专利名称：利用生物质制备乙醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种在以生物质作为原料利用同步糖化发酵制备乙醇的方法中，通过原料的混合使用降低发酵用微生物的初期使用量的技术。
背景技术：
近年来，作为化石燃料的替代品，被认为有助于抑制温室气体产生的生物燃料受到瞩目。其中，生物乙醇在碳平衡的思想下，以巴西、美国等为代表，其在世界上的生产量不断增加。另一方面，来自食物的生物乙醇，因其在原料生产时使用很多能量，因此在能否降低温室气体、与粮食的竞争导致粮食价格的上涨问题、伴随新开垦农用地带来的环境进一步恶化等方面令人担心，作为不与粮食竞争的已有生物质的应用，林中残木或农作物的不可食部分、稻杆等农业残渣之类的纤维素类生物质的应用被人们寄予希望。这种纤维素类生物质，全纤维素占到该有机物组成的一半以上，因其结构单元为单糖，因此人们正在研究将其分解并进行能量转换。对这种纤维素类生物质，人们尝试使用酸或碱的化学处理、施加热或压力的物理处理或基于酶的水解，此外，也在研究同时使用这些方法。特别地，对环境负荷小，几乎没有副产物生成的酶糖化法是有效的方法之一。在进行纤维素类生物质的酶糖化，作为乙醇制备原料的情况下，大致分为在糖化后发酵糖化液的糖化后发酵方法，以及同时进行糖化和发酵的同步糖化发酵(simultaneous saccharification and fermentation,以下称为 SSF)的两种方法。选择糖化后发酵的情况下，如果想要在乙醇发酵后进行蒸馏，则要考虑蒸馏时的能量损失，可考虑制备来自高浓度原料的糖化液或者浓缩来自低浓度原料的糖化液两种方法。前者通过酶的竞争性抑制(生成物抑制)导致酶活性慢慢降低，而后者在糖液的浓缩上需要很多能量。作为能够解决对于这种高浓度原料的问题的方法，近年来特别是SSF作为有效的方法之一被人们所认识。SSF反应除原料以外，至少还需要发酵用微生物和水解酶，通过其量的平衡能够实现有效反应。以纤维素类生物质作为原料进行SSF反应时，添加作为水解纤维素的酶的纤维素酶，作为发酵用微生物使用酵母或发酵单胞菌属菌等，由水解得到的糖转换为乙醇。目前，纤维素酶的价格高，需要降低成本，但另一方面，酵母等微生物在反应中也需要很多的量。例如，在非专利文献I中，在IOOml的SSF反应中，将8g的玉米秸杆用作原料，添加各种营养盐后，使用Ig干酵母进行反应，最大可以得到27.8g/l的乙醇浓度，但为了生产此时使用的Ig干酵母，通常置于托盘的酵母培养液至少需要25ml左右以上，且必须进行SSF反应的至少1/4以上规模的预培养。另一方面，在非专利文献2中有每单位干重使用0.5g/l的酵母的报道。此外，在专利文献I中所研究的SSF (并行复发酵)开始时的酵母使用量为配制成0D600nm=2的浊度，可认为其使用量为0.5^2g/l左右。若至少生成因竞争性抑制导致活性降低程度的糖，则SSF反应的优势会被抑制，因此，为了维持作为所使用的酶活性的水解能力，可认为SSF反应时所需要的酵母量需要添加得多一些。在基于目前已工业化的分批发酵进行的乙醇发酵反应中，每单位反应容量、每单位时间所生成的乙醇量为1.3 1.5g/l/h (非专利文献3)，两天后可以制备60-70g/l的乙醇，但这种情况需要容量为发酵槽的数分之一的预培养槽，并且预培养需要大量的培养基和营养成分。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2011-004730号公报非专利文献非专利文献1:Fuel Processing Technology(染料加工技术),第90卷,第10期，2009 年 10 月，第 1193-1197 页。非专利文献2:Bioresource Technology (生物资源技术),第101卷,第9期,2010年5月，第3126-3131页。非专利文献3:乙醇手册第9版(1997)、发酵手册200
发明内容
通过SSF反应，在使用纤维素类生物质制备乙醇中，酵母的使用量成为高成本的原因，但减少使用量则无法实现稳定的反应，也会引起酶的使用量增加。在实际研究中的酵母使用量，需要以SSF反应槽的数分之一的容量进行预培养，在预培养成本及设备负担方面成为问题，甚至很可能成为普及利用发酵制备生物乙醇的阻碍。本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供一种乙醇的制备方法，该方法能够减少发酵用微生物的初期使用量，并且能够实现稳定的反应。本发明人进行了深入研究，结果发现通过将纤维素类生物质与有机性废弃物一起进行同步糖化发酵反应，可以解决上述技术问题，从而完成本发明。即，本发明涉及:(I) 一种制备乙醇的方法，其将纤维素类生物质用水解酶和作为发酵微生物的酵母，通过同时反应的同步糖化发酵反应制备乙醇，其特征在于，将该纤维素类生物质与有机性废弃物一起进行同步糖化发酵反应，所述有机性废弃物由厨房垃圾、食品废弃物、农产废弃物、畜产废弃物、下水污泥、有机性污泥中的一种以上构成；每个反应槽的酵母初期添加量以干重计为0.125 0.0025g/kg。(2)根据上述(I)所述的方法，其特征在于，同步糖化发酵反应时的所述纤维素类生物质的浓度为总反应量的10 25%。本发明将纤维素类生物质与有机性废弃物一起进行同步糖化发酵反应，所述有机性废弃物由厨房垃圾、食品废弃物、农产废弃物、畜产废弃物、下水污泥、有机性污泥中的一种以上构成，每个反应槽的酵母初期添加量以干重计为0.125^0.0025g/kg。如此，本发明能够减少发酵用微生物的初期使用量，而且能够实现稳定的反应。
图1是表示比较例I的结果的图表。图2是表示实施例1的结果的图表。图3是表示在实施例2中，通过SSF反应得到的乙醇浓度的结果的图表。图4是表示实施例2中，反应中的CFU的推移的图表。图5是表示根据本发明得到的效果的图表。
具体实施例方式
下面，对本发明进行详细的说明。本发明中的纤维素类生物质，只要其生物质的构成成分中全纤维素含量占据主要，则没有特别限定，例如，废材、锯末、修剪下的树枝、纸、纸屑、造纸浆、藻类、草本类、棉类、布类等，或它们的混合物。此外，与纤维素类生物质一起作为同步糖化发酵原料的有机性废弃物，只要是不与食物竞争，且含有酵母增殖所必需的成分，则没有特别限定，例如，可以由厨房垃圾、食品废弃物、农产废弃物、畜产废弃物、下水污泥、有机性污泥中的一种以上构成。有机性废弃物与纤维素类生物质的比例，以干重比计，优选为10飞0%。用于进行SSF反应时的水解酶，由于以纤维素类生物质作为原料，因而纤维素酶是必须为，并且，还可以添加木聚糖酶、半乳糖苷酶、甘露糖苷酶等其他糖链的水解酶。此夕卜，通过添加至少一种以上淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等水解酶作为水解一起用作原料的厨房垃圾、食品废弃物、农产废弃 物、畜产废弃物、下水污泥、有机性污泥的酶，能够促进反应的进行。这些原料在用于SSF反应之前，为了更好地进行反应，也可以实施预处理。作为这些预处理，有细化、破碎、加压、加热、药剂处理、pH调节、浓度调整、脱水、加水、腐化、混合等，或它们的复合处理，但没有特别限定。本发明中，关于将混合的生物质用作原料的情况下的SSF反应所需要的酵母量，可以在每单位反应量的酵母干重为0.125g/kg以下进行反应，可以在0.0025g/kg以上的量进行反应。将其换算成浊度，在用约0D600nm测量的情况下，虽然根据所使用的酵母不同而不同，但最大为0.1以下。用于通常分批发酵的菌体量为数g/1，鉴于研究报告进行的SSF反应所使用的酵母量的下限为0.5g/kg左右，酵母的使用量为从数分之一到数百分之一的使用量。进行SSF反应时的原料浓度虽然没有特别限定，但因为以生物质作为原料，因此不能从原料100%转换成乙醇，考虑到抑制后续阶段的蒸馏中的能量损失，纤维素类生物质的浓度为总反应量的1(T25%的浓度，即优选含水率为75、0%。通过抑制由酶带来的竞争性抑制来维持酶活性从而降低酶的成本是SSF反应的最大优点，但考虑到即使延长反应时间也能够降低酶的成本，且延长酵母的增殖时间才更有可能实现稳定的SSF反应，因而，虽然SSF反应时间没有特别限定，但优选进行2天以上。用于通常分批发酵的酵母菌体量至少为数g/1，鉴于研究报告进行的SSF反应所使用的酵母量的下限为0.5g/kg左右，则本发明的每单位反应量的酵母干重为0.125g/kg以下这一使用量为酵母培养基成本的数分之一到数百分之一以下。
通常来说，酵母从平皿培养经烧瓶培养，以每次约10倍的规模(scale)进行预培养。因此，通过本发明可以实现省略最大的预培养设备，减少冷藏保存时的保存地点及保存设施。此时，通过添加作为本发明要素的纤维素类生物质和与之一起反应的有机性废弃物的混合原料、酵母及酶而开始SSF反应，由于减少了酵母的添加量，从反应刚开始起，主要使用来自有机性废弃物的营养盐和由酶水解得到的结构糖，引发增殖直至对SSF反应充分的量，因此可以降低酵母量。因此，虽然由于增殖所需要的能量，即原本应转换成乙醇的糖类被消耗，导致乙醇的生成量降低，但作为实际的效果确认是增加的。仅将不适于增殖的条件下的纤维素类生物质用作原料时，如果初期不使用大量酵母引发SSF反应，则由于酶的竞争性抑制SSF反应的进行受到抑制，为了在SSF反应期间维持该程度的大量存在的酵母，将消耗卡路里，因而不会转换成乙醇。如此，在本发明中所减少的酵母使用量还具有回收由过量菌体消耗的能量的效果。图5用图表中的网状部分表示了这种回收的能量。此外，在SSF反应后残 存有很多的酵母，因此在再利用反应液时，可以减少或省略酵母的再次添加量。下面，通过实施例更具体地说明本发明。实施例比较例I用手进行分类，从普通的废弃物中挑选出纸类，进行制浆(离解)处理。用过滤网除去得到的浆中的异物后，用螺旋压榨机脱水，将脱水后的纸浆作为纤维素类生物质。得到的纸浆的全纤维素含量约为85%。将制得的纸浆配制成10%重量浓度的浆料后，使水解酶和酵母同时作用，进行同步糖化发酵反应。水解酶使用杰能科公司生产的Axel race，酵母使用量在0.125^2.5g-干/kg-反应量的范围内，在38°C下进行SSF反应。取样后，在沸水中进行失活处理，通过生物传感器(王子测量机生产的BF-5)对离心后的上清液分析乙醇浓度。其结果示于图1中。仅将纸浆用作原料的情况下，依赖于酵母使用量的乙醇生成量增加，为了稳定及有效进行SSF反应大约需要Ig-干/kg左右以上的酵母使用量。实施例1从一般废弃物中用手进行分类，细分出厨房垃圾，然后再用搅拌机将细分出的厨房垃圾与所述纸浆混合，进行SSF反应。将纸浆及厨房垃圾分别以15%及10%的重量比进行混合，将其用作混合原料，使水解酶和酵母同时作用，在38°C下进行同步糖化发酵反应。水解酶使用杰能科公司生产的Axel race和诺维信公司制造的Spirizyme,酵母的使用量在0.0025^2.5g-干/kg-反应量的范围。取样后，在沸水中进行处理，通过生物传感器(王子测量机生产的BF-5)对离心后的上清液分析乙醇浓度。其结果示于图2中。与比较例I所示的只有纸浆的原料下所需要的酵母使用量Ig-干/kg相比，即使使用量为其百分之一，反应也在进行，并且结果为酵母的使用量少的
一方得到乙醇量多。因此，通过在纤维素类生物质的纸类中混合厨房垃圾得到的混合原料的SSF反应，能够减少酵母的使用量，且能够确认其减少率最大为数百分之一以下。
此外，通过以减少了的酵母使用量进行反应，还表现出乙醇的生成量增加。实施例2对下列四组情况在与实施例1相同的条件下进行SSF反应，即，在只有纸浆的原料中使用充分的酵母量(1.25g/kg)的情况；在只有纸浆的原料中使用少量的酵母使用量(0.025g/kg)的情况；在含有十分之一厨房垃圾的混合原料中使用充分的酵母使用量(0.025g/kg)的情况；以及，在含有十分之二厨房垃圾的混合原料中使用充分的酵母使用量(0.025g/kg)的情况。取样后，在沸水中进行处理，通过生物传感器(王子测量机生产的BF-5)对离心后的上清液分析乙醇浓度。此外，另行取样，稀释成IO2IO4后接种到YPD (2%葡萄糖)平皿上，在30°C下培养后，通过计数酵母菌落数量，调查CFU (菌落形成单位)。将通过SSF反应得到的乙醇浓度的结果示于图3中，反应中的CFU的推移示于图4中。在仅以纸浆作为原料的情况下，与使用了充分的酵母量(1.25g/kg)的SSF反应相t匕，在只使用了 1/50的少量酵母使用量(0.025g/kg)的SSF反应中，乙醇的生成量明显减少。另一方面，在使用混合了十分之一或十分之二厨房垃圾的原料的SSF反应中，虽然I天后的乙醇量稍少，但在2天以后生成了与仅用纸浆且添加50倍酵母的情况相同的乙醇量。对于CFU的结果，在仅以纸浆作为原料的情况下，当添加充分的酵母量时只是在减少；但在1/50量的条件下，在I天以后一直在增殖。但是，其增殖量与使用等量酵母的厨房垃圾混合原料相比少。
在SSF反应中，随着乙醇的含量增多，对酵母的刺激将增加，并且，由于反应中酶活性的降低和基质的减少，每单位时间水解所生成的糖量减少。因此，随着反应时间的推移，酵母的可繁殖数降低，但在图4中，可以确认在混合原料中维持着活菌数。
权利要求
1.一种制备乙醇的方法，其将纤维素类生物质利用水解酶和作为发酵微生物的酵母，通过同时反应的同步糖化发酵反应制备乙醇，其特征在于， 将该纤维素类生物质与有机性废弃物一起进行同步糖化发酵反应，所述有机性废弃物由厨房垃圾、食品废弃物、农产废弃物、畜产废弃物、下水污泥、有机性污泥中的一种以上构成； 每个反应槽的酵母初期添加量以干重计为0.125 0.0025g/kg。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，同步糖化发酵反应时的所述纤维素类生物质的浓度为总反应量 的10 25%。
全文摘要
本发明提供一种乙醇制备方法，其能够减少发酵用微生物的初期使用量，且能够实现稳定的反应。本发明提供一种制备乙醇的方法，其将纤维素类生物质利用水解酶和作为发酵微生物的酵母，通过同时反应的同步糖化发酵反应制备乙醇，其特征在于，将该纤维素类生物质与有机性废弃物一起进行同步糖化发酵反应，所述有机性废弃物由厨房垃圾、食品废弃物、农产废弃物、畜产废弃物、下水污泥、有机性污泥中的一种以上构成；每个反应槽的酵母初期添加量为0.125~0.0025g/kg。
文档编号C12P19/14GK103205467SQ201310011260
公开日2013年7月17日 申请日期2013年1月11日 优先权日2012年1月13日
发明者林俊介, 增成伸介, 吉良典子 申请人:日立造船株式会社