专利名称：体内半衰期改变的生物活性蛋白质偶联物的制作方法
体内半衰期改变的生物活性蛋白质偶联物
本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2006/002501，国际申请日为2006年I月25日，进入中国国家阶段的申请号为200680002871.0，名称为“体内半衰期改变的生物活性蛋白质偶联物”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉参考
根据35U.S.C119(e)，本申请要求2005年8月30日提交的美国申请号60/712，585和2005年I月25日提交的美国申请号60/647，119的优先权，纳入其内容作为参考。技术领域
本发明总地涉及生物活性蛋白质，更具体涉及改变生物活性蛋白质的半衰期。
序列表
根据37C.F.R.§ § 1.821 (C)和1.52 (e)，本申请含有冗长的序列表，通过⑶-R代替打印纸件提交此序列表。2006年6月30日刻录的所述⑶-R分别标记为CRF," Copyl"、" Copy2"和"Copy3"。各自仅含有一个相同的 2.3MB 文件(CELTH349.APP)。将含有序列表的⑶-R的内容纳入本文作参考(37C.F.R.§ 1.52(e) (5)).背景技术
作为人类治疗药物给予时，生物活性蛋白质的半衰期常常不理想。它们的固有半衰期使得给药方案和剂量方案常常达不到最优治疗效果，产生顺从性问题和使患者不方便。
在用于人类治疗的生物活性蛋白质生产中，曾尝试通过物理方法(如改变给药途径、纳米颗粒包装和脂质体包裹)、化学修饰(如乳化、PEG化和超糖基化)和遗传修饰(如修饰蛋白质一级结构，聚合物标记、人血清白蛋白融合、掺入翻译后修饰)延长生物活性蛋白质的半衰期。参见例如，Lord 等，Clin.Cancer Res.7:2085-2090 (2001)和 van DerAuwera等,Am.J.Hematol.66:245-251 (2001)。然而,这些方法会产生其它问题。通过物理方法延长生物活性蛋白质半衰期常常使药物复杂性增加，在制造过程中增加了成本高和耗时的下游加工。化学修饰可能改变生物活性蛋白质的生物学活性或安全性。通过重组DNA合成法制备生物活性蛋白质时，需要根据具体应用在特定的细胞表达系统中评估遗传修饰对蛋白质产率和纯度的影响。
因此，需要改变生物活性蛋白质的固有半衰期的其它方法。发明内容
本发明一方面涉及包含生物活性多肽的蛋白质偶联物，所述生物活性多肽通过肽键偶联于含有2个至约500个重复单元肽基序的多肽(氨基酸延伸物)。该基序包含主要组件和次要组件，其中主要组件是两个或多个Asn (N)残基，次要组件是选自Ser(S)和Thr (T)的一种氨基酸的一个或多个残基，限制条件是:没有一种氨基酸同时存在于主要组件和次要组件中，与未偶联的生物活性多肽的固有半衰期相比，该偶联物的血浆半衰期有所延长。术语"固有半衰期"指天然生物活性多肽的半衰期或未偶联形式(因此包括重组形式的天然多肽)多肽的半衰期。
在一些实施方式中，所述肽基序包含3-6个氨基酸残基(即3、4、5或6个)。在一些实施方式中，所述肽基序含有5或6个氨基酸残基,次要组件包含所述肽的I个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述氨基酸延伸是在所述生物活性多肽的N-末端；在一些实施方式中，是在所述生物活性多肽的C末端；在其它实施方式中，延伸位于所述生物活性多肽的N和C-末端。在一些实施方式中，所述生物活性多肽是细胞因子(如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人生长激素或干扰素、如β-干扰素或Y-干扰素)、抗体、抗体片段、蛋白水解抗体片段或结构域、单链抗体、遗传或化学优化的抗体或其片段、可溶性gpl20或gpl60糖蛋白、凝血因子、可溶性受体如肿瘤坏死因子(TNF)-Ci II型受体、治疗酶或红细胞生成素(EPO)。
本发明另一方面涉及含有蛋白质偶联物和载体的组合物。在一些实施方式中，所述组合物是药物组合物，所述载体是药学上可接受的载体。
本发明另一方面涉及编码上述蛋白质偶联物的嵌合DNA分子和含该嵌合DNA分子的载体，以及用该嵌合DNA分子或含有该嵌合DNA分子的载体转化的细胞。在一些实施方式中，所述载体是质粒，如pCE2。在一些实施方式中,所述细胞是哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或者是细菌如大肠杆菌(E.coli)，或酵母。
本发明另一方面涉及制备包含生物活性多肽的生物活性蛋白质偶联物的方法，所述生物活性多肽通过肽键偶联于含有2个至约500个含主要组件和次要组件的肽单元的多肽，所述主要组件是两个或多个Asn (N)残基，次要组件是选自Ser(S)和Thr (T)的一种氨基酸的一个或多个残基，限制条件是:没有一种氨基酸同时存在于所述主要组件和所述次要组件中，因而与未偶联的生物活性多肽的固有半衰期相比，所述生物活性蛋白质的血浆半衰期有所延长，所述方法包括:在表达编码所述蛋白质偶联物的嵌合DNA分子的条件下培养用所述DNA分子转化的细胞，从而产生所述蛋白质偶联物；和从所述细胞中提取所述嵌合DNA分子的表达产物。
本发明另一方面涉及测定某给定蛋白质偶联物的血浆半衰期相对于未偶联生物活性多肽的固有半衰期是否延长的方法，所述方法包括:a)制备包含生物活性多肽的蛋白质偶联物，所述生物活性多肽通过肽键偶`联于含有2个至约500个重复单元肽基序的多肽，所述基序包含主要组件和次要组件，其中主要组件包含两个或多个Asn (N)残基或由其组成，次要组件包含选自Ser(S)和Thr (T)的一种氨基酸的一个或多个残基或由其组成，没有一种氨基酸同时存在于所述主要组件和所述次要组件中，和b)检测该蛋白质偶联物以确定该蛋白质偶联物的血浆半衰期相对于未偶联生物活性多肽的固有半衰期是否延长。
图1是PHO X pBSK载体的示意图。
图2 是 PHO-G-CSF-NN x pBSK 载体的示意图。
图3 是 PH0-G-CSF-NNT65x pBSK 载体的示意图(NNT65 如 SEQ ID NO:1 所述)。
图4 是 PH0-G-CSF-NNT155x pBSK 载体的示意图(NNT155 如 SEQ ID NO:2 所述)。
图5 是 PH0-G-CSF-NNT155x pCE2 载体的示意图(NNT155 如 SEQ ID NO:2 所述)。
图6是几种不同G-CSF-多肽偶联物和未偶联G-CSF的Western印迹，NNT65、NNT155 和 NNNNNTNN61 分别如 SEQ ID NO:1_3 所述。
图7是电泳前用PNG酶F处理的几种不同G-CSF-多肽偶联物和未偶联G-CSF的Western 印迹，NNT65、NNT155 和 NNNNNTNN61 分别如 SEQ ID NO:1_3 所述。
图8是用PR0CH04-CDM培养基培养的CHOKl细胞中表达的G_CSF_NNT155 (NNT155如 SEQ ID NO:2 所述)和 G-CSF-NNT65 (NNT65 如 SEQ ID NO:1 所述)构建物(一式两份)的Western印迹。
具体实施方式
本文所用术语"多肽"指没有特定长度的氨基酸聚合物，除非另有说明。因此，"多肽"的定义包括肽和蛋白质，在本说明书、以及权利要求书中，可互换使用这些术语。术语"多肽"不排除翻译后修饰，如具有共价连接的糖基、乙酰基、磷酸基团、脂质基团、脯氨酸或赖氨酸羟基化等的多肽。"多肽"的定义也包括其同源物。
本文所用术语"纯化"指生物活性蛋白质偶联物已纯化的水平足以满足其应用所需。
总的来说，本发明涉及包含生物活性多肽的蛋白质偶联物，所述生物活性多肽通过肽键偶联于含有2个至约500个重复单元肽基序的多肽，所述基序包含主要组件和次要组件，其中主要组件是两个或多个Asn (N)残基，次要组件是选自Ser(S)和Thr(T)的一种氨基酸的一个或多个残基，限制条件是:所述氨基酸均不同时存在于所述主要组件和所述次要组件中。本发明蛋白质偶联物的血浆半衰期长于相应的未偶联生物活性多肽或蛋白质。
该基序的重复单元通常含有3_7(3、4、5、6或7)个氨基酸残基。以N(Asn)为主要组件的代表性妝基序见表I。
此肽基序的数目为2个至约500个。因此，该多肽中存在的包括本文所列特定肽基序的所述基序含有以下数 目的单元:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、I10、II1、I12、I13、I14、I15、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499和500 (包括其中的任何子范围)。
如上所述，偶联于所述生物活性多肽的多肽也可称为该生物活性多肽的氨基酸或聚氨基延伸物(以下称为"氨基酸延伸物")。所述氨基酸延伸物可位于该生物活性多肽序列的N末端、C末端或N末端和C末端。
如果不受限于理论，申请人认为，该氨基酸延伸物不采取稳定的构象，因此不干扰或影响蛋白质的活性。还认为将该氨基酸延伸物限制于两种不同氨基酸能降低该氨基酸延 伸物的化学复杂性，这有助于最大程度降低潜在的免疫原性，以及对物理化学特性的调节比仅采用一种类型或种类的氨基酸时广泛得多。
广义上说，所述生物活性多肽包括任何蛋白质(包括天然多肽，即其体内存在形式)或重组产生的多肽，如血浆半衰期经延长的重组人G-CSF(rh-G-CSF)，从某些观点，尤其是从治疗观点来看，需要这种延长，这意味着将其递送给脊椎动物时，能治疗，如治愈、改善或减轻该脊椎动物某给定疾病的症状，或者，通过最终减慢疾病的进展延长该脊椎动物的生命。生物活性蛋白质的类型包括:细胞因子、趋化因子、淋巴因子、配体、受体、激素、凋亡诱导多肽、酶、抗体和抗体片段以及生长因子。受体的例子包括TNF I型受体、II型IL-1受体、IL-1受体拮抗剂、IL-4受体和任何化学或遗传学修饰的可溶性受体。酶的例子包括:胶原酶(如AdvanceBiofactures Corporation以商品名SANTYL運)出售)；agalsidase-β (如Genzyme 以商品名 FABRAZYME 出售)；链球菌DNA酶-α (如Genentech以商品名I3UlMOZYME: 出售);阿替普酶(如Genentech以商品名ACTIVASE: 出售);PEG化天冬酰胺酶(如Enzon以商品名ONCASPAR J 出售)；天冬酰胺酶(如Merck以商品名ELSPAR 出售)；和伊米苷酶(如Genzyme以商品名CEREDASE. 出售)。特异性多肽或蛋白质的例子包括但不限于:粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，集落刺激因子(CSF)，干扰素β (IFN-β)，干扰素Y (IFNy)，干扰素Y诱导因子I (IGIF)，转化生长因子β (TGF-β)，RANTES(活化后调节，正常T-细胞表达，估计可能分泌)，巨噬细胞炎性蛋白(如MIP-1-α和MIP-1-β)，利什曼虫延伸起始因子(LEIF)，血小板衍生生长因子(TOGF)，肿瘤坏死因子(TNF)，生长因子，如表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-2 (NT-2)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养因子-4(NT-4)、神经营养因子-5 (NT-5)、神经胶质细胞系-衍生的神经营养因子(⑶NF)、纤毛神经营养因子(CNTF)，TNF-α II型受体，红细胞生成素(EPO)，胰岛素和可溶性糖蛋白，如gpl20和gpl60糖蛋白。gpl20糖蛋白是人免疫缺陷病毒(HIV)包膜蛋白，gpl60糖蛋白是gpl20糖蛋白的已知前体。
生物活性多肽可用于治疗疾病，如帕金森病、癌症和心脏病。此外，治疗性多肽可用于治疗自身免疫病，如多发性硬化；斯耶格伦综合征；结节病；胰岛素依赖性糖尿病；自身免疫性甲状腺炎；关节炎(如骨关节炎、类风湿性关节炎、活动性关节炎和牛皮癣性关节炎)；强直性脊柱炎；和硬皮病。同时，本发明治疗性多肽可用于治疗急性和慢性炎症，以促进身高增加、促进伤口愈合和防止细胞、组织或器官移植后的排斥反应。
在一些优选实施方式中，所述多肽是G-CSF。G-CSF能诱导中性粒细胞快速增殖并释放入血流，从而提供抵抗感染的疗效。如美国专利6，831，158所述，重组人(rh)-G-CSF通常用于治疗各种形式的白细胞减少症(白细胞水平降低)和嗜中性粒细胞减少症(嗜中性粒细胞水平降低)。白细胞减少症和嗜中性粒细胞减少症导致对各种感染的易感性增加。_4]可获得名为非格司亭(GRAN'6'和ΝΕΙΓΡΟΓτΕΝ^)、来格司亭(NRUTROGTN 和 GRANOr’YTF* )和那托司亭(TsHEU-UP )的 rh-G-CSF 的市售制剂。GRAN 和NF:1 JPOGRNr是非糖基化的，由重组大肠杆菌细胞生产。isTEIITRfKTTN 和 是糖基化的，由重组CHO细胞生产。是非糖基化的，重组大肠杆菌细胞生产的完整rh-G-CSF的N末端区有5个氨基酸被取代。
除了 G-CSF本身以外，也可采用具有生物学功能或生物学活性的G-CSF类似物。制备rh-G-CSF的方法参见美国专利4，810, 643。美国专利4，810, 643中也报道了各种G-CSF类似物。美国专利5，985，265中提供了编码rh-G-CSF的多核苷酸和rh-G-CSF的氨基酸结构。
本发明蛋白质偶联物的氨基酸序列(SEQ ID NO:390)和相应的多核苷酸序列(SEQID NO:391)的代表性例子见表2。包括了 PHO前导序列。
在氨基酸序列中，PHO前导序列位于氨基酸1-18，G-CSF位于氨基酸19-192，NNT155氨基酸延伸物(NNT155如SEQ ID N0:2所述)位于氨基酸193-347。用符号"*"标出终止密码子。
如多核苷酸序列(SEQ ID NO:391)所示，核酸1_54编码PHO前导序列，核酸55-576编码G-CSF,核酸577-1041编码NNT155氨基酸延伸物(NNT155如SEQ IDNO:2所述)。核酸1042-1044 (TAG)构成了终止密码子。
在一些实施方式中，重复肽单元的数目为75-225个。因此，就含有G-CSF和与其连接的含序列NNT肽基序重复单元的多肽的蛋白质偶联物而言，本发明实施方式可包括以下任何一种蛋白质偶联物(依出现次序，(NNT)75- (NNT) 225分别如SEQ IDNO:4_83、628 和 84-153 所述):G_CSF-(NNT) 75、G-CSF-(NNT) 76、G-CSF-(NNT) 77、G-CSF-(NNT) 78、G-CSF-(NNT) 79、G-CSF-(丽T)8(l、G-CSF-(丽Τ) 81、G-CSF-(丽Τ) 82、G-CSF-(NNT)83^G-CSF-(NNT) 84、G-CSF-(丽T)85、G-CSF-(丽Τ) 86、G-CSF-(丽Τ) 87、G-CSF-(NNT)88,G-CSF-(NNT) 89、G-CSF-(丽T)9(l、G-CSF-(丽Τ) 91、G-CSF-(丽Τ) 92、G-CSF-(NNT)93^G-CSF-(NNT) 94、G-CSF-(丽T)95、G-CSF-(丽Τ) 96、G-CSF-(丽Τ) 97、G-CSF-(NNT)98,G-CSF-(NNT) 99、G-CSF-(NNT)咖、G-CSF-(NNT) 1(11、G-CSF-(NNT) 1(12、G-CSF-(NNT) 103>G-CSF- (NNT) 1(14、G-CSF- (NNT) 1(15、G-CSF- (NNT) 1(16、G-CSF- (NNT) 1(17、G-CSF- (NNT) 1(18、G-CSF- (NNT)109, G-CSF-( NNT) 11(|、G-CSF- (NNT)111, G-CSF-(NNT) 112、G-CSF-(NNT) 11权利要求
1.一种含有生物活性多肽的生物活性蛋白质偶联物，所述生物活性多肽选自细胞因子、趋化因子、淋巴因子、配体、受体、激素、凋亡诱导多肽、酶、抗体、蛋白水解抗体片段、抗原特异性抗体片段和生长因子，所述生物活性多肽通过肽键偶联于含有2个至250个重复单元的肽基序的多肽，其中，所述基序含有两个Asn (N)残基和一个选自Ser (S)和Thr(T)的氨基酸残基，因而与未修饰的生物活性多肽的血浆半衰期相比，该生物活性蛋白质偶联物的血浆半衰期延长。
2.如权利要求1所述的生物活性蛋白质偶联物，其特征在于，所述肽基序具有由NNS或NNT组成的序列。
3.如权利要求1所述的生物活性蛋白质偶联物，其特征在于，所述含有重复单元的肽基序的多肽是所述生物活性多肽的N末端、C末端、或N末端和C末端。
4.如权利要求1所述的生物活性蛋白质偶联物，其特征在于，所述生物活性多肽是细胞因子。
5.如权利要求4所述的生物活性蛋白质偶联物，其特征在于，所述细胞因子是干扰素或生长因子。
6.如权利要求5所述的生物活性蛋白质偶联物，其特征在于，所述生长因子选自:粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，血小板衍生生长因子(TOGF)，肿瘤坏死因子(TNF)，表皮生长因子(EGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，神经生长因子(NGF)和红细胞生成素(EPO)。
7.如权利要求5所述的生物活性蛋白质偶联物，其特征在于，所述干扰素是β-干扰素或Y-干扰素。
8.如权利要求4所述的生物活性蛋白质偶联物，其特征在于，所述细胞因子选自干扰素Y诱导因子I (IGIF) ,RANTES (活化后调节，正常T-细胞表达，估计可能分泌)，巨噬细胞炎性蛋白-1-α (MIP-1-α)，巨噬细胞炎性蛋白-1-β (ΜΙΡ_1_β )，利什曼虫延伸起始因子(LEIF)，脑衍生的神经营养因子(BDNF)，神经营养因子_2 (ΝΤ-2)，神经营养因子_3 (ΝΤ-3)，神经营养因子-4(ΝΤ-4)，神经营养因子-5(ΝΤ-5)，神经胶质细胞系-衍生的神经营养因子(⑶NF)和纤毛神经营养因子(CNTF)。
9.如权利要求1所述的生物活性蛋白质偶联物，其特征在于，所述生物活性多肽包括抗体、抗原特性抗体片段 、抗体的蛋白水解片段或结构域、单链抗体、遗传或化学优化的抗体或其蛋白水解或抗原结合片段。
10.如权利要求1所述的生物活性蛋白质偶联物，其特征在于，所述生物活性多肽选自可溶性gpl20糖蛋白、可溶性gp 160糖蛋白、IL-1受体拮抗剂、凝血因子和胰岛素。
全文摘要
本发明公开了含有生物活性多肽的生物活性蛋白质偶联物，所述生物活性多肽通过肽键偶联于含有2个至约500个重复单元肽基序的多肽，所述生物活性蛋白质偶联物显示的血浆半衰期与未偶联生物活性多肽或蛋白质的固有半衰期相比有所改变。本发明也公开了制备和应用偶联蛋白的方法，以及确定某给定偶联物的半衰期相对于未偶联多肽的固有半衰期是否改变的方法。
文档编号C12N9/12GK103172747SQ201310013079
公开日2013年6月26日 申请日期2006年1月25日 优先权日2005年1月25日
发明者M·贝斯曼, S·齐普曼, D·里昂, J·辛格 申请人:细胞治疗学公司