Dhfr在检测膀胱癌中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明DHFR在检测膀胱癌中的应用，属于分子生物学基因检测【技术领域】。包括下述步骤：(1)从样本的膀胱组织和外周血中分别提取DNA，得到DNA模板；(2)以引物对P为引物，分别以从样本的膀胱组织和外周血提取的DNA为模板，分别进行实时定量PCR扩增；(3)根据ΔΔCt来计算每个样本的log2比值，并将其与全基因组测序数据得到的拷贝数改变情况进行比较，当拷贝数变化超过2.5或小于1.5时或者当用GISTIC算法得到G分数>0.08或者G分数<0.08时，为膀胱癌样本。本发明具有指出了DHFR序列扩增可以作为检测膀胱癌的标记物；DHFR基因可以作为膀胱癌的基因靶向治疗试剂盒的优点。
【专利说明】DHFR在检测膀胱癌中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学基因检测【技术领域】，具体涉及DHFR在检测膀胱癌中的应用。
【背景技术】
[0002] 在全世界各个国家和地区，膀胱癌是一种最常见泌尿生殖系统恶性肿瘤。据估计，仅在2008年单年度就有386300例新发病例和150200例死亡病例。过去的研究表明:膀胱癌是一个具有较高异质性的疾病，它有两个不同亚型(浅表型和侵入型)，其临床表现多变和遗传背景复杂。最近，我们开展的一项研究结果表明:在膀胱移行细胞癌中，有八个染色质重塑基因(UTX，MLL-MLL3，CREBBP-EP300，NCORl,ARIDlA 和 CHD6)存在频发突变。然而，目前我们对膀胱癌的体细胞突变情况仍缺乏系统的认识，我们对膀胱癌发生过程中的关键“驱动基因”也知之甚少。
[0003]为了确定这些突变基因与膀胱癌发生的相关性，我们采用过去研究中所描述的统计学方法分析了每个基因的体细胞突变率是否显著高于整个基因组的背景突变率。通过该分析，我们一共发现了 37个显著突变基因，其中包括7个已知膀胱癌的基因(TP53，HRAS, FGFR3，PIK3CA，RBl，KRAS和TSCI)以及我们过去所发现的八个染色质重塑基因(UTX, ARID1A, MLL-MLL3, CREBBP-EP300, NCORl 和 CHD6)。此外，我们还分析了染色质重塑相关基因和基因家族的突变情况，并在膀胱癌中观察到多个其他染色质重塑基因的频发突变，包括组蛋白脱甲基酶基因UTX/UTY(30% )，核染色质重塑基因ARID1A/4A(17% )，组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因MLL/MLL3/MLL5(16% )，组蛋白乙酰转移酶基因EP300/400(15% )，SffI/SNF复合体相关基因SMARCA4/C1 (7% )和组蛋白脱甲基酶基因JARID 1A/B^% )。总的来说，在99例病例中，至少有57例(58%)患者的染色质重塑基因存在体细胞突变，这进一步表明调节染色质构象的表观遗传学改变和翻译后修饰可能是膀胱癌发生过程中的一种主要的驱动机制。
[0004]我们采用了全基因组测序技术分析了 99例肿瘤的拷贝数变异情况，发现染色体臂或整个染色体水平的异常主要集中在以下染色体(臂):5p，8q，13p和20p_q扩增和8p, 9p-q, lip, 14p, 15p, 17p和21p丢失。与先前的研究结果一致,就总体扩增或缺失的特征而言，不同膀胱癌亚型的扩增或缺失特征没有明显差异。通过拷贝数变异分析，我们发现许多公认的致癌基因异常可能与膀胱癌的发生相关。我们采用GSITIC算法来识别在多个样本中重复出现的小片段拷贝数变异。我们一共找到84个局部扩增区域，其中包括几个过去已经发现与膀胱癌有关的基因，如:TR10，MDM2, MYC, E2F3, CCNDl和ERBB2。其他扩增区域所包含的基因在膀胱癌中尚属首次报道，包括CCNE1，CEBPA，E2F1和MUCl。我们还发现了 80个重复发生的局部缺失区域，包括RBl和CREBBP (它们在膀胱癌中常发生截断突变)。最常见的局部缺失区域(可在50%肿瘤中检测到)为9p21，其中包含CDKN2A/B基因。有趣的是，我们在14例肿瘤中(14%)发现位于染色体5q(常发生缺失的区域)的DHFR基因发生扩增，并且观察到DHFR mRNA水平上升和基因组扩增之间存在中等强度的相关性(R2 =0.60，P = 0.018)。DHFR(编码二氢叶酸还原酶的基因)的突变的突变可以作为膀胱癌突变的检测标志，协同其他检测方式对膀胱癌的检测具有重要意义。同时DHFR编码的二氢叶酸还原酶在细胞生长和增殖过程嘌呤和胸苷酸合成中是必不可少的关键酶，也是许多根治性膀胱切除术前化疗抗癌药的靶点。DHFR扩增可以作为一个生物标志物，用来评估MTX治疗膀胱癌的效果。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于公开了 DHFR在检测膀胱癌中的应用。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0007]1、DHFR在检测膀胱癌中的应用，包括下述步骤:
[0008](I)、从样本的膀胱组织和外周血中分别提取DNA，得到DNA模板；
[0009](2)、以5对引物对为引物，分别以从样本的膀胱组织和外周血提取的DNA为模板，分别进行实时定量PCR扩增，其中引物对为:
[0010]
CCND IF5，-C'TGCGAGGAACAGAAGTGCG-3，,
CCNDlR5'-GG ATGGAGTTGTCGGTGTAG ATG-S5 ；
CDKN2A/2BF5 '-G AAGTCTTGGTCCTGATGTCCCC-3 *?
CDKN2A/2BR5, -CGGCTCTTCTGCAC AACTC AACT-3,；
DIIFEF5，-AGGGACCAGGTTGGATTAGGd,
DIIFRR5 ’-AGGGCAAGGAAGTCTTCACAGC-3';
ERBB2F5，-CTGCTGG AC ATTG ACG AG AC A-3，，
ERBB2K5 ’-TTGATGGGCACCTGGG AG-3 ’ ；
[0011](3)、根据Λ ACt来计算每个样本的log2比值，并将其与全基因组测序数据得到的拷贝数改变情况进行比较，当拷贝数变化超过2.5或小于1.5时或者当用GISTIC算法得到G分数>0.08或者G分数〈0.08时，为膀胱癌样本。
[0012]上述技术方案所述的DHFR在检测膀胱癌中的应用，其中，所述实时定量PCR扩增的反应条件为:
[0013]第一步预变性:95°C 10秒，重复I次；
[0014]第二步PCR反应:95°C 5秒和60°C 30秒，重复40次。
[0015]上述技术方案所述的DHFR在检测膀胱癌中的应用，其中，所述实时定量PCR扩增体系中含有:12.5μ I 2 X Premix Ex TaqU μ I DHFR 上游引物(10 μ Μ)、I μ I DHFR 下游引物(10 μ Μ)、2 μ I DNA模板和8.5 μ I d Η20(灭菌蒸懼水)。
[0016]本发明具有以下有益效果:
[0017]1、DHFR序列扩增可以作为检测膀胱癌的标记物；
[0018]2、DHFR基因可以作为膀胱癌的基因靶向治疗试剂盒；
[0019]3、DHFR基因有可能用于评估MTX治疗膀胱癌的效果。【专利附图】
【附图说明】:
[0020] 1、图1为RT-PCR反应结果。
[0021 ] 2、图2为RT-PCR反应程序。
【具体实施方式】
:
[0022]为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明DHFR在检测膀胱癌中的应用作进一步的说明。
[0023]本发明实施例中未作特殊说明的操作方法均按照仪器中的说明书进行操作。
[0024]实施例1:DHFR在检测膀胱癌中的应用:
[0025]一、样本来源与及选择标准:
[0026]通过泌尿生殖系统癌症基因组联盟(UCGC)的中国成员机构，从新检测的患者中获取肿瘤样本和与其匹配的外周血或正常对照组(相邻的形态正常的膀胱组织)。按照伦理审查委员会规定的制度，每个病人在招聘研究之前均签署了知情同意书。患者的详细的临床资料见表1。
[0027]表1 99例膀胱癌患者信息
[0028]
【权利要求】
1.DHFR在检测膀胱癌中的应用，包括下述步骤: (1)、从样本的膀胱组织和外周血中分别提取DNA，得到DNA模板； (2)、以5对引物对为引物，分别以从样本的膀胱组织和外周血提取的DNA为模板，分别进行实时定量PCR扩增，其中引物对为:
CCNDIF5，-CTGCGAGGAACAGAAGTGCG-3，,CCNDIK5 ’-GG ATGG AGTTGTCGGTGTAG ATG-3 ’ ；CDKN2A/2BF5 ,-GAAGTCTTGGTCCTG ATGTCCCC-35?CDKN2A/2BR5’-CGGCTCTTCTGCACAACTCAACT-3，.?DHFRF5 ’-AGGGACCAGGTTGGATTAGGC-3 ’,DHFRR5 !-AGGGCAAGGAAGTCTTCACAGC-3,:ERBB2F5，-CTGCTGGACATTGACGAGACA-3，?
ERBB2R5 ^TTGATGGGC ACCTGGGAG-3 ’ ； (3)、根据ΛΛ Ct来计算每个样本的log2比值，并将其与全基因组测序数据得到的拷贝数改变情况进行比较，当拷贝数变化超过2.5或小于1.5时或者当用GISTIC算法得到G分数>0.08或者G分数〈0.08 时，为膀胱癌样本。
2.根据权利要求1所述的DHFR在检测膀胱癌中的应用，其特征在于，所述实时定量PCR扩增的反应条件为: 第一步预变性:95°C 10秒，重复I次； 第二步PCR反应:95°C 5秒和60°C 30秒，重复40次。
3.根据权利要求1所述的DHFR在检测膀胱癌中的应用，其特征在于，所述实时定量PCR 扩增体系中含有:12.5μ 12XPremix Ex TaqU μ I DHFR 上游引物(10 μ Μ)、I μ IDHFR下游引物(10 μ Μ)、2 μ I DNA模板和8.5 μ I d Η20(灭菌蒸馏水)。
【文档编号】C12Q1/68GK104164482SQ201410212369
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年5月20日 优先权日:2014年5月20日
【发明者】吴松, 黄毅, 杨坤, 蒋涛涛, 谢畅, 毛有胜, 蔡志明 申请人:吴松, 蔡志明