专利名称：吡咯类在生物活性蛋白溶液中作为杀病毒剂的用途的制作方法
总体上说，本发明涉及将生物学活性蛋白质溶液中病毒灭活的方法，具体地讲，涉及使用唑类灭活生物学活性治疗用蛋白质水溶液中病毒。
长期以来已经认识到消灭治疗用产品中病毒感染的重要性。这一点对于来源于人血液或者更进一步说来源于用于制备生物技术产品(例如重组DNA产物和单克隆抗体)的细胞系的生物学活性产品显得尤其正确。
就用于生物学活性蛋白的杀病毒剂而言，重要的目的是确保完满的杀病毒作用而不有害地影响到蛋白质的生物学活性。这些目的要求我们考虑如蛋白质本身，其活性和/或活性位点的特点，杀病毒剂，使用后除去该杀病毒剂的重要性和/或容易程度，以及(灭活)处理本身的可变性如时间，温度和浓度此类可变数。
单独用热处理的办法可用于某些蛋白质的杀病毒处理(例如，在60℃进行的巴斯德灭菌)。但是，在许多情况下仅使用加热处理要避免生物学活性或效用的损失是有困难的。
为了避免仅使用加热处理而产生的某些缺点或活性损失，已经使用或计划用各种各样的化学试剂作为生物学活性蛋白的杀病毒剂。参见例如，M.Dobkin和M.Shearer的美国专利NO.5,071,650，该专利公开了在特定条件下使用酒精。
用于制备病毒疫苗的和更进一步，用于将来源于人血浆中的生物产品制剂中内源病素灭活的非爆发性有机溶剂/去污剂混合物的效用已受到了使用条件(例如PH)的限制。一种用于中性PH值的生物学活性蛋白的杀病毒剂化合物是磷酸三正丁酯(TNBP)。参见例如A.Neurath和B.Horowitz的美国专利NO.4,540,573，该专利公开了使用TNBP灭活脂类包被病毒。还可参见G.Tsay的美国专利N0.5,110,910，该专利公开了在受控的PH，导电性和蛋白质浓度条件下使用TNBP作为杀病毒剂。不幸的是，现行的杀病毒剂通常主要灭活脂类包被的病毒，并且还没有证明这些杀病毒剂对失去脂类包被的更难对付的一类病毒有效。
已将各种各样的吡咯化合物用作为杀真菌剂(例如，参见Hector等人的美国专利NO.5,006,513)，但我们并不知道任何将它们用作为生物学活性蛋白溶液的，尤其是抗不含脂类病毒的杀病毒剂的建议。现在我们已经发现唑类具有一种将水溶液中的包被和非包被病毒灭活，而且保留了蛋白质如免疫球蛋白的生物学活性的特殊能力。下文中详细描述我们的方法。
本发明所述的是将具生物学活性，治疗用蛋白质水溶液中的包被和非包被病毒灭活的方法包括在足以确保从本质上减少两类病毒(每一种病毒降低2或更多log值的病毒效价)而不有害地影响蛋白质的生物学活性(即活性恢复率大于50％以上)的条件下，将该溶液与吡咯接触。在去污剂存在下可加强杀病毒活性。担负灭活作用的主要功能基团是五聚吡咯环，通过改变环结构或将其他功能基团连接到该环上可以调节灭活作用。优选的唑类是咪唑，优选的是使用一种下文中描述的去污剂。
实施例如下文中阐述的，已经证实唑类对包被和非包被病毒都具有杀病毒活性。如本文中使用的，术语吡咯或吡咯类似物或吡咯衍生物是指具有五聚吡咯环的化合物，并且其在不损害有用蛋白质如治疗用蛋白质的生物学活性的温度，PH和浓度的条件下具有杀病毒活性。
化学试剂所使用的唑类是咪唑，α-氨基-1H-咪唑-4-丙酸(组氨酸)，2-咪唑啉酮(亚乙基脲)，1H-咪唑-4-乙胺(I4EA)。唑类，去污剂(例如，多乙氧基醚；Triton X-100)，缓冲盐是试剂级并且从Sigma Chemicals，St.Louis，Mo.得到的。
病毒包被病毒水疮性口炎病毒(VSV)，印第安那株，从Finnish RedCross得到，是一种弹犬病毒(RNA)。痘苗病毒，Lederle株，ATCCVR-118，是一种痘病毒(DNA)。Sindbis是一种披盖病毒(RNA)。唇疮疹病毒1型(HSV-1)是一种疮疹病毒(DNA)。
非包被病毒脑心肌炎病毒(EMC)是一种鼠细小核糖核酸病毒(RNA)。脊髓灰质炎病毒2型是一种人脊髓灰质炎病毒(RNA)。呼吸道肠道病毒3型是一种呼吸道肠道病毒(RNA)。以前曾报道过病毒的衍生(参见，Lembach，et al.，Current Studies in Hematology andBlood Transfusion.Basel，Karger，1989；56.97-108)。
病毒分析在标准条件下，使用于24孔平板上生长好的VERO细胞单层上，测定除Sindbis外的所有病毒的效价，每个稀释度测4个孔。效价以组织培养物感染剂量表示50％终点估/ml(TCID50/ml)。以同样方式在BHK-21细胞单层上，标准条件估测细胞病变效应而测定Sindbis病毒的效价。
蛋白质因子VIII(FVIII)，给血友病给药的一种凝结因子，来自于悬浮培养生长的重组体仓鼠肾细胞。该重组FVIII.产物(rFVIII)描述于以D.J.Capon等人名誉申请的EP160,457中。
G类单克隆抗体(人)(m-IgG.抗肿瘤坏死因子，细胞系ATCCNO.HB9736)来源于以悬浮培养生长的埃-巴二氏病毒转化的人B淋巴细胞。通过离子交换和大小排阻层析(size exclusionchromatography)将IgG纯化到98％以上。这些抗体描述于H.Kuo的EP351,789中。
采用Cohn-Oncley方法从人血浆中纯化出纤维蛋白原。采用Cohn-Oncley方法从人血浆中纯化出人血清白蛋白(馏分V)。参见，例如，Cohn，E.J.，L.E.Strong，W.L.Hughes，D.J.Mulford，J.N.Ashworth，M.Melin和H.L.Taylor。“Preparationand Properties of Serum and Plasma Proteins.IV.A System for the Separation into Fractions ofthe Protein and Lipoprotein Components ofBiological Tissues and Fluid.”J.Am.Chem.Soc.68，459(1946)。
采用A280，放射性免疫扩散，以及FPLC-Superose 6(Pharmacia的快速蛋白质液相大小排阻层折)测算蛋白质回收率。采用基于活化的部分组织促凝血酶原激酶时间(APTT)以及经修改的Langdell的方法(Langdell，R.D.，Wagner，R.H.，Brinkhouse，A.“Effect of anti-hemophiliac Factoron one-Stage clotting Test，”J.Lab.Clin.Med.41637-647，1953)，测定FVIII。
处理方案将1/100稀释的病毒原液接种到蛋白质溶液中以最大程度地降低含病毒介质的作用。加入1倍体积的吡咯溶液达到最终所需浓度。在限定的条件(时间，温度)周期性地缓慢混合而培养经处理和对照样本。以适当的时间间隔取出样品并立即测出残留的感染病毒的效价。
进行一些测定显示有杀病毒活性的唑类型的研究。如表1所示，各种各样的唑类物质都能有效地降低VSV效价。导致病毒失活的主要功能基团是五聚吡咯环，通过改变环结构或者将其他功能基团连接到该环上可以调节该环功能。
表1VSV在含有FVIII的各种各样的唑类中，40℃时的失活动力学唑类 咪唑 咪唑组氨酸 2-咪唑啉酮I4EA浓度 0.02M 0.2M 0.2M 0.2M 0.2M时间(小时) 残留的病毒效价0 (7.5＊)(7.75) (8.25) (7.75) (8.25)1-- 6.25 7.0 ＞7.5 7.253-- 3.75 4.5 7.05.54-- 2.5 3.0 5.75 5.05-- ＜1.52.5 5.75 4.2565.75＜1.5 2.75 5.25 3.5()未处理＊LOG10TCID50/ML--未检测进行一些测定易于受唑类灭活的病毒类型的研究。表2列举了对于各种各样的包被和非包被病毒，从本质上减少病毒(降低2或多个logs值)必需的条件。
表2各种各样的包被和非包被病毒在FVIII中的失活参数包被病毒 非包被病毒病毒 VSVHSV-1 Sindbis 痘菌病毒 Polio-2 EMCREO-3处理时间(hr) 0.25 0.25 ＜1 ＜17 4 7温度(C) 15 15 15 4040 40 40咪唑(M) 0.02 0.02 0.02 0.2 0.2 0.20.2Triton 0.05 0.05 0.05 0.1 0.1 0.10.1X-100(％)效价(起始) 8.0＊ 6.75 8.25 6.25 6.5 6.57.75效价(最终) ＜1.5 ＜1.5＜1.5＜1.5 4.5 1.54.25减少 ＞6.5 ＞5.25 ＞6.75 ＞4.752.0 5.03.5*LOG10TCID50/ML
去污剂可以加强杀病毒活性。表3列举了几个例子，证明增加或丧失活性的特定条件。
表3去污剂和温度对咪唑的杀病毒活性的作用病毒 Sindbis EMC温度(C)15 15 40咪唑浓度(M)0.02 0.2 0.2Triton X-100浓度(％) 没有0.05没有 0.1 没有时间(hr) 残留病毒效价0 8.25＊ 8.25＊ 6.5 6.5 6.50.5 -- 2.0 --6.0 5.71 8.0 ＜1.5 6.25 5.75 5.72 5.75 6.25 3.255 6.25 6.25 ＜1.5*IOG10TCID50/ML--未检测用唑类处理基本上不能影响水溶液中的各种各样的蛋白质。回收率依据不同的蛋白质而变化。例如FVIII是一种非常大的，不稳定的蛋白质。使病毒基本上失活但不丧失活性的条件是不明显的。表4定义了FVIII的动力学。
表4有咪唑存在的各种各样条件下蛋白质的回收率蛋白质FVIIIFVIIIFVIII IgG纤维蛋白原咪唑浓度(M) 0.02 0.2 0.2 0.5 0.2温度(C) 40 30 40 4040时间 蛋白质回收率(起始％)0 100 100 100 100 1001 91 852 923 83 864 83 795 84 786 86 777＞95 81 7524 ＞95 ＞95 ＞95
对咪唑如何起作用的推测如下每个病毒粒子是由具有许多蛋白质亚单位来的蛋白质外膜组成。这些亚单位在金属离子溶液中是稳定的，并且当金属离子的浓度降低时这些亚单位裂解。能够提供电子的侧链残基如组氨酸可促进蛋白质亚单位结合到金属离子上。一种金属离子和蛋白质上组氨酸残基的咪唑环的ε-氮之间形成一种复合物。在含有病毒的溶液中，游离的咪唑与蛋白质亚单位上的咪唑基相竞争。当金属离子与游离的咪唑基相结合时，该蛋白质亚单位变得不稳定，并且病毒外膜打开，从而破坏了病毒粒子的天然结构。这种现象也依赖于溶液中蛋白质(例如FVIII)的浓度，并且进一步支持了溶液中咪唑与蛋白质上咪唑相竞争的观点。
对本领域内技术人员而言上面描述的发明显然可以发生变化。因而上述实施例应仅是作为举证，本文公开的发明不应仅仅受下列权利要求的限制。
权利要求
1.一种将治疗用的，生物学活性蛋白质水溶液中的病毒灭活的方法，包括在足于使病毒从本质上失活而基本上不损害蛋白质的条件下将该溶液与一种唑接触。
2.权利要求1所述的方法，其中唑选自由咪唑，组氨酸，2-咪唑啉酮，1H-咪唑-4-乙胺组成的组。
3.权利要求2所述的方法，其中所述唑是咪唑。
4.权利要求3所述的方法，其中所述唑是一种咪唑类似物。
5.权利要求1所述的方法，包括包住去污剂的其他步骤。
6.权利要求5所述的方法，其中去污剂是Triton X-100。
7.权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质选自凝结因子和抗体组。
8.权利要求1所述的方法，其中病毒减少至少2logs。
9.权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质的生物学活性的恢复率大于50％。
全文摘要
在水溶液中利用可溶性吡咯作为生物学活性蛋白制剂的杀病毒剂。
文档编号A61K38/36GK1129139SQ9510515
公开日1996年8月21日 申请日期1995年4月10日 优先权日1994年4月11日
发明者M·B·多布金, P·K·吴, G·B·达夫 申请人:美国拜尔公司