专利名称：一种dna分子及重组质粒和大肠杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA分子及重组质粒和大肠杆菌。
背景技术：
L-苏氨酸是人体所必需的8种氨基酸之一，广泛应用于医药、食品、饲料等，目前L-苏氨酸主要以微生物发酵的方法生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等。由于大肠杆菌发酵生产L-苏氨酸具有繁殖迅速、发酵温度高、生理生化基础研究较深入的优势，逐渐成为L-苏氨酸生产的常用菌株。随着世界对L-苏氨酸需求量的不断增加，L-苏氨酸高产菌株的研究越来越受到重视。其中，影响大肠杆菌高产的最关键的一个因素就是其耐受L-苏氨酸的能力，只有解除L-苏氨酸对代谢途径的抑制，才能进而增加L-苏氨酸的产量。虽然野生型的大肠杆菌具有表达L-苏氨酸耐受蛋白的基因，但该基因所表达的蛋白量较低，仅为大肠杆菌正常生长所需，并不能耐受大于0.1M浓度的L-苏氨酸，使得野生型的大肠杆菌的产酸能力较低。因此，利用生物技术手段对野生型大肠杆菌进行改造，使其能够具有较高L-苏氨酸耐受能力，对L-苏氨酸的生产具有十分重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种DNA分子及重组质粒和大肠杆菌，使得所述大肠杆菌对L-苏氨酸具有较高的耐受活性。为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案:一种DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明从NCBI数据库获得来自于耶尔森氏菌属-Yersinia enterocoliticasubsp.enterocolitica8081菌株的一段蛋白质序列，长度为206个氨基酸,其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，NCBI蛋白序号为G1:123440599，该蛋白具体功能尚未得到公开确认，而经申请人研究其具有耐受L-苏氨酸的活性，但是表达该蛋白的基因(Gene bank中的编号为FR718698.l，621bp，DNA序列3775-4395)来源于同大肠杆菌种属差异较大的耶尔森氏菌属，其在大肠杆菌中并不能正确表达该蛋白。故本发明按照大肠杆菌W3110密码子的偏好性,优化密码子,通过核酸合成仪合成核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子，测序验证该序列的正确性，合成基因酶切位点为Smal/Hindlll，其中优化、合成工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。本发明还提供一种重组质粒pKR-E，由质粒pKK223-3在其Sma I和HindIII酶切位点间插入如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子获得，经PCR和酶切验证并测序，表明如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子已成功构建至质粒pKK223-3中Sma I和HindIII酶切位点间，其质粒图谱见图1。
本发明还提供一种重组质粒PKTR-E，其由以下方法制备:以重组质粒pKR-E为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示的下游引物扩增，BamHI/SphI双酶切扩增产物，获得由Tac启动子、SEQ ID NO:1 所不核苷酸序列的DNA分子、rrnB TlTerminator 终止子、rrnB Terminator终止子组成的片段，然后与经过BamHI/SphI双酶切的质粒pKK223_3_ThrA’ BC连接即得；其中，所述Tac启动子、rrnB TlTerminator终止子位于片段两端,SEQ ID N0:1所不核苷酸序列的DNA分子位于Tac启动子、rrnB Terminator终止子之间，rrnB Terminator终止子位于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子和rrnB TlTerminator终止子之间。经PCR和酶切验证并测序，表明所述片段已成功构建至质粒pKK223-3-ThrA’BC中BamHI和SphI酶切位点间，其质粒图谱见图2。质粒pKK223_3和pKK223_3_ThrA，BC已在文献“Kwang Ho Lee,Molecular SystemsBiOlOgy3:149，2007”中公开，并可通过市售获得，两者皆为强表达质粒，以两者为基础质粒构建的重组质粒PKR-E和pKTR-E 有助于本发明所述DNA分子在大肠杆菌中的表达。其中，pKR-E带有基础质粒PKK223-3的Tac强启动子，能增加大肠杆菌中所述DNA分子的拷贝数和表达量，并通过基础质粒PKK223-3原有的具有强终止结构的rrnB TlTerminator终止子和rrnB Terminator终止子终止该基因的表达，以防所述DNA分子中TAG终止密码子不能终止基因表达造成的通读。pKTR-E是以pKR-E为模板,将上述带有Tac启动子、rrnB TlTerminator终止子和rrnB Terminator终止子的所述DNA分子克隆到质粒pKK223_3_ThrA’ BC中BamHI和SphI酶切位点间，同样具有上述优势。此外，pKTR-E带有基础质粒pKK223-3-ThrA’BC的定点突变苏氨酸操纵子-ThrA’BC，该操纵子与引入的强Tac启动子可以共同增强所述DNA分子的表达量，有利于改造后的大肠杆菌的L-苏氨酸耐受能力的提高。本发明将重组质粒pKR-E按照本领域常规方法转化到经氯化钙法制备的大肠杆菌W3110感受态细胞中，得到一种能够耐受L-苏氨酸的新型大肠杆菌，命名为MHZ-0212-1，经PCR和酶切验证并测序，表明所述重组质粒pKR-E已成功转入大肠杆菌W3110中，并于2012年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No:6689，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。本发明将重组质粒pKTR-E按照本领域常规方法转化到经氯化钙法制备的大肠杆菌W3110感受态细胞中，得到一种能够耐受L-苏氨酸的新型大肠杆菌，命名为MHZ-0212-2，经PCR和酶切验证并测序，表明所述重组质粒pKTR-E已成功转入大肠杆菌W3110中，并于2012年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No:6690，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。所述大肠杆菌W3110购自于美国模式培养物集存库，商品货号为ATCCaNumber:39936 。将保藏编号为CGMCC No:6689和CGMCC No:6690的大肠杆菌(以下简称为MHZ-0212-1 和 MHZ-0212-2)与分别转入 pKK223_3 和 pKK223_3_ThrA’ BC 的两株大肠杆菌W3110 (以下简称为W3110-pKK和W3110-pKT)进行L-苏氨酸耐受试验，结果表明，MHZ-0212-1和MHZ-0212-2两菌株均可耐受0.8-0.9M的L-苏氨酸，而W3110_pKK和W3110-pKT两菌株在0.1-1.0M范围内均不耐受，表明本发明所述的新型大肠杆菌菌壳耐受较高浓度的L-苏氨酸。此外，将MHZ-0212-1、MHZ-0212-2、W3110-pKK 和 W3110-pKT 分别在相同环境下进行L-苏氨酸发酵试验，结果表明，MHZ-0212-1和MHZ-0212-2两菌株L-苏氨酸产量分别为
0.51g/L、2.06g/L,而W3110-pKK和W3110-pKTL_苏氨酸产量分别为0、0.9g/L，本发明所述新型大肠杆菌L-苏氨酸产量均高于各自的对照菌株，表明其可以应用于L-苏氨酸发酵中。由以上技术方案可知,本发明以一段功能未知的蛋白序列为参照，优化并合成一段新DNA序列，并克隆至强表达载体pKK223-3和pKK223_3_ThrA’ BC中，转化到大肠杆菌W3110中得到两株具有高L-苏氨酸耐受活性的新型大肠杆菌，能够应用于L-苏氨酸的发酵中。生物材料保藏信息说明:1、MHZ-0212-1大肠杆菌，已于2012年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No:6689，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。2、MHZ-0212-2大肠杆菌，已于2012年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No:6690，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。
:图1示本发明所述重组质粒pKR-E质粒图谱；图2示本发明所述重组质粒pKTR-E质粒图谱；图3示本发明所述重组质粒pKR-E和pKTR_E的电泳鉴定图；其中，最右侧为Marker,从上之下依次为 8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;中间泳道条带为pKTR-E双酶切产物的两条条带，从上至下依次为5201bp、4824bp ;最左侧泳道条带为pKR-E双酶切产物的两条条带，从上至下依次为 4296bp、893bp。
具体实施方式
:本发明公开了一种DNA分子及重组质粒和大肠杆菌，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的DNA分子、重组质粒、大肠杆菌已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明。其中，实施例部分如未说明，则所有分子克隆、转化等生物技术方法均参照《分子克隆试验指南》(J.萨姆布鲁克等著，科学出版社出版，第三版)。实施例1:本发明所述DNA分子的优化和合成本发明从NCBI数据库获得来自于耶尔森氏菌属-Yersinia enterocoliticasubsp.enterocolitica8 081的一段蛋白质序列，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所不，NCBI蛋白序号为G1:123440599。本发明按照大肠杆菌W3110密码子的偏好性，优化密码子，通过核酸合成仪合成核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子，测序验证该序列的正确性，合成基因酶切位点为Smal/Hindlll。以Smal/Hindlll为插入位点，将其克隆到高拷贝质粒载体PUC57上，以大肠杆菌DH5 a为受体菌株进行扩增。
其中优化、合成工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。实施例2:构建重组质粒pKR-E提取上述大肠杆菌DH5 a中pUC57质粒，Smal/Hindlll双酶切，50 体系，Tbuffer+BSA,酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，待合适时间取下凝胶，切胶回收目的基因片段，取3iU与已制作好的同样用Smal/Hindlll双酶切的pKK223_3质粒I y I混合，力口入高效连接酶4iU制作8iU的连接体系。16°C过夜连接，次日转化已制作好的大肠杆菌Trans Tl感受态细胞，终浓度100 U g/ml氨苄青霉素LB平板筛选，培养20h后挑单菌落，提质粒用使用HindIII和BamHI双酶切验证，见图3。结果表明，已将所述DNA分子构建至PKK223-3，形成新重组质粒pKR-E，质粒图谱见图1。由图3可知，质粒转化大肠杆菌能够提出质粒，酶切条带位置正确、大小正确，且测序结果与所述DNA分子序列一致，说明该质粒已经构建成功。实施例3:构建重组质粒pKTR-E 提取实施例2中大肠杆菌中的质粒pKR-E做模板，以序列表中SEQID N0:2和SEQ ID N0:3所示引物，扩增目的基因片段，该片段带有pKTR-E上的一段源于基础质粒pKK223_3 的 Tac 启动子序列和 rrnB Tl Terminator>rrnB Terminator 终止子序列。BamHI/SphI酶切扩增产物，取3 u I与已制作好的同样用BamHI/SphI双酶切的pKK223_3_thrA’BC质粒Iyl混合，加入高效连接酶4 ii I制作8iU的连接体系。16°C过夜连接，次日转化已制作好的大肠杆菌Trans Tl感受态细胞，终浓度100 u g/ml氨苄青霉素LB平板筛选，培养20h后挑单菌落，提质粒HindIII酶切验证，见图3。结果表明，已将所述片段构建至pKK223-3-thrA’ BC，形成新重组质粒pKTR-E，质粒图谱见图2。由图3可知，质粒转化大肠杆菌能够提出质粒，酶切条带位置正确、大小正确，且测序结果与所述DNA分子序列一致，说明该质粒已经构建成功。实施例4:转化重组质粒pKR-E至大肠杆菌W3110氯化钙法制备大肠杆菌W3110感受态细胞，从实施例2中的大肠杆菌Trans Tl感受态细胞中提取质粒PKR-E，转化W3110菌株，氨苄青霉素浓度100 u g/ml浓度平板筛选，得到MHZ-0212-1大肠杆菌。经PCR和酶切验证并测序，表明所述重组质粒pKR-E已成功转入大肠杆菌W3110中，并于2012年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No:6689，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。实施例5:转化重组质粒pKTR-E至大肠杆菌W3110氯化钙法制备大肠杆菌W3110感受态细胞，从实施例3中的大肠杆菌Trans Tl感受态细胞中提取质粒PKTR-E，转化W3110菌株，氨苄青霉素浓度100 u g/ml浓度平板筛选，得到MHZ-0212-2大肠杆菌。经PCR和酶切验证并测序，表明所述重组质粒pKTR-E已成功转入大肠杆菌W3110中，并于2012年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No:6690，分类命名为大肠埃希氏菌，Escherichia, coli。实施例6:L-苏氨酸耐受试验参照实施例4或实施例5的方法，将质粒pKK223-3和质粒pKK223-3_thrA’ BC分别转化到大肠杆菌W3110中，得到W3110-pKK和W3110-pKT大肠杆菌。
按照《分子克隆试验指南》配制1.5%琼脂的M9基本培养基，115°C灭菌20min，分别配制成含 0、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1.0M 的 L-苏氨酸的培养基，待冷却到60 °C左右，加入100mg/ml氨苄青霉素使终浓度100 y g/ml，IM的IPTG0.1 u 1/ml，倒平板。菌株培养过夜，稀释10000倍取100 Ul涂布平板，每12h观察生长状况，培养96h菌落生长情况结果见表I。表I各菌种L-苏氨酸耐受试验结果
权利要求
1.一种DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种重组质粒pKR-E，其特征在于，由质粒pKK223-3在其Sma I和Hindi II酶切位点间插入如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子获得。
3.—种重组质粒pKTR-E，其特征在于，由以下方法制备: 以重组质粒PKR-E为模板，用核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的下游引物扩增，BamHI/SphI双酶切扩增产物，获得由Tac启动子、SEQ ID NO:1 所不核苷酸序列的 DNA 分子、rrnB TlTerminator 终止子、rrnB Terminator终止子组成的片段，然后与经过BamHI/SphI双酶切的质粒pKK223_3_ThrA’ BC连接即得； 其中，所述Tac启动子、rrnB TlTerminator终止子位于片段两端,SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子位于Tac启动子、rrnB Terminator终止子之间，rrnB Terminator终止子位于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子和rrnB TlTerminator终止子之间。
4.一种大肠杆菌，其保藏编号为CGMCC No:6689，由重组质粒pKR-E转化大肠杆菌W3110获得。
5.一种大肠杆菌，其保藏编号为CGMCC No:6690,由重组质粒pKTR-E转化大肠杆菌W3110获得。
6.保藏编号为CGMCCNo:6689的大肠杆菌在L-苏氨酸发酵中的应用。
7.保藏编号为CGMCCNo:6690的大肠杆菌在L-苏氨酸发酵中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子，以及由质粒pKK223-3在其SmaⅠ和HindIⅡ酶切位点间插入所述DNA分子获得的重组质粒pKR-E和由质粒pKK223-3-ThrA’BC在其BamHI和SphI酶切位点间插入由Tac启动子、所述DNA分子、rrnB T1 Terminator和rrnB Terminator终止子组成的片段获得的重组质粒pKTR-E。将本发明所述重组质粒转入W3110大肠杆菌中获得两株具有高L-苏氨酸耐受活性的菌种，能够应用于L-苏氨酸的发酵中。
文档编号C12N15/70GK103103201SQ20131001162
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月11日 优先权日2013年1月11日
发明者李岩, 宫卫波, 王秋岩, 胡炎华, 胡征宇 申请人:新疆梅花氨基酸有限责任公司