专利名称：一种用于研究转基因和非转基因水稻代谢差异的方法
技术领域：
本发明涉及分析化学领域，是一种基于代谢组学技术的水稻代谢轮廓谱研究转基因和非转基因水稻代谢差异的方法。
背景技术：
转基因技术的快速发展，引发了转基因植物对人类健康和生态环境影响的争论。 目前人们对转基因植物安全性的担忧主要体现在以下几方面(1)外源基因的毒性如何；有无过敏性；(3)是否产生有毒物质；(4)对营养价值有无影响。为了保证转基因植物的安全性，包括美国、欧盟、日本和我国在内的许多国家以及FAO、WHO等一些国际组织纷纷制订了一系列针对转基因植物安全性的管理措施。其中“实质等同性原则(substantial equivalence)”是目前国际公认的转基因食品安全性评价的通用原则。它包括三个层次的内容(1)化学组成等同；(2)食用效果等同；(3)环境影响等同。可以看出，对转基因植物安全性评价的关键内容之一是开展转基因植物与非转基因植物之间的组成差异研究。水稻中的代谢物种类繁多，既有维持生命活动和生长发育所必须的初生代谢产物，也有利用初生代谢物生成的与抗病和抗逆等关系密切的次生代谢产物；既有无机离子也有有机化合物；既有亲水性化合物也有亲脂性化合物。此外，各种物质的含量差异也很悬殊，这就对分析方法提出了很高的要求。而代谢组学技术的出现为上述目标的实现提供了可能。代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系代谢途径的一种技术。基于代谢组学的轮廓分析方法，可以非选择性地检测转基因植物在代谢物水平潜在的生理学变化，可以检测非预期效应，为转基因植物的安全性评价提供基础。目前针代谢组学研究采用的技术有色谱、质谱、核磁共振谱(NMR)等。核磁共振技术无需复杂的样品预处理过程，无偏向性，但其灵敏度太低。色谱质谱联用结合了色谱和质谱的优势，具有高分离度、高通量及高灵敏度的特点，是代谢组学研究不可或缺的分离分析技术，而高效液相色谱质谱联用技术由于应用范围广、不受样品热稳定性和挥发性的影响，已成为代谢组学研究的主流分析手段。转基因水稻由于基因结构的变化会引起一些列代谢水平上的生理学变化，采用液相色谱-质谱联用技术找到这些变化，为转基因水稻的非预期效应及安全性评价提供依据是本研究的核心内容。目前为止尚无采用液相色谱质谱联用系统进行水稻种子代谢轮廓分析的报道。由于预处理过程分多步进行，样品准备过程中容易引入误差；如果样本数比较多，质谱运行的时间较长，由于电喷雾离子源本身的衰减效应，样本的质谱响应信号会产生一定的偏差。这都将导致实验数据偏离真实值，影响最终结果的可信度。针对上述情况，我们在实验过程中加入内标及质量控制(QC)样本校正实验偏差等措施确保数据的可靠性。
发明内容
本发明的目的在于建立一种基于高效液相色谱质谱联用系统进行水稻种子代谢轮廓分析，并对转基因和非转基因水稻种子代谢差异进行研究的方法。该方法具有高灵敏度、高通量的优点，根据此方法可以为深入研究转基因水稻的安全性提供根据。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下
一种用于研究转基因和非转基因水稻代谢差异的方法，采用高效液相色谱-质谱联用技术对水稻粉末提取液进行分析得到水稻种子代谢轮廓，然后用多变量统计方法区分转基因和非转基因水稻数据，发现对代谢表型差异有重要贡献的化合物。具体步骤如下，
1)将具有代表性的转基因水稻种子样本和非转基因水稻种子样本，分别用研钵研磨后过60目筛，水稻种子粉末可储存于超低温冰箱(-80 °C)中，备用；
2)水稻样品预处理分别称取一定量的水稻种子样品于玻璃管中，向每支管中加入含内标IysoPC (19:0)的提取溶剂(甲醇/水，ν/ν为3/2)，斡旋，超声处理后离心，取上清液冻干重溶于甲醇/水(ν/ν 3/2)溶液中，斡旋，离心后，将上清液移至进样瓶中。3)对水稻样本依次进行液相色谱质谱联用分析；
液相条件为色谱柱Shrbax SB-Aq柱(1.8 Mm, 3. OX 100 mm)，流动相A为体积浓度 0. 1% 甲酸溶液，B 为乙腈；梯度洗脱条件0 2min 95/5CA/B, V/V),4 min 60/40 (Α/Β, V/ V), 20 min 5/95 (A/B, V/V), 22. Imin 0/100 乙腈持续冲洗色谱柱 4 min, 28 min 95/5 (A/B, V/V),随后起始梯度平衡7 min;流速0.30 mL/min，柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测；
质谱条件为电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，干燥气温度350 °C，干燥气流速为11 L/min;离子源温度350 °C，毛细管电压为4000 V，溶剂化离子去簇电压175 V,Centroid模式采集质谱数据，质量扫描范围m/z 100 1000，获得被分析样本的总离子流图；最终得到水稻样本的总离子流图，其即为水稻种子代谢轮廓谱。将水稻种子样本中随机抽取一个样品或一个以上样品的混合物作为QC样，作为质谱检测过程中的质量控制标准。在对水稻样本种子依次进行液相色谱质谱联用分析过程中，先将QC样进样一次，然后每分析4-8个样本后，再将QC样进样一次，通过保证QC样总离子流图的重复性确保实验过程中液相色谱质谱联用仪有较好的稳定性。4)采用LC-MS数据处理软件对水稻样本的水稻代谢轮廓谱进行峰提取，峰匹配后形成一个数据矩阵。首先将数据归一化至总峰面积，然后将数据矩阵中的变量进行缺失值处理，然后将在QC样本中RSD>25%的变量删除，接下来对数据进行标度化后利用偏最小二乘一判别分析(PLS-DA)方法对数据矩阵进行统计分析，对转基因水稻以及非转基因水稻的代谢指纹数据进行建模。根据模型中的变量重要性因子筛选对分类有重要贡献的10个或 10个以上的检测离子，这些检测离子对应的代谢物可被认为是在转基因水稻及其对应的非转基因水稻分类中起重要作用的化合物。5)对筛选出的化合物进行t检验，得到含量差异显著的重要化合物。6)对筛选出的重要化合物进行结构鉴定。本发明具有的效果是样本的储存、预处理采用自主建立的标准化程序，避免引入人为误差。水稻样品预处理过程相对简单，不需要衍生化，引入的误差小，增加了数据的可靠性。采用基于高分离度快速液相色谱一四极杆飞行时间质谱(RRLC/QTOF MS)的代谢组学的研究平台，在较高的线速度下依然可以保持很好的分离度，缩短了分析时间，提高了分析通量。同时，飞行时间质谱的分辨率高，扫描速度快，一次分析可以得到质量精度高的大量代谢物信息，为标志物的鉴定提供了可靠的依据，也节省了鉴定时间。样本预处理过程中加入内标，校正预处理过程和仪器运行过程中响应微小漂移带来的误差。样本序列分析过程中插入由所有水稻样本混合的质量控制(QC)样本，通过对QC样本总离子流图的监控，可以检测分析序列中仪器响应有无漂移，确保了实验数据的可靠性。本发明的分析方法简单，快速，重复性好，适合于实际样品的批量分析。
图1水稻小分子组份LC-MS代谢轮廓对比。(A)非转基因样本的总离子流(TIC) 图；(B)转基因样本的TIC图2 PLS — DA模型(A)得分矩阵。書为转基因水稻，■为非转基因水稻，每个点表示一个样品，t表示样本在主成分投影值。(B)S-plot X轴代表协方差，它表示了 I3LS-DA载荷矩阵中变量对分类的贡献度。Y轴代表了相关性，它表示变量在分类中的可靠性。
具体实施例方式实施例1
1、水稻样本采集
转基因水稻样本为Marker-free双价抗虫株系材料；包括3个株系，分别为N6080， N6049，N6130，是明恢86作为受体转化，经过连续多代自交及田间选择的优良株系。转基因水稻和非转基因水稻明恢86是均是在海南种植，同期播种，收种。水稻样本采集后放在-80°C冰箱保存。2、分析方法
2.1水稻种子样本预处理
水稻种子样本从-80 ！冰箱中取出，在干燥器中等待其温度恢复至室温。将每种水稻种子脱壳后放在研钵中研磨，过60目筛，得到粒径均一的粉末。将水稻粉末分装至塑料管中，备用。称取N6080或N6049各5份(每份0. 1500 g)，分别置于5 mL玻璃管中。称取 N6130 4份(每份0.1500 g)，分别置于5 mL玻璃管中。称取非转基因水稻明恢86 5份(每份0. 1500 g)，分别置于5 mL玻璃管中。作为质量控制(QC)样本，称取每种(N6080、N6049、N6130、明恢86)水稻0. 5 g, 混合均勻，然后称取QC样本4份(每份0. 1500 g)，于5 mL玻璃管中。称取内标lysopc(19:0) 1.0 mg于1. 5 mL离心管中，加入1 mL甲醇。斡旋，超声，使之完全溶解，获得浓度为1 mg/mL的内标溶液。取20 mL水，30 mL甲醇，超声混勻，配置50 mL 60%甲醇(ν/ν)溶液作为提取溶齐U。向提取溶剂中加入50 μ 1 mg/mL的内标溶液，混勻。向每个玻璃管中加入2 mL带内标提取溶剂，斡旋10 s,超声40分钟。取出1.2 mL移至印pendorf管中，于4 "C, 14000 rpm下离心10分钟。离心结束后，取1.0 mL上清液置于冻干机中冻干。仪器分析前，加入200 UL水/甲醇(ν/ν 2:3)溶液复溶。斡旋30 s，于4 14000 rpm下离心10分钟后将上清液移至进样瓶，用于高效液相色谱质谱分析。2. 2高效液相色谱质谱分析
液相条件为色谱柱Shrbax SB-Aq柱(1.8 Mm, 3. OX 100 mm)，柱温60 °C，进样量2 μ L，流动相A为体积浓度0. 1%甲酸溶液，B为乙腈；梯度洗脱条件0 2 min 95/5 (A/B， V/V),4 min 60/40 (A/B, V/V), 20 min 5/95 (A/B, V/V), 22.1 min 0/100 乙腈持续冲洗色谱柱4 min, 28 min 95/5 (A/B, V/V),随后起始梯度平衡7 min ；流速0. 30 mL/min，柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测；
质谱条件为电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，干燥气温度350 °C,干燥气流速为11 L/min，雾化气压45 psig ；离子源温度 350°C，毛细管电压为4000 V，溶剂化离子去簇电压175 V，锥孔电压65 V，Centroid模式采集质谱数据，每0.50 s采集一次数据；质量扫描范围m/z 100 1000，获得被分析样本的总离子流图；最终得到水稻种子的总离子流图，其即为水稻种子代谢轮廓谱。在对19个水稻样本依次进行高效液相色谱质谱联用分析过程中，先将QC样本进样一次，然后每分析5个样本后，再将QC样进样一次，通过保证QC样品保留时间和响应信号的重现性，确保实验过程中液相色谱质谱联用仪有较好的稳定性。根据以上操作，获得水稻种子小分子代谢物的轮廓(图1)。对14个转基因样本和 5个非转基因对照水稻样本进行分析。样品分析顺序为转基因与对照组交替进行。在分析序列中插入QC样品，QC样品为转基因水稻与非转基因水稻的混合物。在分析时间内QC样品的重复性良好，没有出现明显的组分变化，保留时间没有出现飘移，可知所有的水稻样品在整个分析时间内也是稳定的(表1)。通过内标和QC样品，可以确保数据的可靠性。3模式识别及标志物筛选
将所获得的所有的水稻种子的总离子流图的原始数据利用MFE (molecular feature extraction)软件提取化合物信息，此步骤中将保留时间在0到20分钟，m/z值为100到 1000,峰高大于1000的峰保留，并计算准确化合物分子量，生成MHD文件。将MHD文件导入 gene spring软件进行峰匹配后得到原始峰表，此步骤中质量偏差的斜率设为5. Oppm，截距设为2.0π ^，其他参数均为软件默认值。对原始峰表归一化至总峰面积来减少系统误差，然后对缺失值进行处理。然后将缺失值处理后的峰表利用SIMCA-P 11. 5 (Umetrics, Umea, Sweden )进行 PLS-DA 分析。T 检验采用 SPSS 13. 0 (SPSS Inc. , Chicago, IL)进行。为了考察转基因和非转基因水稻的代谢轮廓差别，我们把每个样品的测量数据进行峰识别、峰匹配。峰识别匹配后形成一张由保留时间、质量数和峰面积构成的EXCEL峰表。首先将数据归一化至总峰面积，然后将数据按照在QC样本中80%存在的变量保留的原贝U，对缺失值进行处理。然后删除QC样本中相对标准偏差大于25%的变量，得到一张数据可靠的峰表。水稻种子代谢轮廓中有数以百计的组分，而利用多变量分析方法可以将数据降维，从大量的数据中提取有用的信息。PLS-DA是一种基于偏最小二乘法的多变量分类方法， 它模拟了数据组矩阵和类别从属矩阵的关系，解释数据矩阵中已定义类别样本之间的最大偏差。利用PLS-DA可以解释转基因样本和非转基因样本之间的最大偏差。
将峰表中的每个变量(LC/MS分析得到的质谱峰)除以其标准偏差的平方根，进行par标度化，在一定程度减少PLS-DA运算中因响应强度造成的偏差，也可以使低浓度的代谢物分子的作用得到体现。转基因样本赋予分类值1，非转基因水稻赋予分类值2，所有的计算参数均为软件默认值，由此得到PLS-DA模型。PLS-DA模型的相关数据如下A=2、 R2X=O. 513、R2Y=O. 97、Q2Y=O. 955。其中A为模型使用的主成分数，R2X, R2Y分别代表模型对原数据矩阵X，Y信息的解释程度，Q2Y为模型的预测能力。上述数据明模型具有良好的稳定性和预测能力。模型具有2个主成分，根据每个样本在主成分上的投影，得到得分矩阵图(图2)， 从中可知，14个转基因样本和5个非转基因样本的投影在第一主成分上可以得到很好的分离，表明转基因水稻与非转基因水稻的代谢轮廓存在明显的区别。根据每个变量在主成分上的投影，得到载荷矩阵图，在此基础上，根据每个变量的在载荷图上的坐标可计算其变量重要性因子VIP (VIP由PLS-DA直接获得)
⑴
公式(1)中A为模型主成分数，K为变量数，Wai为变量在PLS中的权重，SSY表示第a 个成分可解释的SS，SS为上一个主成分残差的平方和，a表示第a个成分。S-plot以图形化的方式同时表现了变量对分类的贡献度与可靠性(图2B)，X轴代表协方差，它表示了 PLS-DA载荷矩阵中变量对分类的贡献度。具有低协方差的变量可能来源于分析误差和噪音差生的信号，Y轴代表了相关性，它表示变量在分类中的可靠性。变量在图中呈S型。分布在S两端的变量，贡献度与可靠性都比较高，它们是对分类起重要作用的代谢物。由于S-plot结合了协方差以及相关性的信息，可以降低标志物选取过程中存在的假阳性的风险。将位于S-plot图两端且VIP (VIP>1)最大10个的变量的信息提取，并将其含量信息导入到SPSS进行独立样本t检验，通过t检验的变量(p<0. 05)认为是转基因和非转基因水稻的代谢有显著性差异的化合物(表2)。对表2中的离子进行结构鉴定，分别为tryptophan，linolenic acid, phytosphingosine，9, 10，13-TriH0ME，LPE (16:0), palmitic acid 等。它们是转基因和非转基因差异较大的化合物，可为转基因水稻的非预期效应和安全性评价提供依据。本发明是利用高效液相色谱质谱联用技术建立水稻种子代谢轮廓分析方法，结合多变量数据寻找转基因水稻和非转基因水稻的代谢差异。经过超声辅助提取技术对水稻组份进行预处理后，利用液质联用系统分离检测水稻种子中的小分子代谢物，获得水稻种子代谢轮廓信息。将数据进行归一化、缺失值处理后建立PLS-DA模型，对转基因水稻和非转基因水稻种子的代谢进行整体区分。同时，结合载荷因子和S-plot图筛查出对分类有重要贡献的化合物，并对其进行t检验。本发明建立的水稻代谢轮廓分析方法在预处理过程中加入内标，最大程度的降低在实验过程中引起的误差，方法验证结果良好。另外，通过质量控制(QC)实现了对仪器运行过程中保留时间和相应信号的监控，确保了数据的可靠性。本发明筛选出多个对分类有重要贡献的化合物，可以为转基因植物的非预期效应和安全性评
权利要求
1.一种用于研究转基因和非转基因水稻代谢差异的方法，其特征在于采用液相色谱-质谱联用技术对水稻种子提取物进行分析得到水稻代谢轮廓谱；然后用多变量统计方法研究转基因水稻和非转基因水稻的代谢轮廓数据的整体差异，发现对代谢表型差异有重要贡献的化合物，为转基因水稻的非预期效应和安全性评价提供依据。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述转基因水稻是以所述非转基因水稻为受体进行基因插入，经过自交并选择具有抗虫性的样本获得的转基因水稻；通过找出的对代谢表型差异有重要贡献的化合物，进一步获知由基因插入对受体的影响。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于代谢轮廓谱获取的具体步骤为，1)取转基因水稻种子样本和非转基因水稻种子样本，分别研磨成粉末并过筛，获得二类粒径均一的水稻样本；2)水稻样品预处理分别称取二类水稻种子样品于玻璃管中，向每支管中加入含内标 IysoPC (19:0)的提取溶剂(甲醇/水，ν/ν为3/2)，斡旋，超声处理后离心，取上清液冻干重溶于甲醇/水(v/v =3/2)溶液中，斡旋，离心后，将上清液移至进样瓶中用于液相色谱质谱联用分析；3)对水稻样本依次进行液相色谱质谱联用分析；液相条件为色谱柱为hrbax 38^9柱(1.8|^，3.0乂100 mm)，流动相A为体积浓度 0. 1%甲酸溶液，B为乙腈；流速0. 30 mL/min，柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测；质谱条件为电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，干燥气温度350 °C，干燥气流速为11 L/min ；离子源温度350 °C，毛细管电压为4000V，溶剂化离子去簇电压175 V，Centroid模式采集质谱数据；质量扫描范围m/z 100 1000，获得被分析样本的总离子流图；最终得到水稻种子样本的总离子流图，其即为水稻种子代谢轮廓谱。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于将水稻种子样本中随机抽取一个样品或一个以上样品的混合物作为QC样，作为质谱检测过程中的质量控制标准；在对水稻样本依次进行液相色谱质谱联用分析过程中，先将QC样进样一次，然后每分析4-8个样本后，再将QC 样进样一次，通过保证QC样总离子流图的重复性确保实验过程中液相色谱质谱联用仪无较大系统偏差，数据可靠。
5.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于采用LC-MS数据处理软件对水稻种子样本的代谢轮廓谱进行峰提取，峰匹配后形成一个EXCEL数据矩阵；将数据矩阵中的变量进行缺失值处理，然后将在QC样本中RSD大于25%的变量删除，接下来利用偏最小二乘一判别分析(PLS-DA)方法对数据矩阵进行整体分析，对转基因水稻以及非转基因水稻的代谢指纹数据进行建模；根据模型中的变量重要性因子筛选对分类有重要贡献的10个或10个以上的检测离子，这些检测离子对应的代谢物可被认为是在转基因水稻及其对应的非转基因水稻分类中起重要作用的化合物。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于对筛选出的化合物进行t检验；然后对重要化合物进行结构鉴定。
全文摘要
本发明公开了一种水稻代谢轮廓分析及代谢差异研究的方法，采用液相色谱-质谱联用技术对水稻种子提取物进行分析得到水稻代谢轮廓谱，然后用多变量统计方法研究转基因水稻和非转基因水稻的代谢轮廓数据的整体差异，并发现对代谢表型差异有重要贡献的化合物，为转基因水稻的非预期效应和安全性评价提供依据。本发明的分析方法简单，快速，重复性好，适合于实际样品的批量分析。
文档编号G01N30/88GK102478563SQ20101055902
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月25日 优先权日2010年11月25日
发明者周佳, 常玉玮, 许国旺, 赵春霞, 赵燕妮, 路鑫 申请人:中国科学院大连化学物理研究所