一种脂蛋白编码基因的用途
【专利摘要】本发明披露了一种脂蛋白编码基因的用途，经鉴定该基因与十字花科黑腐病病菌致病相关，故用于防治植物十字花科黑腐病病害。该基因是编码序列表中序列2所示蛋白质的如序列表中序列1所示的DNA序列。
【专利说明】一种脂蛋白编码基因的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物病原细菌的致病相关基因及其用途，尤其涉及一种脂蛋白编码基因在防治植物病害方面的应用。
【背景技术】
[0002]植物病害一直是农作物减产、品质降低的主要因子之一。随着病原菌对药物抗性的增强，农药用量在不断增加，这不仅加剧了环境污染、药物残留，也大大提高了农业成本，因此，亟待研发新的防病治病策略和新型的无公害药物。弄清植物病原菌侵染寄主的遗传机制是开发新型药物和防病策略的关键。
[0003]十字花科黑腐病菌，也称野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc，Xanthomonascampestris pv.campestris),是一种能 在全球范围内引起所有十字花科植物黑腐病的革兰氏阴性细菌。该菌能在寄主的任何生长期通过水孔或伤口侵入植物体内，引起病害，寄主包括甘蓝、花椰菜、大白菜、萝卜、油菜等。典型的黑腐病症状是在叶缘上形成V字形病斑，随着病斑的扩大，叶脉变黑，因而被称为黑腐病。黑腐病被认为是对十字花科植物危害最为严重的病害，尤其在热带和亚热带地区，温度和湿度都适宜于该菌的生长繁殖，因此发病更加严重。由于遗传稳定性和遗传可操作性，十字花科黑腐病菌一直被用作研究微生物与植物相互作用分子机理的模式细菌，是在经济和科学意义上最重要且研究得最为深入的10个植物病原细菌的种之一。因此，鉴定与十字花科黑腐病菌致病相关的新基因，对防治植物病害具有显著的意义。
[0004]目前，脂蛋白编码基因XC2522在植物病原细菌中还未见有过报道。如果鉴定了十字花科黑腐病菌的致病相关基因，便能够为防治十字花科植物黑腐病病害提供药物靶标。
[0005]参考文献
[0006]1.Qian W，Jia Y，Ren SX，et al.Comparative and functional genomic analysesof the pathogenicity of phytopathogen Xanthomonas campestris pV.campestris.Genome Res，2005，15(6):757-767.[0007]2.Rudolph K.1993.1nfection of the plant by Xanthomonas.1n:Swings JG,Civerolo EL,editors.Xanthomonas.London:Chapman and Hall.pp.193-264.[0008]3.Williams PH.Plant Dis，1980，64:736-742.[0009]4.Mansfield JiGenin SiMagori S，et al.ToplOplant pathogenic bacteria inmolecular plant pathology.Mol Plant Pathol，2012，13 (6):614-629.[0010]5.Ryan RP, Fouhy Y，Lucey JF, et al.Cyclic d1-GMP signalling inthe virulence and environmental adaptation of Xanthomonas campestris.MolMicrobiol，2007，63(2):429-442.
【发明内容】
[0011]本发明所要解决的技术问题是提供一种脂蛋白编码基因的用途，通过鉴定该基因与十字花科黑腐病菌致病相关而为防治十字花科植物黑腐病病害提供药物靶标。
[0012]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种脂蛋白编码基因的用途，该基因是编码序列表中序列2所示蛋白质的DNA序列，经鉴定该基因与十字花科黑腐病病菌致病相关，故用于防治植物十字花科黑腐病病害。
[0013]优选地，该脂蛋白编码基因是序列表中序列I所不的DNA序列。
[0014]本发明鉴定了脂蛋白编码基因XC2522与十字花科黑腐病致病相关，因而能够为防治十字花科植物黑腐病病害提供药物靶标。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为脂蛋白编码基因XC2522克隆的酶切电泳图谱；
[0016]图2为脂蛋白编码基因XC2522缺失突变体D2522构建的验证凝胶图；
[0017]图3为脂蛋白编码基因XC2522突变体的过敏反应检测；
[0018]图4为脂蛋白编码基因XC2522突变体的致病性检测。
【具体实施方式】 [0019]以下结合附图和优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。应该理解，以下列举的实施例仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。
[0020]本发明旨在提供与十字花科黑腐病菌致病相关的脂蛋白编码基因XC2522。首先确定XC2522基因与十字花科黑腐病致病性的关系，并拟阐明该基因在Xcc中过敏反应(HR)的功能，由此得到该脂蛋白编码基因在防治植物十字花科黑腐病方面的用途。
[0021]本发明所提供的脂蛋白编码基因，是编码序列表中序列2所示蛋白质的DNA序列。
[0022]本发明提供的脂蛋白编码基因是序列表中序列I所不的DNA序列。
[0023]目前，该脂蛋白编码基因(以下简称XC2522基因)的序列已在美国国家生物技术信息中心(NCBI, National Center of Biotechnology Information)公布，其基因组序列号为NC_007086，该基因编码蛋白序列号为YP_243592。携带该基因的质粒(自命名ρΚ2522和pL2522)已在广西大学生命科学与技术学院保存。
[0024]序列表中序列I的DNA是十字花科黑腐病菌8004菌株的编码蛋脂蛋白的基因，由801个碱基组成，含完整的nlpD基因，自5'端的第I位至第801位核苷酸为该基因的开放阅读框(0RF，Reading Frame),自5'端的第I位至第3位核苷酸为该基因的起始密码子GTG,自5'端的第799位至第801位核苷酸为终止密码子TGA。
[0025]序列表中序列2的蛋白质是XC2522编码的脂蛋白产物，由266个氨基酸组成。
[0026]本发明通过以下方法步骤鉴定编码脂蛋白的基因与十字花科黑腐病致病相关:
[0027]( 一 ) XC2522基因的克隆
[0028]根据XC2522基因序列，利用Vector NTI软件设计引物对C2522-F (B) /C2522-R (H)(BP aaaggatcctttccggtcccgccggaagtga/gggaagcttcagcccaaggccgttacgattc),以十字花科黑腐病菌8004菌株总DNA为模板，用PCR法扩增该基因片段序列，并将其克隆至克隆载体pK18mobsacB中，获得重组质粒pK2522,经BamHI/Hindlll双酶切验证正确后进行测序；将测序验证正确的XC2522基因片段克隆至穿梭载体pLAFR6中，获得了含该基因的重组质粒PL2522，经PCR法验证正确。请参见图1，其中M为IOObp标准DNA(片段大小从大到小依次为 3kb，2kb，1.5kb, 1.2kb, lkb，0.9kb，0.8kb，0.7kb) ；1 为 XC2522 基因 PCR 产物；2 为酶切验证 pK2522 (BamHI/Hindlll) ;3_4 为 PCR 验证 pL2522 重组质粒。
[0029]( 二)XC2522基因缺失突变体的构建
[0030]根据XC2522基因序列，利用设计引物对D2522_LF/D2522_LR(即aaaggatcccaagaggttctggcgccggtc/aaatctagatgcgccctgctcatccgttcg)和 D2522-RF/D2522-RR(即 gggtctagactgtatctgcccaagaagtga/gggaagcttagatcatcgaacacactggct),以Xcc8004菌株总DNA为模板，用PCR法扩增该基因两旁侧片段序列(片段大小分别为718bp和722bp)，并将其先后克隆至pK18mobsacB中，获得重组质粒pKD2522，经PCR验证和BamHI/Hindlll双酶切验证正确后进行测序；将测序验证正确的pKD2522通过三亲接合导入Xcc8004菌株中，在加卡那霉素NYG平板上筛选获得整合中间体，然后在含5%蔗糖NYG平板(不加抗生素)上筛选获得缺失突变体D2522，经PCR验证正确。请参见图2，其中M 为 IOObp 标准 DNA (片段大小从大到小依次为 3kb，2kb，1.5kb, 1.2kb, lkb，0.9kb，0.8kb,
0.7kb) ；1为XC2522左旁侧PCR扩增片段；2为XC2522右旁侧PCR扩增片段；3为PCR验证pKD2522(引物 D2522-LF/D2522-RR) ；4 为酶切验证 pKD2522 (BamHI/Hindlll) ；5~6 为 PCR验证 Xcc8004 和 D2522 (引物 D2522-LF/D2522-RR)。将 pL2522 三亲导入 D2522，获得互补菌株C2522。
[0031](三)XC2522基因突变体的过敏反应(HR)检测
[0032]实验所用非寄主植物为辣椒苗(种名为Capsicum annuum cV.ECff-1 OR)，接种方法为压渗法。
[0033]将辣椒栽种于 室外约2到3个月至成株期后，选取六至八叶龄的全展叶片供试；
[0034]接种供试的Xcc菌株至加有相应抗生素的NYGB过夜培养至OD6tltl = 1.0以上；收集ImL的菌液，用ImL无菌水清洗并重悬；调OD600至0.3，用无针头的针筒吸取10 μ L菌液压渗到辣椒叶片背面的叶肉中，形成一个可见的浸润斑；接种后保湿80%并置于荧光灯下按昼16h/夜8h的时间分配照射，24h后观察结果并为结果照相；正对照选用十字花科黑腐病菌野生型8004菌株，负对照用avrBsl缺失突变体。
[0035]结果显示，XC2522缺失突变体过敏反应(HR)基本丧失，互补菌株能基本恢复野生型表型。请见图3，其中A为野生型Xcc8004 ；B为avrBsl缺失突变体；C为XC2522缺失突变体D2522 ；D为互补菌株C2522。
[0036](四)XC2522基因突变体的致病性检测
[0037]实验所用寄主植物为满身红萝卜苗(种名为Raphanus sativus var.radiculacv.Manshenhong)，所用接种方法为剪叶法。
[0038]将Xcc8004野生型菌株、XC2522基因缺失突变体D2522和互补菌株C2522在28°C下用NYGB培养基进行液体培养15至18h，用NYGB稀释到0D600 = 0.001，用灭过菌的剪刀在菌液浸泡5秒后，在健康叶片距叶尖I至2cm垂直叶脉的方向剪到中轴处，停留5秒，被接种的植物在25至30°C培养一周后观察结果。
[0039]该致病试验表明，XC2522基因的缺失突变体D2522致病性显著降低，互补菌株C2522能基本恢复野生型表型。请参见图4。
【权利要求】
1.一种与十字花科黑腐病病菌致病相关的编码脂蛋白的基因在防治植物十字花科黑腐病病害中的用途，所述基因是编码序列表中序列2所示蛋白质的DNA序列。
2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述编码脂蛋白的基因是序列表中序列I所示的DNA序列。
【文档编号】C12N15/31GK103966239SQ201410212306
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月20日 优先权日:2014年5月20日
【发明者】姜伯乐, 何勇强, 唐纪良, 杨丽超, 王凛, 阳丽艳, 周乐, 杭小红 申请人:广西大学