蛋白质在水溶液中的稳定性的制作方法

专利名称：蛋白质在水溶液中的稳定性的制作方法
技术领域：
本发明与蛋白质在水溶液中的稳定性有关。
背景技术：
在単一小瓶内混合悬浮抗原的做法很具吸引力[1，2，3]，但由于不同成分混合后产生相互作用而导致问题，液体制剂尤其如此[4]。出现的问题包括抗原干扰、抗原竞争、抗原降解、抗原决定部位抑制和辅剂兼容性。混合剂的质量控制也比较困难。
不过，混合抗原并不一定有害。例如在产生免疫制剂中混合白喉、破伤风和百日咳(英文简称DTP)的抗原(使用整细胞(Pw)或无细胞(Pa)百日咳抗原)的做法已行之多年，实际上，在DTP进ー步加入结合B型流感嗜血杆菌(H. influenzae) (Hib)囊状多糖能加强对Hib成分产生的抗体反应。[5]。混合抗原来预防麻疹、流行性腮腺炎和风疹(英文简称MMR)也是常见的。不过，产生免疫的药品，例如DTP、Hib，灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)B型肝炎病毒(HBV)等都有效能测验问题的报告[6]。曾有报告指出关于选择混合A型和B型肝炎病毒抗原[7]和Hib混合剂[8，9]的免疫助剂问题。例如，氢氧化铝是DTP抗原常用的免疫助齐U，但Hib囊状多糖抗原在液体制剂中会被此盐水解[6，10]。已知ー种五价Hib+DTPw+HBV液体免疫配方的HBV成分的免疫反应由于混合制造而降低[11，12]，导致这一情况的可能原因是Hib和DTP成分协同抑制抗-HBV反应。反之，未有报告指出ー种混合Hib+DTPa+polio+HBV的六价液体制剂配方的免疫性受不良的影响。这种六价产品HEXAVACTM在欧洲已获核准在人体使用。本发明的目标是改善(例如稳定性)液体混合疫苗和制造。尤其是改进包括HBV抗原在内的混合产品。

发明内容
本发明提供制造抗原混合物的エ序，步骤如下(a)在酸性环境下使用磷化铝液混合B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) ； (b)以任何顺序加入白喉抗原、破伤风抗原和百日咳抗原至液体内；并(c)加入Hib-结合抗原至液体内。当吸附至磷化铝免疫助剂时，HBsAg的免疫性最佳，但当吸附至氢氧化铝或磷化铝吋，Hib结合物会水解。本发明的エ序的优点是制造ー种HBsAg被吸附至磷化铝，而Hib-结合物却不为磷化铝所吸附的液体制剂。本エ序提供高HBsAg吸附能力和整体稳定性。此外，本发明更提供ー种包含磷化铝、HbsAg、白喉抗原、破伤风抗原、百日咳抗原和Hib-结合抗原，其中HBsAg被吸附至磷化铝免疫助剂而Hib-结合抗原却不为铝免疫助剂所吸附。
混合抗原的顺序エ序步骤(a)至(C)应以特定的顺序进行，即HBsAg比DTP抗原先加入磷化铝液内，Hib-结合物则在加入DTP抗原后才加入。在步骤(b)，比较好的顺序是先加白喉抗原，然后加破伤风和百日咳抗原，但不一定要这样做。这样可支持白喉抗原吸附至铝免疫助剂。破伤风和百日咳抗原可在步骤(b)内以任何顺序加入。加入每ー种抗原后，最好混合(例如搅拌)液体至少10分钟(例如约30分钟)。pH和温度
本发明エ序的步骤(a)中，磷化铝和HBsAg是在液状中混合。这ー步骤使HBsAg吸附至磷化铝免疫助剂。混合时，如果pH过低，HBsAg会变性。如果pH太高，HBsAg将不会吸附至磷化铝。加入每ー种抗原后，エ序可能涉及调整pH的步骤。在步骤(a)加入HBsAg后，如必要，可调整pH至原来或与原来相似的pH。在步骤(b)加入个别的DTP后，可调整pH。步骤(b)后，并在步骤(c)加入Hib-结合抗原前，最好先调整pH大约至中性。在步骤(C)加入Hib-结合抗原后,最好调整pH以便更适合病人使用。pH最好在
7.O以下以预防白喉类毒素转化成有毒状态。因此，pH最好保持在6. 2和6. 9之间。本发明的エ序最好在15°C和30°C之间进行(例如在19°C和27°C，或在23±4°C )。磷化铝本发明的エ序基础是在液状混合抗原和磷化铝。一般都称这样的液状磷化铝为“溶液”，但从严格的物理化学角度来说，此盐在水中不溶化，并形成悬浮液。磷化铝最好使用液状，以便加入HbsAg，井随后加入其它抗原。加入抗原混合物前，最好先稀释磷化铝至要求的浓度，确保有一个均匀的溶液。加入HBsAg前Al3+的浓度通常在O和10mg/ml之间磷化铝液体可以含缓冲剂，但并非必要。磷化铝液最好经过消毒。磷化铝不能采用过滤消毒，最好采用高压消毒法。磷化铝液最好是无发热质。磷化铝液也可含氯化钠。B型肝炎病毒表面抗原HBsAg的制剂已有充分的文书说明。多种形式的抗原已有说明(例如包括全部或部分pre-S序列 ，参考14的L*抗原 ，参考15所述的preSl-preS2_S缩多氨酸或參考16所述的类似物；參考17和18所述的‘逃跑突变体’，例如含Gly145 — Arg突变的HBsAg)。上述任何ー种都可以在本发明使用。HBsAg可从血清或像酵母菌CHO细胞的真核压榨系统中压出[19]。最好是从酵母圃出οHBsAg通常是微粒状。最好从酵母菌榨出时就已成微粒状。HBsAg可以灭活,例如使用甲醒溶液处理。白喉抗原白喉抗原最好是白喉类毒素。白喉类毒素的制剂已有充分的文书说明[例如參考20的第3章 '参考21的第9章]。可使用任何适合的白喉类毒素。
破伤风抗原破伤风抗原最好是破伤风类毒素。破伤风类毒素的制剂已有充分的文书说明[例如參考20的第4章 '参考20的第18章]。可使用任何适合的破伤风类毒素。百日咳抗原本发明使用的百日咳抗原可以是细胞(例如整个细胞)或非细胞抗原。两种抗原的制剂都有充分的文书说明[例如见參考201的第14章；也见參考22]。使用无细胞抗原时最好使用百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，最好与附属肌动蛋白(又称为PRN或69kDa抗原)混合，并可选择性加入凝集原(又称菌毛)2和
3[23]。每ー疫苗剂量所含百日咳抗原的一般水平为=IOyg ΡΤ、5 μ g FHAJyg PRN、5yg混合菌毛。PT是ー种有毒的蛋白质，当在百日咳抗原中存在时，最好加以解毒。解毒的方法可使用化学和/或基因法。最好的解毒突变体是9K/129G双突变体[24]，以下简称‘rPT’。Hib-结合抗原一般的多糖结合物，尤其是B型流感嗜血杆菌(Hib)的制剂已有充分的文书说明[例如參考25to 33等]。本发明可使用任何适合的Hib结合物。结合物的糖部分可以是多糖(例如全长PRP)，但最好使用水解多糖(例如使用酸水解)形成低聚糖(例如从 I至 5kDa的MW)。如果进行水解，水解物可根据大小分类，以便排除低聚糖，这种糖太短，不能产生免疫功能。按大小分开的低聚糖是最好的糖类抗原。结合物的载体部分通常是ー种蛋白质。最好的载体蛋白质是细菌毒素或类毒素，例如白喉或破伤风类毒素。这些都是常用的结合疫苗。尤其最常用的是CRM197白喉类毒素[34,35,36]。其它适合的载体蛋白质包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白质[37]、合成缩氨酸[38，39]、热震蛋白质[40，41]、百日咳蛋白质[42，43]、流感嗜血杆菌的D蛋白质[44]、细胞活素[45]、淋巴因子[45]、荷尔蒙[45]、生长激素[45]、艰难梭状芽胞杆菌毒素A或B[46]等。也可以使用混合载体蛋白质。可使用任何适当的激活化学和/或连接化学結合Hib糖。通常，在结合前，糖会先被激活或功能化。激活程序可能涉及，例如cyanylating试剂，如CDAP(例如l-cyano-4-aimethylamino pyridinium tetraf Iuoroborate [47,48]).其广匕适当的技术使用碳化ニ亚胺、hydrazides、激活酯、降冰片烷、P-硝基苯甲酸、N-羟基丁ニ醢亚胺、S-NHS、EDC、TSTU ;也请见參考49的简介)。连接可通过使用任何已知的程序制造的连接组，例如參考50和51所述的程序。一种连接法涉及多糖的还原胺化，偶合所得氨基组与己ニ酸连接组的一端，然后偶合一个蛋白质至己ニ酸连接组的另一端[52，53，54]。其它的连接物包括B-丙醢胺基[55]、こ胺硝基苯酯[56]、卤代醢卤[57]、配糖键[58]、6_氨基己酸[59]、ADH[60]、C4至C12部分[61]等。除了使用连接物以外，可使用直接连接。直接连接至蛋白质的步骤可能包括氧化多糖，然后与蛋白质还原胺化，如參考62和63所述。最好的结合法是通过己ニ酸琥珀双酯共价连接Hib糖至CRM197 [64，65]。本发明配方的特征本发明的エ序的配方包含抗原，其中一些吸附在磷化铝免疫助剂。这些配方最好、是产生免疫的配方。本发明的配方有预防性(即预防感染)或治疗性(即能治疗所感染后的疾病)功能。配方最好是液体制剂(即非冻干配方)。这通常表示配方为液状，例如悬浮液。本发明的成分最好经过杀菌消毒。磷化铝和完整细胞的百日咳抗原都不能使用过滤消毒，因此，本发明的成分最好使用高压消毒法和/或在制造时使用经过消毒的成分。本发明的成分最好无发热质。本发明的成分的pH是6. O和7. O之间。成分最好缓冲至这一 pH。本发明成分的Al3+浓度通常在O. I和2. Omg/ml之间。成分可含氯化钠。配方内的氯化钠含量最好在O. I至100mg/ml之间。
HBsAg的含量通常是5和50 μ g/ml之间。最理想的含量是10和30mg/ml之间。白喉类毒素的含量通常是5和50Lf/ml之间。最理想的含量是7. 5和30Lf/ml之间。破伤风类毒素的含量通常是I和20Lf/ml之间。最理想的含量是2和9Lf/ml之间。细胞百日咳抗原的百日咳抗原通常是5和500U/ml之间。最理想的含量是10和400U/ml 之间。Hib-结合抗原的含量通常是I和50 μ g/ml之间。最理想的含量是10和30mg/ml 之间。配方内可能含防腐药，例如硫柳汞。防腐药最好是低含量(例如容积的O. 01% )。这可从外源加入，或是混合进配方内的主体抗原(例如在百日咳或HbsAg抗原内存在的防腐药)。不过，最好避免使用含水银的防腐药。其它适合人体使用的成分在參考66内说明。本发明的成分最好是尽量不含氢氧化铝。本发明配方内含的抗原达‘有效地产生免疫的分量’，即该分量在人体使用吋，无论是单一剂量或系列剂量的一部分，都能有效地治疗或预防疾病。这ー分量视接受治疗者的健康和身体状况、年龄、接受治疗者的分类(例如非人类灵长、灵长等)、受治疗者免疫系统合成抗体的能力、所希望得到的保护程度、配方的程序、医生对病况的诊断和其它相关因素有所改动。预期分量范围广泛，并由常规试验确定。治疗剂量可使用单ー剂量或多剂量(例如包括加强剂量)。本配方可与其它免疫调节剂并用。通常，本发明的配方为注射制剂。本配方通常不经肠胃，直接注射体内(例如注射至皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织的间隙)。此外，本配方也可以在损伤的部位使用。一旦制成，本发明的配方可直接给受治疗者使用。受治疗者可以是动物；尤其是人类受治疗者。疫苗尤其适合为儿童和青少年进行免疫注射。已知标准动物和试管模型和评估HBV、Hib和DTP产品的效カ的相关保护。抗原吸附在本发明的配方中，HBsAg吸附至磷化铝。吸附的步骤最好是大部分完成，例如配方内的总HbsAg重量至少有80 %已吸附(例如至少85 %、90 %、95 %、98 %、99 %或更多)。白喉类毒素通常吸附至磷化铝。吸附的步骤最好是部分完成，例如配方内的总白喉类毒素重量约有30-80%已吸附(例如约40%-70%、约50%-60%等)。如果储存在约37°C，白喉类毒素的吸附会随时间增加。破伤风类毒素通常吸附至磷化铝。吸附的步骤最好是部分完成，例如配方内的总破伤风类毒素重量40%以下已吸附(例如30%以下、20%以下、10%以下等)。破伤风类毒素的吸附水平可能约为0%。Hib-结合物不吸附至铝免疫助剂。治疗法使用本发明的配方可提高患者的免疫反应。 本发明提供的配方可作药剂使用(例如作为ー种产生免疫的配方)。此外，本发明也提供配方制造药剂来治疗和/或预防疾病。这些方法或用法可保护免受HBV、白喉杆菌、破伤风杆菌、百日咳杆菌和/或b型流感嗜血杆菌的感染。这些病菌可导致肝炎、白喉、破伤风、百日咳和/或细菌脑膜炎。此方法或用法能更好地提供保护不感染这些疾病。流感嗜血杆菌引起的其它疾病包括中耳炎、支气管炎、肺炎、蜂窝织炎和心包炎。患者最好是人类。患者最好是儿童。此方法在已接受疫苗的患者中可提高加强反应。配方的单位剂量通常是O. 5ml。此外，本发明也提供ー个含有本发明配方的输送设备(例如ー个针筒，或免针注射器)。设备最好是含有单ー剂量。配方的进ー步成分本发明的成分最好是五价成分(I)HBsAg ； (2) Hib ； (3)白喉；(4)破伤风；(5)百日咳。不过,本发明并不排除加入其它抗原的可能性(例如产生六价、七价、八价、九价、十价或以上的配方)。例如，配方可包含下列一或多种抗原-脑膜炎奈瑟球菌血清群B的蛋白抗原，例如參考67至73，-脑膜炎奈瑟球菌血清群B的外膜泡(OMV)制剂，例如參考74，75，76，77等所述。-脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，如參考78所述，来自血清群C的低聚糖[也见參考79]或參考80的低聚糖。-来自肺炎链球菌的糖抗原[例如81，82，83]。-来自A型肝炎病毒的抗原，例如灭活病毒[例如84，85]。-脊髓灰质炎抗原[例如86，87]例如OPV或最好是IPV。配方可能包含以上一或多种抗原。定义“包含”的意思是“包括”和“组成”例如ー个“包含” X的配方可単独由X组成或可包括一些其它成分例如X+Y。“约”与数值X的关系表示，例如x±10%。绘图简介图I显示本发明配方HBsAg稳定性的惠斯顿印迹法結果。图2显示本发明配方白喉类毒素的免疫扩散結果。图3显示本发明配方破伤风类毒素的免疫扩散結果。
图4显示本发明配方pH随时间的变化。实行发明的模式液体制剂基本制剂法(I)加入酵母压榨的HBsAg至磷化铝液；(2)加入D然后T然后P抗原；⑶调整PH和(4)加入Hib-CRM197结合物。以下是进ー步详情-先用磷化铝免疫助剂-加入HBsAg 液(pH 7. O 在 PBS)至最后浓度 20 μ g/ml-调整pH-搅拌30±5分钟(让HBsAg吸附至免疫助剂)-加入白喉类毒素至最后浓度15Lf/ml-搅拌30分钟-加入破伤风类毒素至最后浓度6.5Lf/ml-搅拌30分钟-加入细胞百日咳抗原至最后浓度300U/ml-搅拌30分钟-如必要，调整pH-加入CRM197_Hib结合物至最后浓度20μ g/ml-搅拌15分钟配方的最后抗原成分主要如下
权利要求
1.一种制造抗原配方悬浮液的方法，该方法包括 (a)在酸性环境下使用磷化铝液混合B型肝炎病毒表面抗原HBsAg； (b)以任何顺序加入白喉抗原、破伤风抗原和百日咳抗原至液体内；并 (c)加入Hib-结合抗原至液体内。
2.如权利要求I所述的方法，其中白喉抗原比破伤风和百日咳抗原先加入。
3.如权利要求I或2所述的方法，其中加入了每ー种抗原后都调整pH。
4.如权利要求1-3任一所述的方法，其中在步骤(c)后pH调整至6.O至7. O之间。
5.如权利要求1-4任一所述的方法，其中该方法在15°C和30°C之间进行。
6.—种配方，其特征在于，它用权利要求1-5任一所述的方法制得。
7.ー种液状配方，它包含下列成分磷化铝、B型肝炎病毒表面抗原HBsAg、白喉抗原、破伤风抗原、百日咳抗原和Hib-结合抗原,其中B型肝炎病毒表面抗原HBsAg被吸附至磷化铝而Hib-结合抗原却不为磷化铝所吸附。
8.如权利要求6或7所述的配方，其特征在于，它是一种产生免疫的配方。
9.一种提高患者免疫反应的方法，该方法包括给予病人权利要求6-8任一所述的配方。
10.ー种药物，其特征在于，它含有权利要求6-8任一所述的配方。
11.权利要求6-8任一所述的配方在制备用于治疗和/或预防B型肝炎、白喉杆菌、破伤风杆菌、百日咳杆菌和/或b型流感嗜血杆菌的药物中的用途。
12.—种输注装置,其特征在于,它含有权利要求6-8任一所述的配方。
全文摘要
本发明涉及蛋白质在水溶液中的稳定性。本发明提供了一种制造抗原组合物悬浮液的方法，该方法包括(a)在酸性环境下使用磷酸铝液混合B型肝炎病毒表面抗原HBsAg；(b)以任何顺序加入白喉抗原、破伤风抗原和百日咳抗原至液体内；并(c)加入Hib-结合抗原至液体内。本发明还提供了用该方法制得的组合物及其应用。
文档编号A61P31/12GK102716477SQ20121015719
公开日2012年10月10日 申请日期2003年10月8日 优先权日2002年10月8日
发明者M·肯托尼 申请人:诺华疫苗和诊断有限责任公司