专利名称：猪流行性腹泻病毒变异株检测用引物及其检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及猪流行性腹泻病毒变异株检测用引物及其检测试剂盒。属于生物检测技术领域。
背景技术：
猪流行性腹湾(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)是由猪流行性腹湾病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)引起的一种急性、高度接触性的传染病,常以急性肠炎和伴有脱水的水样腹泻为特征，各种年龄的猪均易感。本病于1971年首先发现于英国，此后，欧洲和亚洲各国也报道了该病的暴发。我国在1973年分离到PEDV(经典毒株)。2010年冬季至2011年春季全国各地猪场的猪群中先后发生严重的传染性腹泻疾病，发病突然，传播较快，流行范围广，流行时间长，应用各种抗生素防治无效，其发病率与死亡率很高，造成重大 的经济损失。经研究表明，猪流行性腹泻病毒变异株是此次疫情的兀凶(Jianfei Chen 等 Complete Genome Sequence of a Porcine Epidemic DiarrheaVirus Variant. J. Virol, 2012, 86: 3408)。猪流行性腹湾病毒变异株(Yanjun Zhou等Complete Genome Sequence of a Virulent Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain.J. Virol, 2012, 86: 13862)与原来毒株 PEDV (经典毒株)(Jianfei Chen 等 CompleteGenome Sequence of a Chinese Virulent Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain.J. Virol, 2012，86: 3408)的基因组同源性在97%左右，变异最大的为S基因，同源性在94%以下，且存在氨基酸发生缺失和插入的序列特征(Wentao Li等New variants ofporcine epidemic diarrhea virus, China, 2011. Emerg.1nfect. Dis, 2011, 85:11538)。此前，我国尚无PEDV变异株(命名为PEDV-V)的特异检测技术。常规RT-PCR技术不能区分PEDV (经典毒株)和PEDV-V (PEDV变异株)，因此不能特异地检测PEDV变异株。现如今，对猪流行性腹泻病毒变异株的检测只能通过基因测序来确定该病毒的感染，操作繁杂、耗时长、成本较高。因此，基于以上的研究和当前的需求，申请人根据猪流行性腹泻病毒变异株S基因发生核苷酸缺失和插入的特征，设计并合成了一对检测猪流行性腹泻病毒变异株的引物，采用RT-PCR方法扩增S基因，通过扩增片段的分子量大小，判断是否存在猪流行性腹泻病毒变异株，从而特异、敏感、省时、省力、低成本地检测出猪流行性腹泻病毒变异株。目前其他RT-PCR方法不能解决该问题；基因测序技术需要时间较长，且费时、费力、成本高。因此，该技术可对猪流行性腹泻病毒变异株的诊断和监测起到重要作用。
发明内容
技术问题
本发明目的在于提供用于PEDV变异株RT-PCR检测的引物序列及其检测试剂盒。
技术方案
本发明通过分析PEDV变异株的S基因序列，在S基因发生核苷酸插入和缺失的序列处设计引物。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO. 2 所示。具体地，本发明提供了一种PEDV变异株检测用引物，该引物的正向引物(PEDV-VF)序列SEQ ID NO.1和反向引物(PEDV-VR)序列SEQ ID NO. 2的核苷酸序列为
SEQ ID NO.1 :5’ -TTGGTGAAAACCAGGGTGTC-3’
SEQ ID NO. 2 :5’ -CAACACTATGTTCACTCA-3’。该引物从感染猪流行性腹泻病毒变异株的病料提取的总RNA中扩增出327 bp DNA片段。本发明还提供了一种用于检测猪流行性腹泻病毒变异株的试剂盒，该试剂盒含有上述引物 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO. 2。具体的，该试剂盒包括
(1)阴性对照取灭菌的DEPC水，置-20°c冰箱保存；
(2)RT反应液
无菌 DEPC 水4. 75 μ L
10ymol/L dNTPI μ L
20 μ moI/L PEDV-VR I μ L 5X反转录缓冲液4yL40 U/ μ L RNA酶抑制剂 I μ L
O.1 mmol/L DTT2 μ L
200U/yL 反转录酶O. 25 μ L
混匀后_20°C保存；
(3)PCR反应液
无菌 DEPC 水32. 5 μ L
20 μ mol/LPCR弓丨物混合液 2 μ L 10XPCR缓冲液5yL
2. 5 mmol/L dNTP8μ L
5U/ μ L DNA 聚合酶 O. 5 μ L 混匀后_20°C保存。所述的试剂盒，还包括阳性对照为猪流行性腹泻病毒变异株JS-HZ2012发生腹泻的粪便样品。有益效果
本发明是根据猪流行性腹泻病毒变异株S基因序列设计的引物，本发明的引物是经过大量PEDV的S基因序列比对和筛选得到的，而且应用该引物及本发明中的检测试剂盒能够快速地判断样品中是否含有猪流行性腹泻病毒变异株，为猪的腹泻病提供检测工具。
同时，进过大量的临床检测和测序分析比对，都证实本发明的检测引物和检测试剂盒能够准确无误的检测目前我国流行的猪流行性腹泻病毒变异株，且不能检测出猪流行性腹泻病毒经典毒株，能够达到区分变异株和经典株的目的，而以往检测方法无法区分变异株和经典株。本发明的引物和检测试剂盒能够为临床上检测猪腹泻病提供有效的工具。
图1是猪流行性腹泻病毒变异株(PEDV-V)的RT-PCR检测结果，其中M DL2000DNA ladder ;1、猪流行性腹泻病毒变异株；2、猪流行性腹泻病毒经典毒株(PEDV);3、猪传染性胃肠炎病毒(TGVE) ;4、猪轮状病毒(PRV) ;5、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ;6、阴性对照。图2是本发明检测方法的灵敏度实验结果。其中M DL2000 DNA ladder ;1_11表示反转录反应体系中加入的连续10倍稀释的RNA模板；12、阴性对照。
具体实施例方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例11、引物的设计和合成
根据猪流行性腹泻病毒变异株S基因的核苷酸序列，采用Primer 5. O设计引物，经过大量筛选得到如下序列的引物序列
正向引物(PEDV-VF)的序列为SEQ ID NO. 1，反向引物(PEDV-VR)序列为SEQ ID NO. 2，具体序列的组成如下
SEQ ID NO.1 :5’ - TTGGTGAAAACCAGGGTGTC -3’
SEQ ID NO. 2 :5’ - CAACACTATGTTCACTCA-3’。
根据上述核苷酸序列信息合成正向引物PEDV-VF和反向引物PEDV-VR。将上述引物PEDV-VF和PEDV-VR分别配置成浓度为20 μ mo I/L的溶液，备用。2、一种检测猪流行性腹泻病毒变异株的试剂盒，按下表组装
表I试剂盒组成
权利要求
1.猪流行性腹泻病毒变异株检测用的引物，包括正向引物 PEDV-VF (SEQ ID NO.1) :5’ -TTGGTGAAAACCAGGGTGTC-3’ 和反向引物 PEDV-VR (SEQ ID NO. 2) 5，-CAACACTATGTTCACTCA-3，； 该引物从感染猪流行性腹泻病毒变异株的病料提取的总RNA中扩增出327 bp DNA片段。
2.一种用于检测猪流行性腹泻病毒变异株的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1所述的引物。
3.、如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包括 (1)阴性对照取灭菌的DEPC水，置-20°C冰箱保存； (2)RT反应液 无菌 DEPC 水4. 75 μ L 10ymol/L dNTPI μ L 20 μ moI/L PEDV-VR I μ L 5X反转录缓冲液4yL 40 U/ μ L RNA酶抑制剂 I μ L O.1 mmol/L DTT2 μ L 200U/yL 反转录酶O. 25 μ L 混匀后_20°C保存； (3)PCR反应液 无菌 DEPC 水32. 5 μ L 20 μ mol/LPCR弓丨物混合液 2 μ L 10XPCR缓冲液5yL 2. 5 mmol/L dNTP8μ L 5U/ μ L DNA 聚合酶 O. 5 μ L 混匀后_20°C保存。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，还包括阳性对照为猪流行性腹泻病毒变异株JS-HZ2012发生腹泻的粪便样品。
全文摘要
本发明提供了猪流行性腹泻病毒变异株检测用引物及其检测试剂盒，属于生物技术领域。所述正向引物PEDV-VF(SEQ ID NO.1)5’-TTGGTGAAAACCAGGGTGTC-3’和反向引物PEDV-VR(SEQ ID NO.2)5’-CAACACTATGTTCACTCA-3’。本发明还进一步提供了检测猪流行性腹泻病毒变异株的检测试剂盒。其检测方法以总RNA为模板，利用上述引物进行反转录PCR(RT-PCR)扩增，反应结束后根据扩增片段的位置判定结果。本发明的引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，为猪流行性腹泻病毒变异株的检测提供了保证。
文档编号C12N15/11GK103060474SQ201310012559
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月7日 优先权日2013年1月7日
发明者李彬, 何孔旺, 杜露平, 郭容利, 倪艳秀, 温立斌, 俞正玉, 张雪寒, 茅爱华, 吕立新, 胡屹屹, 周俊明, 王小敏, 祝昊丹, 于洋 申请人:江苏省农业科学院