM域所结合的靶物。在特定的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白不结合EGFR、人血清白蛋白或PCSK9中的一种或多种。在特定的实施方案中，包含单一 kiFM域的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合EGFR、人血清白蛋白或PCSK9中的一种或多种。在特定的实施方案中，多价的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合一种或多种下列的靶分子组合:i)EGFR和IGF-1R ;ii)EGFR和任何其他革巴蛋白；或iii)人血清白蛋白或及任何其他革巴蛋白。在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白的kiFM域还包含含有1-10个氨基酸的N端延伸。在其他的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白的kiFM域包含选自下组的序列:M、MG、G、以及 SEQ ID NO: 19-21 和 26-31 中的任一者。在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白还包含第二 kiFM域，其中所述第二10Fn3域包含与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性的氨基酸序列，并且以小于IOOnM的Kd结合靶分子，且其中所述第二 wFM域还包含不含有DK序列的C端尾。在示例性的实施方案中，所述第二 uiFr^域包含含有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的C端尾。在一些实施方案中，所述第一和第二 kiFM域结合不同的靶物。在一些实施方案中，所述第二 kiFM域还包含具有1-10个氨基酸的N端延伸。在一些实施方案中，所述N端延伸包含选自下组的序列:M、MG、G、以及SEQ ID NO: 19-21和25-31中的任一者。在一些实施方案中，所述第一和第二10Fn3域通过具有1-30个氨基酸的多肽接头连接。在一些实施方案中，所述多肽接头选自下组:基于甘氨酸-丝氨酸的接头、基于甘氨酸-脯氨酸的接头、基于脯氨酸-丙氨酸的接头、和基于Fn的接头。在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含一个或多个包含环AB ;环此；环⑶；环DE ;环EF ;和环FG的1QFn3域，并且各自独立地在选自环BC、DE和FG中的至少一个环中具有相对于对应 的人10F3域序列发生了改变的氨基酸序列。在某些实施方案中，1QFn3域包含与SEQ ID NO:1所示的天然存在的人kiFM域至少50、60、70、或80%相同的氨基酸序列。在示例性的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白是包含两个kiFM域的二聚体。在另一个方面，本申请提供新的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体，它们与PCT申请TO 2009/142773中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体相比蛋白断裂减少。在一些实施方案中，所述的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体包含SEQ ID N0:48的氨基酸序列。在另一个方面，本申请提供具有结构N1-D1-C1-L-N2-D2-C2的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体。在某些实施方案中，NI和N2是任选的N端延伸，独立地包含0-10个氨基酸；Dl和D2独立地选自下组:(i)与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的纤连蛋白III型第10结构域C°Fn3)域，其中所述1QFn3域以小于500nM的Kd结合IGFU(ii)与SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列具有至少95%的同一性的1QFn3域，其中所述1QFn3域以小于500nM的Kd结合VEGFR2 ;L为包含0_30个氨基酸残基的多肽接头；C1包含SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列；且C2包含SEQ ID NO:4、5或6所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有结构N1-D1-C1-L-N2-D2-C2,其中Dl包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少95%的同一性的wFM域，且D2包含与SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列具有至少95%的同一性的1QFn3域。在其他实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有序列N1-D1-C1-L-N2-D2-C2，其中Dl包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少95%的同一性的1QFn3域，且D2包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少95%的同一性的kiFM域。在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有结构N1-D1-C1-L-N2-D2-C2，其中 C2 包含 SEQ ID NO:6 的氨基酸序列。在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有结构N1-D1-C1-L-N2-D2-C2,其中NI包含选自下组的氨基酸序列:M、MG、G，以及SEQ IDNO: 19-21和26-31中的任一者。在示例性的实施方案中，NI包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有结构N1-D1-C1-L-N2-D2-C2，其中N2包含选自下组的氨基酸序列:M、MG、G，以及SEQ ID NO: 19-21和26-31中的任一者。在示例性的实施方案中，N2包含SEQ ID N0:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有结构N1-D1-C1-L-N2-D2-C2,其中L是选自下组的多肽接头:基于甘氨酸-丝氨酸的接头、基于甘氨酸-脯氨酸的接头、基于脯氨酸-丙氨酸的接头，以及基于Fn的接头。在其他的实施方案中，L包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白还包含一个或多个药动学(PK)模块，所述模块选自:聚氧化烯模块，人血清白蛋白结合蛋白，唾液酸，人血清白蛋白，转铁蛋白，IgG，IgG结合蛋白，以及Fe片段。在一些实施方案中，PK模块是聚氧化烯模块且所述聚氧化烯模块是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，PEG模块通过Cys或Lys氨基酸共价连接于基于纤连蛋白的支架蛋白。在一些实施方案中，PEG为大约0.5kDa至大约IOOkDa之间。在一个方面，本申请提供包含基于纤连蛋白的支架蛋白的可药用的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是基本上不含热原的。在一些实施方案中，所述组合物基本上没有微生物污染，使其适合于体内施用。组合物可以配制用于例如静脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，所述组合物包含生理学上可接受的担载体。在一些实施方案中，所述组合物的pH是4.0-6.5之间。在一些实施方案中，所述组合物的pH是4.0-5.5之间。在其他的实施方案中，所述组合物的pH是5.5。在其他的实施方案中，所述组合物的pH是
4.0。在一些实施方案中,所述组合物中基于纤连蛋白的支架蛋白的浓度是5mg/ml。在另一个方面，本申请提供包含基于纤连蛋白的支架蛋白的药物配制剂，其中所述配制剂包含至少5mg/ml的基于纤连蛋白的支架蛋白，pH为4.0,并且适合静脉内施用。在一些实施方案中，所述药物配制剂在25°C稳定至少4周。在一些实施方案中,所述药物配制剂具有少于4%的断裂。在一些实施方案中，所述配制剂具有少于4%的聚集物。在另一个方面，本申请提供一种用于治疗受试者中的过度增殖病症的方法，包括对有需要的受试者施用治疗有效量的任何本文所述的组合物。

在另一个方面，本申请提供编码如本文所述的基于纤连蛋白的支架蛋白的核酸。还包括含有此类蛋白的多核苷酸的载体。合适的载体包括，例如，表达载体。本申请的另一个方面提供包含编码基于纤连蛋白的支架蛋白的多核苷酸、载体或表达载体的细胞。优选对序列进行优化以最大化在所用的细胞类型中的表达。在一些实施方案中，表达在细菌细胞中进行。在其他的实施方案中，表达在哺乳动物细胞中进行。优选地，表达在大肠杆菌中进行。在一个方面，所述细胞表达基于纤连蛋白的支架蛋白。在一个方面，编码基于纤连蛋白的支架蛋白的多核苷酸经过密码子优化以供在选定的细胞类型中表达。还提供了用于产生如本文所述的基于纤连蛋白的支架蛋白的方法，包括培养包含编码基于纤连蛋白的支架蛋白的多核苷酸、载体或表达载体的宿主细胞，并从培养物回收所表达的基于纤连蛋白的支架蛋白。附图简要说明

图1.显示两种浓度的PEG化V/I (DK+) (SEQ ID NO: 22)的经时的蛋白聚集量的大小排阻高压液相色谱(SE-HPLC)数据。PEG化蛋白以3mg/mL蛋白浓度保存在4°C，IOmM琥珀酸，5%山梨醇、ρΗ5.5中12个月。图2.显示两种浓度的PEG化V/I (DK+) (SEQ ID NO: 22)的经时的蛋白断裂的SE-HPLC数据。PEG化蛋白以3mg/mL蛋白浓度保存在4°C，IOmM琥珀酸，5%山梨醇、pH5.5中12个月。图3.显示pH对PEG化V/I (DK+) (SEQ ID NO: 22)的经时蛋白聚集的影响的SE-HPLC数据。PEG化蛋白在含有50mM NaCl、20mM乙酸钠(对于pH4和5)或20mM磷酸钠(对于PH6和7)的制剂中在25°C保存3周。图4.显示pH对PEG化V/I (DK+) (SEQ ID NO: 22)的经时蛋白断裂的影响的SE-HPLC数据。PEG化蛋白在含有50mM NaCl、20mM乙酸钠(对于pH4和5)或20mM磷酸钠(对于PH6和7)的制剂中在25°C保存3周。

图5.显示 PEG 化的 V/I (DK+)分子(SEQ ID NO: 22)在 IOmM 乙酸钠、150mM NaCl、pH5.5中25°C保存4周之后的切割位点的反相高压液相色谱(RP-HPLC)谱。如图中所示，蛋白质切割在位置D95，D106, D180和D200的紧邻后方发生，且切割主要在紧邻D95和D200位置之后发生。PEG化蛋白质以5mg/mL蛋白质的浓度在IOmM乙酸钠、150mM氯化钠、pH5.5中25°C保存4周。图6.显示pH对PEG化E/I (DK+) (SEQ ID NO: 23)的经时蛋白聚集的影响的SE-HPLC数据。PEG化蛋白在IOmM琥珀酸、5%山梨醇、pH4.0,4.5和5.5中于25°C保存4周。图7.显示pH对PEG化E/I (DK+) (SEQ ID NO: 23)的经时蛋白断裂的量的影响的SE-HPLC数据。PEG化蛋白在IOmM琥珀酸、5%山梨醇、pH4.0,4.5和5.5中于25°C保存4周。图8.显示 PEG 化的 E/I (DK+) (SEQ ID NO: 23)在 IOmM 琥珀酸、5% 山梨醇、pH4.0中，5mg/mL蛋白浓度25°C保存4周之后的切割位点的RP-HPLC谱。如图中所示，蛋白质切割在紧邻位置D95、D199和D218之后发生。图9.显示pH对多种基于纤连蛋白的支架蛋白构建体的经时蛋白聚集的影响的SE-HPLC数据。在25°C保存4周的期间内，测试多种基于纤连蛋白的支架蛋白在pH5.5或pH4.0 的聚集的水平。E/1 (DK+)为 SEQ ID NO: 23 ；E/I (DK-,无 C 端)为 SEQ ID NO: 24 ；E/I (2DK)为 SEQ ID NO: 25 ;且￥/1(01(+)为 SEQ ID NO: 22。图10.显示多种基于纤连蛋白的支架蛋白在不同的pH下25°C保存4周期间内的断裂的量的RP-HPLC数据。含有DK序列的基于纤连蛋白的支架蛋白在pH4.0比在pH5.5更易于断裂。不含有基于纤连蛋白的支架蛋白与含有DK序列的基于纤连蛋白的支架蛋白相比在PH4.0对断裂更有抗性。E/1 (DK+)是SEQ ID NO: 23 ；E/I (DK-,无C端)为SEQ IDNO:24 ；E/I (2DK)为 SEQ ID NO:25 ;且 V/I (DK+)为 SEQ ID N0:22。图ll.LC-MS数据，显示E/I(DK-，无C端)分子(SEQ ID NO: 24)中的主要切割位点为D199，而E/I(DK+)分子(SEQ ID NO: 23)中的主要切割位点为D218。图12.LC-MS数据，显示E/I(2DK-)分子(SEQ ID NO:25)中的主要切割位点为D199.
图13.在 25°C保存长达两个月的 VI (DK+) (SEQ ID NO:56)和 VI (DK_) (SEQ IDNO:57)中观察到的聚集速率，通过SE-HPLC分析评估。图14.在 25°C保存长达两个月的 VI (DK+) (SEQ ID NO:56)和 VI (DK-) (SEQ IDN0:57)中观察到的剪切速率(clip rate),通过RP-HPLC分析评估。
15.VI (DK+) (SEQ ID NO: 56)和 VI (DK-) (SEQ ID NO: 57)在 25°C温育 2 个月后的RP-HPLC重叠色谱图的剪切区(clip region)。VI (DK+)的总%剪切为16%，而VI (DK-)则为6.9%ο详细描述

定义“多肽”意指任何两个或更多个氨基酸的序列，无论其长度、翻译后修饰或功能。在本文中，”多肽”、”肽”与”蛋白质”可互换使用。多肽可包括天然氨基酸及非天然氨基酸，例如阐述于美国专利第6，559，126号中者，该专利以引用方式并入本文中。多肽亦可以多种标准化学方式中的任一者来修饰(例如，氨基酸可用保护基团修饰；羧基末端氨基酸可变成末端酰胺基；氨基末端残基可用基团修饰以例如增强亲脂性；或多肽可经化学糖基化或以其他方式修饰以增加稳定性或体内半衰期)。多肽的修饰可包括另一结构(例如环状化合物或其他分子)与多肽的附接，亦可包括含有一或多个构型改变(即，R或S ;或L或D)的氨基酸的多肽。本文中的”氨基酸序列百分比同一性(%) ”定义为:在比对各序列及(若需要)引入缺口以达成最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分的条件下，候选序列中与所选序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以通过本领域现有技术之内的多种方式来达成，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较序列全长范围内达到最大比对所需要的任何算法。不过，为本文中的目的，％氨基酸序列同一性值是如下所述通过使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech, Inc编写,该程序及其用户文档已经提交美国版权局(美国华盛顿,WashingtonD.C.，20559)，以美国版权注册号TXU510087注册；公众可通过Genentech, Inc.，SouthSan Francisco, Calif获得该软件。ALIGN-2程序需要编译以供在UNIX操作系统，优选UNIXV4.0D上使用。所有序列比对参数均由ALIGN-2程序确定，且不改变。就本文而言,给定氨基酸序列A对(to)、与(with)或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列A具有或包含对、与、或针对给定氨基酸序列B的某一 ％氨基酸序列同一性)如下计算:100乘以分数X/Y，其中X是序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数目，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当理解的是，若氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，则A对B的％氨基酸序列同一性会不等于B对A的％氨基酸序列同一性。术语“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；减小肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减缓，优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减缓，优选阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与病症有关的症状。以药物可阻止生长和/或杀死现有癌细胞为限，药物可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，可通过例如评估疾病进展前时间(time to disease progression(TTP))和/或测定响应率(response rates (RR))来测量体内功效。氨基酸序列或化合物的半衰期可一般性地定义为多肽的血清浓度在体内降低50%(例如由于序列或化合物的降解和/或天然机制对序列或化合物的清除或隔离)所花费的时间。半衰期可以以本身已知的任何方式来测定，例如通过药动学分析。合适的技术对于本领域技术人员会是清楚的，而且例如一般包括下述步骤:对灵长类动物适当施用合适剂量的要处理的氨基酸序列或化合物；以规则时间间隔自所述灵长类动物收集血液样品或其它样品；测定本发明的氨基酸序列或化合物在所述血液样品中的水平或浓度；并从如此获得的数据(图)计算到本发明的氨基酸序列或化合物的水平或浓度与给药后的初始水平相比降低50%为止的时间。参考例如标准手册,诸如Kenneth, A等人:Chemical Stability ofPharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists and 以及 Peters 等人:Pharmacokineteanalysis: A Practical Approach (1996)。还可参考"Pharmacokinetics " , M Gibaldi&DPerron, Marcel Dekker 出版，第 2 修订版(1982)。半衰期可使用诸如t1/2_a αι/2-β、及曲线下面积(AUC)等参数来表示。在本说明书中，“半衰期的增加”系指这些参数中的任一个中的增加，例如这些参数中的任两个、或实质上全部这三种参数的增加。“半衰期的增加”尤其指t1/2_i3的增加，同时有或无t1/2_a及/或AUC或二者的增加。概述本申请描述改良的稳定性增加的基于纤连蛋白的支架蛋白。本申请中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白包含一个或多个经过修饰而结合一种或多种期望靶物的人纤连蛋白III型第10结构域。本申请还描述了改良的稳定性增加的VEGFR2/IGF-1R双特异性基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体，其包含两个人纤连蛋白III型第10结构域，其中一个已经过修饰而特异性结合VEGFR2，另一个已经过修饰而特异性结合IGF-1R。PCT申请W02009/142773描述了可以共价或非共价连接、并可结合VEGFR2和IGF-1R二者的纤连蛋白支架多聚体。本申请部分地涉及这样一个出人意料的发现，即结合VEGFR2和IGF-1R的双特异性基于纤连蛋白的支架蛋白在特定的天冬氨酸残基处经受高频率的断裂(fragmentation)。具体地，发现后面紧随有赖氨酸残基的天冬氨酸残基与后随有其他氨基酸的天冬氨酸残基相比，对基于纤连蛋白的支架蛋白中的切割更为敏`感。本申请还涉及这样的出人意料的发现，即VEGFR2/IGF-1R结合性的基于纤连蛋白的支架蛋白的断裂程度较之近缘的基于纤连蛋白的支架蛋白，即双特异性EGFR/IGF-1R结合性基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体为高，即使这两种类似的蛋白的保存条件相同，且享有的序列同一性百分比高。本申请还演示，对于一种模型式的基于纤连蛋白的支架蛋白，如果去除DK序列，或者对其加以修饰以将天冬氨酸残基替换为不同的氨基酸，例如谷氨酸，可以显著降低其断裂。本申请还提供基于纤连蛋白的支架蛋白的改进的组合物，其在保藏期间具有增加的稳定性。基于纤连蛋白的支架Fn3是指来自纤连蛋白的III型结构域。Fn3域是小型、单体、可溶、并且稳定的。它缺乏二硫键，因此在还原条件下稳定。Fn3的总体结构与免疫球蛋白折叠相似。Fn3域以自N端到C端的顺序包括:β或β样链A ;环AB ; β或β样链B ;环BC ; β或β样链C ;环CD ; β或β样链D ;环DE ; β或β样链E ;环EF ; β或β样链F ;环FG ;以及β或β样链G。七条反向平行的β链排列成两个β片层，这两个片层形成稳定的核心，同时形成两个由连接各β或β样链的环构成的“面”。环ΑΒ、⑶和EF位于一个面上，而环BC、DE与FG位于相对的面上。AB、BC、⑶、DE、EF和FG环中的任一个或全部都可参与配体结合。至少有15种不同的Fn3模组，虽然模块之间的序列同源性低，但它们之间三级结构具有高度的相似性。Adnectin (Adnexus, Bristol-Myers Squibb 的一家公司)，是一种基于纤连蛋白III型第10结构域，即Fn3的第10个模组，C°Fn3)的配体结合性支架蛋白。天然存在的人10Fn3 的氨基酸序列如 SEQ ID NO:37 所示-.VSDVPRDL EVVAATPTSLLI SWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTV P GSKST ATISGLKPGVDYTITVYAV TGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO: 37) (AB、CD和EF环加有下划线，BC、FG和DE环加粗突出显示)。在SEQ ID NO: 37中，AB环对应于残基15-16，BC环对应于残基21-30，CD环对应于残基39-45，DE环对应于残基 51-56，EF环对应于残基60-66，且FG环对应于残基76-87。参见例如Xu et al.，Chemistry&Biology20029:933-942。BC，DE和FG环沿着该分子的一个面排列，而AB、⑶和EF沿着该分子的相对面排列。在SEQ ID N0:37中，β链A对应于残基9-14、β链B对应于残基17-20、β链C对应于残基31-38、β链D对应于残基46-50、β链E对应于残基57-59、β链F对应于残基67-75、且β链G对应于残基88-94。所述各链通过相应的环相互连接，例如，链A和链B通过环AB以下述顺序连接:链Α、环ΑΒ、链B，等等。SEQ ID Ν0:37的最先8个氨基酸(上文斜体表示的)可以缺失而仍然保持分子的结合活性。在SEQ ID NO:37中涉及疏水核心的形成的残基(“核心氨基酸残基”)包括对应于 SEQ ID NO: 37 的下列氨基酸的氨基酸:L8、V10、Α13、L18、I20、W22、Y32、I34、Y36、F48、V50、A57、I59、L62、Y68、I70、V72、A74、I88、I90和Y92，其中所述核心氨基酸残基由单字母氨基酸编码后随其在SEQ ID NO: 37中的位置来表示。参见例如Dickinson et al.，J.Mol.Biol.236:1079-1092(1994)。10Fn3域在结构上和功能上与抗体类似，具体地说与抗体的可变区类似。虽然wFnS域可以描述为“抗体模拟物”或“抗体样蛋白质”，但它们确实可以提供若干胜过常规抗体的优势。具体地，它们相比于抗体展现更好的折叠性能和热稳定性，而且它们缺少二硫键:已知二硫键在特定条件下可阻碍或阻止正确折叠。kiFM域的BC、DE、和FG环与来自免疫球蛋白的互补决定区(OTR)类似。这些环区中的氨基酸序列变化改变kiFM的结合特异性。也可以制作在AB、CD和EF环中有修饰的kiFM域以产生结合期望的靶物的分子。CDR样环外部的蛋白质序列与来自免疫球蛋白的框架区类似，而且在kiFM的结构构象中发挥作用。以结构构象的改变不破坏配体结合为限，kiFM的框架样区的变化是容许的。用于生成kiFM配体特异性结合物的方法已经记载于 PCT
发明者R.坎波森, J.奥洛林, B.扬, 张一红 申请人:百时美施贵宝公司