专利名称：检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物、试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物、试剂盒，以及检测膀胱癌尿液miRNA-155表达量的方法，属于分子生物学检测技术领域。
背景技术：
膀胱癌是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤，在我国的发病率和死亡率均占男性泌尿生殖系统肿瘤的首位，且呈逐年上升趋势。膀胱癌患者初诊时30%已发生肌层浸润，而在非肌层浸润性膀胱癌患者中，仍有30%会复发为浸润性膀胱癌。早期诊断和早期治疗是预防和控制膀胱癌的关键。目前临床上诊断膀胱癌主要依赖于膀胱镜、尿脱落细胞学和影像学检查等。膀胱镜是膀胱癌诊断的常用方法，可造成不同程度的尿道和膀胱损伤以及感染等并发症；尿脱落细胞学检查具有非侵入性、特异性高等优点，其敏感性低于50%，对早期患者仅为30%，易受检测者主观因素的影响；CT和超声检查是目前诊断膀胱癌及术前分期最常用的影像学检查方法，但对膀胱内较小病变不易发现，对膀胱癌分期预测受到一定限制。寻找敏感性、特异性高的早期诊断生物标志物，建立一种经济准确、安全有效的血清学膀胱癌诊断方法是目前关注的焦点。miRNAs是在真核生物中 发现的一类具有调控功能的内源性非编码小分子RNA，其通过对mRNA的完全和部分配对结合，降解mRNA或干扰mRNA的翻译，在转录后水平调控特定基因的表达，从而对细胞增殖、分化与凋亡起到精细调节的作用。近年来研究发现，尿液中存在丰富稳定的miRNAs，其与泌尿系统恶性肿瘤的发生、发展密切相关，为肿瘤的无创性诊断开辟了一条新的途径。并且，随着分子生物学技术的发展，通过实时荧光定量PCR方法检测尿液中微量的miRNAs已成为可能。所谓实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号的积累实时监测PCR的进程，最后通过标准曲线对待测模板进行定量分析。由于该技术操作简便、敏感性高、重复性好，目前已在核苷酸检测领域得到广泛应用。
miRNA-155为癌基因BIC的表达产物，其在造血细胞分化、免疫、肿瘤及心血管等疾病各种生理或病理过程中起着重要的调控作用。2005年1rio应用微阵列芯片技术首次筛选出乳腺癌异常表达的miRNAs谱，发现miRNA-155是上调最明显的miRNAs之一。Zhu等发现miRNA-155的表达水平较正常乳腺组织显著上调，并且其与乳腺癌的TNM分期、淋巴结转移、雌激素受体、孕激素受体呈明显相关。近年来，随着研究的不断深入，发现miRNA-155在肺癌、胰腺癌、肾癌以及头颈部肿瘤中表达均明显升高，并且与肿瘤细胞的增殖、浸润及转移具有密切关系，表明miRNA有可能成为一种良好的肿瘤标志物分子。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒及检测方法，能够快速、简便、准确的检测膀胱癌尿液中miRNA-155的表达量。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案:一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物，包括:(I) miRNA-155的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID N0:1所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:miRNA-155-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCT-3’ ；miRNA-155-F:5’ -CGCCTTAATGCTAATCGTGAT-3’ ；miRNA-155-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ；(2)miRNA-191的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO:4所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示:miRNA-191-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG-3’ ；miRNA-191-F:5’ -GCCAACGGAATCCCAAAAG-3’ ；miRNA-191-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ；(3)miRNA-16的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID N0:7所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示:miRNA-16-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ；miRNA-16-F:5’ -CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’ ；miRNA-16-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒，包括上述引物，以及RNA分离液；所述RNA分离液由吐温20、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水组成，其中，浓度如下:吐温20:2.5% (体积百分数)，三羟甲基氨基甲烷:50mmol/L，乙二胺四乙酸:lmmol/L,牛血清白蛋白:1% (质量百分数)。所述检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液由IXSyber Green I荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成。优选的，各物质的浓度如下:DNA聚合酶:100U/mL ；dNTPs:0.2mM ;氯化镁:6mM ;三羟甲基氨基甲烷盐酸盐:16.5mM ;氯化钾:89.3mM。上述检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物在定量检测膀胱癌miRNA-155表达量的应用。上述检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒在定量检测膀胱癌miRNA-155表达
量的应用。 一种检测膀胱癌尿液miRNA-155表达量的方法，步骤如下:(I)分离尿液标本上清液，与等体积的RNA分离液混合，1600g离心5分钟，之后16000g离心10分钟，分离上清；(2) RT-PCR扩增:将上述分离的上清液进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，加入引物和PCR反应液，进行PCR反应，检测样本阈值Cq (Test sample);同时以人膀胱癌细胞株T24细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)中提取miRNAs，逆转录成cDNA作为校对样本，在每个PCR反应板中进行检测，记录Cq值；内参基因miRNA_191、miRNA-16的RT-PCR扩增，除引物采用相对应的逆转录引物和检测引物外，方法相同；(3)制作标准曲线:上述检测完成后，拷贝数以10为底取对数作为横坐标，Cq值为纵坐标作图，绘制标准曲线，计算斜率S，然后根据公式E=IO (_vs)-l，计算扩增效率E ;(4)计算:选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本阈值Cq (T)和校对样本阈值Cq (C)，根据公式Q= (E+1)_Ag% A Cq=[Cq (T)-Cq (C)],得出基因的校正起始拷贝数Q ;将miRNA-155的Q值与内参基因miRNA_191、miRNA_16的Q值的几何平均数相比，得到miRNA-155的相对表达量。本发明的有益效果是，本发明建立的膀胱癌尿液miRNA-155检测方法，为膀胱癌的早期发现、早期治疗提供了重要的参考依据。本发明利用RNA分离液对尿液样本进行处理，得到的混合液直接用于逆转录反应，省略了对尿液样本RNA的提取过程，不仅简化了操作步骤，降低了检测成本，还避免了传统方法提取RNA降解的问题。本发明使用了表达相对稳定的miRNA-191、miRNA-16作为内参基因，对标本中的miRNA-155进行相对定量分析，避免了单一内参基因表达不稳定对结果产生的影响。本发明根据公式E=10(_1/S)_l，计算扩增效率(E)，根据公式Q= (E+l)_AQl计算miRNA-155基因相对miRNA-191、miRNA-16的表达量，避免了传统2_AA&1法必须要求PCR扩增效率为100%的限制，使结果分析更加可靠。`
图1 (A)为miRNA-16的标准曲线；图1 (B)为miRNA-191的标准曲线；图1 (C)为miRNA-155的标准曲线；图2为尿液miRNA-155在26例膀胱癌患者和20例健康对照者中的相对表达水平；图3为血清miRNA-155检测对膀胱癌诊断的ROC曲线。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1( I)试剂盒的组成及配制:根据microRNA 数据库(http: //www.mirbase.0rg/)上报的核苷酸序列 miRNA-155(MIMAT0000646)、miRNA-191 (MIMAT0000440), miRNA-16 (MIMAT0000069)为模板，自主设计的检测目标基因(miRNA-155)和内参基因(miRNA-191和miRNA-16)的引物，其引物序列、Tm值见表I。表I引物序列、Tm值
权利要求
1.一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物，其特征在于，包括: (1)miRNA-155的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQID N0:1所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:miRNA-155-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCT-3’ ；miRNA-155-F:5’ -CGCCTTAATGCTAATCGTGAT-3’ ；miRNA-155-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ； (2)miRNA-191的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQID N0:4所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示:miRNA-191-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG-3’ ；miRNA-191-F:5’ -GCCAACGGAATCCCAAAAG-3’ ；miRNA-191-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ； (3)miRNA-16的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQID NO:7所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示:miRNA-16-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ；miRNA-16-F:5’ -CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’ ；miRNA-16-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。
2.一种 检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的专用引物，以及RNA分离液；所述RNA分离液由吐温20、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水组成，其中，浓度如下:吐温20:2.5%，三羟甲基氨基甲烷:50mmol/L，乙二胺四乙酸:lmmol/L,牛血清白蛋白:1%。
3.根据权利要求2所述的一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒，其特征在于，所述专用试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液由Syber Green I荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成。
4.根据权利要求3所述的一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒，其特征在于，各物质的浓度如下:DNA聚合酶:100U/mL ；dNTPs:0.2mM ;氯化镁:6mM ;三羟甲基氨基甲烷盐酸盐:16.5mM ;氯化钾:89.3mM。
5.权利要求1所述的检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物在定量检测膀胱癌miRNA-155表达量的应用。
6.权利要求3所述的检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒在定量检测膀胱癌miRNA-155表达量的应用。
7.—种检测膀胱癌尿液miRNA-155表达量的方法,其特征在于,步骤如下: (1)分离尿液标本上清液，与等体积的RNA分离液混合，离心，分离上清； (2)RT-PCR扩增:将上述分离的上清液进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，加入引物和PCR反应液，进行PCR反应，检测样本阈值Cq ;同时以人膀胱癌细胞株T24细胞中提取miRNAs，逆转录成cDNA作为校对样本，在每个PCR反应板中进行检测，记录Cq值；内参基因miRNA-191、mi RNA-16的RT-PCR扩增，除引物采用相对应的逆转录弓I物和检测引物外，方法相同； (3)制作标准曲线:上述检测完成后，拷贝数以10为底取对数作为横坐标，Cq值为纵坐标作图，绘制标准曲线，计算斜率S，然后根据公式E=IO (_vs)-l，计算扩增效率E ; (4)计算:选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本阈值Cq (T)和校对样本阈值Cq (C)，根据公式Q= (E+1)_Ag% A Cq=[Cq (T)-Cq (C)]，得出基因的校正起始拷 贝数Q ;将miRNA-155的Q值与内参基因miRNA-191、miRNA_16的Q值的几何平均数相比，得到miRNA-155的相对表达量。
全文摘要
本发明公开了一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物、试剂盒及检测方法，能够快速、简便、准确的检测膀胱癌尿液中miRNA-155的表达量。该专用试剂盒包括检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用逆转录引物和检测引物以及RNA分离液；RNA分离液由2.5%吐温20、50mmol/L三羟甲基氨基甲烷、1mmol/L乙二胺四乙酸和1%牛血清白蛋白组成。本发明为膀胱癌的早期发现、早期治疗提供了重要的参考依据。
文档编号C12N15/11GK103074430SQ201310012169
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月14日 优先权日2013年1月14日
发明者王传新, 张欣, 刘益民 申请人:山东大学齐鲁医院