专利名称：利用代谢轮廓分析提高雷帕霉素产量的优化发酵培养基的方法
技术领域：
本发明属于代谢轮廓分析指导发酵优化技术领域，特别涉及代谢轮廓方法动态分析胞内影响雷帕霉素合成的关键代谢物，理性指导高产雷帕霉素发酵培养基的添加优化。
背景技术：
雷帕霉素是Streptomyces hygroscopicus合成的、ー种重要的天然内酯类化合物，它具有多种生物活性，如抗真菌、免疫抑制活性、抗肿瘤活性、神经保护(Steiner etal.1997)和抗衰老。特别是雷帕霉素具有的强效免疫抑制活性，临床上已被批准用于治疗器官移植抗排斥反应和自身免疫疾病的治疗。此外雷帕霉素的半合成衍生物temsiroI imus和everolimus也被批准临床上用于治疗晚期肾癌。由于雷帕霉素具有的重要药用价值和生物活性，其生物合成途径和调控机制也逐渐的被深入研究。野生型吸水链霉菌中雷帕霉素的产量比较低，因此，对于雷帕霉素的エ业化生产和临床应用，吸水链霉菌中雷帕霉素效价的进ー步提高和雷帕霉素各种衍生物的合成势在必行。发酵培养基优化是提高抗生素发酵水平的一种有效方法，其中Lee et al.通过单因素试验对Streptomyces hygroscopicus C9发酵培养氮源进行优化后雷帕霉素产量由93mg/L提高至125mg/L，比优化前提高了 30%多；Cheng et al.通过对发酵培养基优化使雷帕霉素产量由18mg/L提高到97mg/L ;Sallam et al.通过单因素实验方法对雷帕霉素生产菌株Streptomyces hygroscopicus ATCC29253的最佳生产条件进行了优化,雷帕霉素产量从10.66mg/L提高到41.46mg/L。这些利用单因素或者响应面方法进行的发酵培养基优化侧重于培养基成分和其配比的改变。而发酵培养基成分的变化对菌体胞内代谢具有复杂的影响，并且培养基优化引起的菌体胞内代谢行为的改变还没有被深入研究。在微生物中，初级代谢物水平变化直接影响抗生素前体的供应以及抗生素的合成。作为次级代谢物，雷帕霉素具有复杂的生物合成途径，其直接生物合成前体包括(4R，5R) -4, 5-dihydroxycyclohex-l-enecarboxylic acid (DHCHC)、哌唳酸、7 个丙ニ酸辅酶 A 和7个甲基丙ニ酰辅酶A，并且这些直接前体的生物合成涉及多种初级代谢途径，如糖代谢、三羧酸循环、脂肪酸代谢、莽草酸代谢、氨基酸代谢等。涉及这些代谢途径的胞内代谢物动态变化对于深入理解影响雷帕霉素合成的胞内关键因素至关重要。代谢组学作为ー个強大的工具通过综合分析生物样品中代谢信息，能够测定和评价生物系统受外界或内部扰动后的胞内动态多參数代谢响应。Korneli 等(Korneli C, Bolten CJ, Godard T, Franco-LaraE, Wittmann C(2012)Debottlenecking recombinant protein production in Bacillusmegaterium under large-scale conditions—targeted precursor feeding designedfrom metabolomics.Biotechnol Bioengl09:1538 - 1550)利用代谢组学手段研究大规模条件下巨大芽孢杆菌生产绿色荧光蛋白的瓶颈，通过流加氨基酸前体使绿色荧光蛋白产量提高了 100%。Lu 等(Lu S，Wang J, Niu Y, Yang J, Zhou J, Yuan Y (2012)Metabolicprofiling reveals growth related FAME productivity and quality of Chlorellasorokiniana with different inoculum sizes.Biotechnol Bioengl09:1651 - 1662)利用代谢轮廓分析方法研究不同接种量对小球藻生产脂肪酸甲酯产量和质量的影响，发现光强度是其中限制高接种量条件下脂肪酸甲酯产量的关键因素。然而，到目前为止，采用代谢轮廓分析，动态检测胞内代谢物变化，考察发酵培养基成分的改变对Streptomyceshygroscopicus初级代谢物水平和雷帕霉素的合成的影响,分析限制雷帕霉素合成的胞内关键代谢物，进而理性指导雷帕霉素发酵培养基优化的研究还没有被报道。
发明内容
本发明之目的是利用动态检测和气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)为基础的代谢轮廓分析方法，通过动态检测吸水链霉菌胞内代谢物变化，考察发酵培养基成分改变(发酵培养基Ml为初始培养基，发酵培养基M2为Ml经过响应面优化得到)引起的胞内代谢物代谢水平差异，分析菌体胞内代谢与雷帕霉素合成的相关性，鉴定影响雷帕霉素生物合成的胞内关键化合物，结合相关途径及雷帕霉素生物合成途径对影响雷帕霉素合成的胞内关键化合物动态变化进行分析，针对限制雷帕霉素合成的关键因素对M2培养基提出了进ー步的动态添加措施，从而获得最优化培养基M3，以进ー步提高雷帕霉素产量。提出了利用代谢轮廓分析提高雷帕霉素产量的优化发酵培养基的方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的:设定发酵培养基Ml为初始培养基，简称Ml ;发酵培养基M2为Ml经过响应面优化得到，简称M2:步骤如下:I)Ml、M2培养条件下吸水链霉菌发酵特性变化:对发酵培养基Ml、M2两种培养条件下雷帕霉素产量、菌体生物量、发酵液PH值和发酵液总糖含量进行动态检测；根据吸水链霉菌在Ml和M2培养基培养条件下的雷帕霉素生物合成曲线确定代谢轮廓研究的取样点，在两种条件下雷帕霉素产量具有显著差异的时间段进行取样。2)对Ml和M2培养条件下菌体胞内辅酶A类化合物进行提取，采用高效液相色谱-电喷射离子源-质谱/质谱联用仪(LC-EIS-MS/MS)检测，与标准辅酶A类化合物离子片段进行比对分析，对Ml和M2培养条件下菌体胞内辅酶A类化合物进行定量。3)利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测Ml和M2培养条件下菌体胞内代谢物，利用Masslynx software对质谱峰进行识别及定量化,通过把姆种化合物的质谱片段与NIST质谱库进行对比，对每种代谢物进行鉴定。4)利用SIMCA-P Demo软件对GC-MS所检测胞内化合物以及雷帕霉素产量数据进行偏最小二乗法分析，研究Ml和M2培养基培养条件下菌体初级代谢与雷帕霉素合成的相关性，鉴定出对两种条件下菌体代谢差异和雷帕霉素产量具有显著贡献(VIP>1)的化合物，并确定这些化合物涉及的代谢途径。5)对步骤2)胞内辅酶A化合物和步骤4)确定的化合物动态变化进行对比分析，研究M2培养条件下雷帕霉素产量高于Ml的胞内关键因素，进而针对这些胞内关键因素对雷帕霉素发酵培养基提出改进措施，得到最优化发酵培养基M3，理性指导雷帕霉素发酵培
养基优化。
依据上述技术方案，在吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus U1-6E7,保藏中国普通微生物菌种保藏管理中心菌株编号:CGMCC6988中，初始发酵培养基Ml (40g/L葡萄糖、20g/L甘露醇、45g/L黄豆饼粉、0.3g/L硫酸铵、0.3g/L K2HPO4),响应面优化发酵培养基M2 (30g/L葡萄糖、30g/L甘露醇、40g/L黄豆饼粉、0.5g/L硫酸铵、0.lg/L K2HPO4)条件下进行了雷帕霉素发酵培养基优化研究。具体过程如下:I)根据Ml和M2条件下雷帕霉素生物合成曲线，确定组学研究的取样点为48h、72h、96h 和 120h。；2) LC-EIS-MS/MS检测Ml和M2条件下菌体胞内辅酶类A类化合物，根据辅酶类A类化合物标准品色谱图，确定菌体胞内辅酶类A类化合物浓度。3) GC-MS检测Ml和M2条件下菌体胞内代谢物，共定量检测出91种化合物，其中79种被鉴定，包括34种有机酸、20种氨基酸、13种糖类、4种胺类、5种其他，12种未被鉴定。4)PLS分析表明菌体代谢与雷帕霉素合成具有相关性，鉴定了 16种影响雷帕霉素合成的胞内关键化合物，这些化合物主要涉及三羧酸循环(TCA)、脂肪酸代谢、莽草酸代谢和氨基酸代谢。5)结合雷帕霉素生物合成途径以及TCA循环、脂肪酸代谢、莽草酸代谢和氨基酸代谢，对影响雷帕霉素合成的胞内关键化合物的动态变化进行分析，理性指导培养基优化。在M2发酵培养基的基础上，发酵Oh添加1.0g/L油酸甲酷，12h添加1.0g/L赖氨酸，24h添加0.5g/L莽草酸,36h添加0.5g/L琥拍酸钠、0.lg/L苯丙氨酸、0.lg/L色氨酸和0.lg/L酪氨酸，最终获得最优化培养基M3，雷帕霉素产量达到了 307mg/L，比M2提高了 56.6%。本发明利用动态 检测和代谢轮廓分析方法，用于指导高产雷帕霉素发酵培养基优化，通过考察两种发酵培养基条件下引起的胞内小分子代谢物代谢水平差异，分析两种条件下胞内代谢与雷帕霉素合成的相关性，结合相关代谢途径对两种培养条件下胞内小分子代谢物动态变化进行分析，掲示限制雷帕霉素合成的小分子代谢物，并分析其不足，理性提出进ー步的动态添加措施，为提高雷帕霉素产量提供了一个新的思路。
图1:M2、Ml培养条件下雷帕霉素产量、菌体生物量、PH值动和发酵液总糖态变化图。图2:基于M2、M1培养条件下的菌体代谢轮廓和雷帕霉素产量的PLS模型，模型參数R2⑴为0.603、R2⑴为0.987、Q2为0.978。a:PLS得分图t[l]/u[l]掲示了两种培养条件下菌体代谢的差异性以及代谢物轮廓(tl)和雷帕霉素产量(ul)之间的相关性。b:由代谢数据得出的PLS模型VIP图。图3:不同浓度的外源添加物添加效果。图4:培养基添加措施对雷帕霉素产量及发酵副产物的影响。
具体实施例方式下面根据本发明的方法，结合具体的实施例对本发明做进ー步说明:步骤1:我们采用的的吸水链霉菌为Streptomyces hygroscopicus U1-6E7。保藏中国普通微生物菌种保藏管理中心菌株编号:CGMCC6988。选用的发酵培养基Ml的成分及含量为:40g/L葡萄糖、20g/L甘露醇、45g/L黄豆饼粉、0.3g/L硫酸铵、0.3g/LK2HP04 ;利用响应面方法对初始发酵培养基Ml进行优化，获得了优化发酵培养基M2。发酵培养基M2的成分及含量为:30g/L葡萄糖、30g/L甘露醇、40g/L黄豆饼粉、0.5g/L硫酸铵、0.lg/L K2HP04。对M2、Ml两种培养条件下雷帕霉素合成量、菌体生物量、发酵液PH值及发酵液总糖含量进行动态检测，其结果如图1.所示。S.hygroscopicus U1-6E7在发酵培养基M2中具有明显的发酵优势，雷帕霉素产量提高了 39%，达到196mg/L。其中M2条件下的雷帕霉素的合成速率明显大于M1，根据Ml、M2培养条件下雷帕霉素合成曲线，在两种条件下雷帕霉素合成开始产生明显差异(>15mg/L)和雷帕霉素大量合成期进行代谢轮廓分析研究取样，取样点设为48h、72h、96h 和 120h。步骤2:菌体内辅酶A类化合物的提取，即首先用含有硅油(AR200:DC200，4:1，8=1.010)对发酵液中菌体进行萃取，萃取的菌体用15% (w/v)三氯こ酸悬浮悬浮，然后20000转离心15mint)60%的菌体萃取到三氯こ酸溶液中，利用OASIS HLB SPE试剂盒对三氯こ酸菌体萃取液进行真空过滤，之后利用0.15%三氯こ酸溶液和正己烷洗涤试剂盒，最后用甲醇氢氧化铵(99:1，v/v)溶解提取菌体内辅酶A类化合物，获得细胞内辅酶A类化合物溶液。取80 ii L辅酶A类化合物溶液进行高效液相色谱-电喷射离子源-质谱/质谱联用仪(LC-EIS-MS/MS,ffaters/Micromass, Manchester, UK)。通过辅酶A标准品的高效液相色谱_电喷射离子源-质谱/质谱(LC-EIS-MS/MS)图比对，检测色谱碎片中辅酶A化合物母离子向子离子的转化(m/zparent>m/z daughter),结果是:こ酰辅酶 A, 810>303;丙酰辅酶 A, 824>317;异丁酰辅酶A，841>334;丙ニ酰辅酶A，854>347;甲基丙ニ酰辅酶A和琥珀酰辅酶A，868>361。与标准品辅酶A化合物离子碎片，所检测到的胞内辅酶A化合物的浓度如表I所示。表权利要求
1.用代谢轮廓分析提高雷帕霉素产量的优化发酵培养基的方法，设定发酵培养基Ml为初始培养基，简称Ml ;发酵培养基M2为Ml经过响应面优化得到，简称M2:其特征是步骤如下: 1)Ml、M2培养条件下吸水链霉菌发酵特性变化:对发酵培养基Ml、M2两种培养条件下雷帕霉素产量、菌体生物量、发酵液PH值和发酵液总糖含量进行动态检测；根据吸水链霉菌在Ml和M2培养基培养条件下的雷帕霉素生物合成曲线确定代谢组学研究的取样点，在两种条件下雷帕霉素产量具有显著差异的时间段进行取样。
2)对Ml和M2培养条件下菌体胞内辅酶A类化合物进行提取，采用高效液相色谱-电喷射离子源-质谱/质谱联用仪检测，与标准辅酶A类化合物离子片段进行比对分析，对Ml和M2培养条件下菌体胞内辅酶A类化合物进行定量。
3)利用气相色谱-质谱联用仪检测Ml和M2培养条件下菌体胞内代谢物，利用Masslynxsoftware对质谱峰进行识别及定量化,通过把姆种化合物的质谱片段与NIST质谱库进行对比，对每种代谢物进行鉴定。
4)利用SIMCA-PDemo软件对气相色谱-质谱联用仪所检测胞内化合物以及雷帕霉素产量数据进行偏最小二乗法分析，研究Ml和M2培养基培养条件下菌体初级代谢与雷帕霉素合成的相关性， 鉴定出对两种条件下菌体代谢差异和雷帕霉素产量具有显著贡献的化合物，并确定这些化合物涉及的代谢途径。
5)对步骤2)胞内辅酶A化合物和步骤4)确定的化合物动态变化进行对比分析，研究M2培养条件下雷帕霉素产量高于Ml的胞内关键因素，进而针对这些胞内关键因素对雷帕霉素发酵培养基提出改进措施，得到最优化发酵培养基M3，理性指导雷帕霉素发酵培养基优化。
全文摘要
本发明提供了利用代谢轮廓分析提高雷帕霉素产量的优化发酵培养基的方法，利用动态检测和代谢轮廓分析的方法研究在初始发酵培养基和优化发酵培养基培养条件下菌体胞内代谢物动态变化及其差异。偏最小二乘法分析结果表明菌体初级代谢物轮廓和雷帕霉素产量具有相关性，结合相关途径对这些关键化合物动态变化进行分析，对培养基提出了进一步的动态添加措施。经过对S.hygroscopicus U1-6E7发酵培养基的研究，雷帕霉素产量从196mg/L提高至307mg/L，提高了56.6%。这些结果表明动态检测结合代谢物轮廓分析方法理性指导发酵培养基优化能够成功地用于提高抗生素发酵水平，为发酵培养基的优化提供了新的思路。
文档编号C12R1/55GK103088104SQ201310011709
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月12日 优先权日2013年1月12日
发明者闻建平, 赵素敏, 齐海山 申请人:天津大学