专利名称：一种快速鉴别诊断不同血清型禽白血病病毒pcr-hrm分析方法的建立的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒研究方法，特别涉及一种禽白血病病毒的研究方法。
背景技术：
禽白血病(Avian Leukosis, AL)是由禽白血病/肉瘤病毒群病毒(AvianLeukosis / sarcoma virus,AL / SV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。根据临床症状可分为淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、成髓细胞白血病、髓细胞样白血病、结缔组织性肿瘤和骨硬化病等，其中以淋巴白血病最为常见。禽白血病病毒可分为A、B、C、D、E和J共6个亚型。其中，A、B、C、D和J亚型为外源性病毒，而C、D亚型在自然状态下很少存在，E亚型病毒为极普遍存在的内源性病毒。在我国，外源性禽白血病病毒主要为J亚型，A、B亚型报道较少。至今，人类对禽白血病的防治几乎仍无计可施，世界各国控制禽白血病的主要方法是通过早期反复多次的病原检测，淘汰阳性鸡(A、B、J亚型)，从而净化种群达到局部消灭本病的目的。因此，及时准确的对禽白血病病毒进行诊断及分型，特别是区分其内源型和外源型，有助于确定该病毒的流行趋势，进而采取相应的措施加以控制。目前，禽白血病病毒鉴定及血清分型的方法有许多种，包括病毒的分离与鉴定、ELISA方法和PCR技术等等，但这些方法均难以快速有效地对病毒进行分型。究其原因，主要是检测技术的敏感性、准确性及检测操作复杂化(内源性病毒的干扰需经细胞培养才能消除，从而导致工作量巨大)影响了疫病的检测及净化。现有的检测方法介绍如下:
病毒的分尚与鉴定
病毒分离鉴定是诊断禽白血病最为有效、可靠的技术。用于病毒分离的理想材料为血浆、粪便、蛋清、胚胎、精液、和羽髓。将被检材料经适当处理后，接种于DF-1细胞。由于只有外源性ALV在DF-1细胞上生长，既可用P27 ELISA试剂盒来检测有无病毒生长。而内源性ALV不能在DF-1细胞上生长，从而可区分内源和外源病毒的感染。病毒分离检测技术最大的缺点是费时、昂贵，不易对大量样品进行检测。即使在最适宜条件下，从取样到出结果至少需要10天。此外，即使病毒分离技术可以方便的应用于诊断鸡只的感染，也很难确保鸡体内不存在有潜伏感染的病毒，更不能排除鸡只发生再感染的可能。酶联免疫吸附试验(ELISA)
ELISA检测技术的优点是廉价、快速，适用于包括蛋清、血清、胎粪、泄殖腔棉拭子等多种样品的检测。1979年，Smith用兔抗禽白血病衣壳蛋白p27建立了检测ALV抗原的双抗夹心ELISA法。目前，ALV抗原诊断试剂盒已实现商品化。这种检测技术最大的缺点是检测结果不时出现假阳性， 因为双抗夹心ELISA只检测该病毒的一种蛋白质:p27，利用该技术检测出的阳性结果仅能说明待检样品中含有P27，而p27是禽白血病的群特异性抗原，在内源性病毒和外源性病毒中均属保守的一种蛋白质，利用双抗夹心ELISA所检测出的阳性结果并不能证实这种蛋白来源于外源性病毒。因此，在检测外源性病毒时常出现一定数量的假阳性结果。虽然市场上已经有用于检测ALV-AB亚群抗体和ALV-J亚群抗体的ELISA试剂盒出售，但是由于ALV-J亚群病毒的抗原变异率很高，因此对于某株J亚群病毒具有结合作用的抗体并不能与所有ALV-J的其它分离株结合。因此，在使用ELISA方法进行感染诊断时，也容易出现假阴性结果，影响其准确性。此外，禽白血病的病毒血症与抗体产生不同步，ELISA只能检测ALV的抗体水平，即使检测是阳性样品，只能说明曾经感染过ALV，不能判断鸡群中现在是否还存在ALV的感染。聚合酶链式反应(PCR)
直接从病变组织、肿瘤或细胞提取物中提取病毒RNA或者前病毒DNA，利用PCR的方法来检测ALV已经成为实验室诊断的常规手段，可以区分鉴别不同亚群的ALV。绝大部分设计引物的区域位于env和LTR序列。现已有一些特异性的引物可以检测绝大部分的ALV分离株，也有用于检测细胞培养中感染的内源性E亚群病毒。PCR检测技术虽然特异性高，但是该方法是根据PCR扩增产物的电泳条带大小来分析不同亚群，所以该方法目前 还做不到高通量的检测任务，而亚群特异性探针价格昂贵也限制了荧光定量PCR检测方法的实际应用。因此，目前急需一种操作相对简易、检测结果可靠且检测成本低廉的禽白血病快速分型方法用于规模化种鸡厂禽白血病病毒的分型研究。
发明内容
本发明的目的在于提供2对用于禽白血病病毒分型的引物。本发明的另一个目的在于提供一种禽白血病病毒分型鉴别方法。本发明所采取的技术方案是:
一种鉴别不同亚型禽白血病病毒的引物，包括两对引物，分别为通用引用Pl和P2，以及J亚型特异引物P3和P4，其中:
Pl:CCTTGCTGCCAACGACACTTA (SEQ ID NO:1)
P2:GAACCTARCAGYTGTAGTC (SEQ ID NO:2)
P3:CAGGAAACGTGTGGGTCACC (SEQ ID NO:3)
P4:TTATTGGACTTACCATCG (SEQ ID NO:4)。一种快速鉴别不同亚型禽白血病病毒的方法，包括如下步骤:
1)从样品中提取病毒RNA，并反转录为cDNA；
2)以cDNA为模板，分别加入上述扩增引物对和荧光饱和染料进行扩增；
3)对扩增产物直接进行HRM分析，确定病毒的亚型；
其中，所使用的引物为上述的引物Pl P4。进一步的，通用引物扩增的反应体系为: ddH20 2.4 μ I
Premix Taq 5 μ I上游引物(PD 0.4μ I下游引物(Ρ2) 0.4μ I模板0.8 μ I LC green 染料 I μ I Total 10 μ 1进一步的，J亚型特异引物扩增的反应体系为: ddH20 2.4 μ I
Premix Taq 5 μ I上游引物(Ρ3) 0.4μ I下游引物(Ρ4) 0.4μ I模板0.8 μ I
LC green 染料 I μ I Total 10 μ 1进一步的，上述两个扩增的反应程序为:
94°C预变性5min ；
94°C变性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s ;循环35次；
72°C终延伸8min。本发明的有益效果是:
本发明的通用引物,简并性好,对禽白血病病毒A、B、C、D和E亚型均有很好地的扩增性，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间；本发明的特异性引物，特异性好，可以特异性扩增出J亚型。对使用本发明引物得到的扩增产物进行HRM分析，与已知亚型的标准HRM曲线进行比对(利用构建的标准质粒作图)，就可以准确、快速、高通量地进行禽白血病病毒分型，特别是可以快速、准确地区分内源型和外源型禽白血病病毒。本发明方法，具有如下优点:
￠:操作简单:只需PCR反应之前加荧光饱和染料即可；::!::检测速度快且高通量:5 10分钟即可完成96/384孔板的PCR产物检测，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了检测时间；:f:对病源物进行HRM分析，可直接反应当前感染状态，有利于后续的流行病学研究。
通过分析HRM熔解曲线形状即可区分外源性和内源性ALV病毒，避免了由于群特异性
ALV-P27抗原检测而造成的假阳性。可对ALV分子进化进行动态监测。@费用低，不需
要特异性探针，每个样品的饱和染料成本为1.6 RMB ;,文;准确性高95%、特异性好99 % (片段长度400 lkb)，重复性达到100%。
图1是不同亚型禽白血病病毒质粒PCR的电泳 图2是ALV的模拟峰型化熔解曲线图； 图3是ALV质粒样品标准化熔解曲线图；图4是ALV质粒样品峰型化熔解曲线 图5是ALV质粒样品差异化熔解曲线 图6是ALV临床样品cDNA标准化熔解曲线 图7是ALV临床样品cDNA峰型化熔解曲线 图8是ALV临床样品cDNA差异化熔解曲线图。
具体实施例方式
下面结合实施例，进一步说明本发明。禽白血病病毒RNA的提取:
用试剂盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0提取病料样品中的禽白血病病毒RNA。病料样品可以是全血、血浆、蛋清、泄殖腔拭子等易于获得且对动物体无严重伤害的样品，病料样品还可以是组织样本，如脾脏、胸腺等。禽白血病病毒RNA的反转录:
用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒对禽白血病病毒RNA进行反转录(为了进一步保证后续HRM分析，简化结果的对比分析，可用核酸蛋白分析仪测定反转录得到的cDNA浓度，使PCR起始模板浓度相对一致)。反转录的具体操作 为:
取2支PCR管分别加入2 μ L RNA然后用高压灭菌水补齐到11 μ L，一支管加入2 μ L引物Ρ2，另一支管加入2yL引物Ρ4各构成13yL体系，70°C IOmin0取出冰上急冻2min ;;配制反转录体系，每管中加入
权利要求
1.鉴别不同亚型禽白血病病毒的引物，包括两对引物，分别为通用引用引物Pl和P2(扩增A、B、C、D和E亚型)，以及J亚型特异引物P3和P4，其中:Pl:CCTTGCTGCCAACGACACTTA (SEQ ID NO:1)P2:GAACCTARCAGYTGTAGTC (SEQ ID NO:2)P3:CAGGAAACGTGTGGGTCACC (SEQ ID NO:3)P4:TTATTGGACTTACCATCG (SEQ ID NO:4)。
2.一种快速鉴 别不同亚型禽白血病病毒的方法，包括如下步骤: 1)从样品中提取病毒RNA，并反转录为cDNA； 2)以cDNA为模板，加入上述扩增引物对和荧光饱和染料进行扩增； 3)对扩增产物进行HRM分析，确定病毒的亚型； 其中，所使用的引物如权利要求1所述。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:通用引物扩增的反应体系为: ddH20 2.4 μ 1 Premix Taq 5 μ 1 上游引物(PD 0.4μ 1 下游引物(Ρ2) 0.4μ 1 模板0.8 μ I LC green 染料 I μ 1 Total 10 μ 1
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:J亚型特异引物扩增的反应体系为: ddH20 2.4 μ 1 Premix Taq 5 μ 1 上游引物(Ρ3) 0.4μ 1 下游引物(Ρ4) 0.4μ1 模板0.8 μ I LC green 染料 1 μ 1 Total 10 μ 1
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:扩增的反应程序为: 94°C预变性5min ； 94°C变性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s ;循环35次； 72°C终延伸8min。
全文摘要
本发明公开了一种快速鉴别诊断不同血清型禽白血病病毒PCR-HRM分析方法的建立。本发明的通用引物，简并性好，对禽白血病病毒A、B、C、D和E亚型均有很好地的扩增性，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间；本发明的特异性引物，特异性好，可以特异性扩增出J亚型。对使用本发明引物得到的扩增产物进行HRM分析，与已知亚型的标准HRM曲线进行比对，就可以准确、快速、高通量地进行禽白血病病毒分型，特别是可以快速、准确地区分内源型和外源型禽白血病病毒。
文档编号C12Q1/70GK103074447SQ20131001204
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月11日 优先权日2013年1月11日
发明者郭鹏举, 张建峰, 张春红, 嘎利兵嘎 申请人:广东省农业科学院动物卫生研究所