专利名称：人冠心病易感基因-脂蛋白a基因拷贝数变异检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因拷贝数的检测方法，尤其涉及一种与冠心病相关 的人脂蛋白a的基因拷贝数的检测方法，还涉及一种检测脂蛋白a的基因 拷贝数的试剂盒。
背景技术：
随着后基因组时代的来临，在功能基因组学研究中，定量基因分析占 有非常重要的地位。实时荧光定量PCR技术的问世，为后基因组时代疾 病相关基因的研究提供了一个极好的技术平台。实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR)通过设计针对目的基因的特异性引物和 探针，优化反应体系和反应循环参数，可同时检测大量样本，节省实验时 间和反应成本，为基因定量检测和准确定量疾病相关基因的表达提供有效 的技术手段，实现对人类和动物疾病的早期诊断与基因分期、分型，以及 对人类肿瘤转移的早期发现及预后判断，在临床上有广阔的应用前景。
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号累积，实时监测整个PCR进程及连续分析扩增相关的荧光信号， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR反应过程中产生 的DNA拷贝数呈指数方式增加，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不 再以指数方式生成模板，进入平台期。在PCR反应早期，产生的荧光水平 不能与背景明显地区别，而后，荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期。因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，
并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检样本进行比较，在实时
荧光定量PCR反应的指数期，首先需设定一个荧光信号的循环阈值 (cycling threshold, CT)，即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值 时所经历的循环数。以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号，如果检测到的荧光信号达到设定的阈值时被认为是真正的信号，它 所经历的循环数即为CT值。研究表明每个模板的CT值与该模板的起始 拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用己知起 始拷贝数的标准品可做出标准曲线，因此只要获得未知样品的CT值，即 可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
在实时荧光定量PCR技术中，目前应用最普遍的荧光化学方法是水解 探针法(hydrolysis probes)。水解探针法是一种利用标记荧光染料的基 因特异寡核苷酸探针杂交扩增产物的检测方法。通常使用Taq聚合酶的5' 核酸外切酶活性来水解与目的序列杂交的探针在PCR扩增体系中，溶液 中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导 下，被扩增物沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，T叫酶的5， 外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)，裂解双 链DNA5'端核苷酸，释放出单个寡核苷酸。基于Taq酶的这种活性，设 计合成了一个能与PCR产物杂交的探针。目前，应用最广泛的是Taqman探 针。Taqman探针是一段特异性的寡核苷酸，其5，端标记荧光发射基团， 也称报告基团(r印orterR)， 3，端标记淬灭基团(quencher Q)，其序列 与模板DNA中扩增序列的一段完全互补。常用的报告基团包括FAM、 VIC、TET、 J0E、 HEX(R) 、 CY3、 CY5，淬灭荧光基团为MGB、 TAMRA和DABCYL(Q)。 当探针保持完整时，5'端荧光发射基团吸收能量后将能量转移给临近的 3'端淬灭基团，发生荧光共振能量转移，3'端淬灭基团抑制5'发射基 团的荧光发射，故检测不到该探针5'端荧光基团发出的荧光。在PCR的 退火期，探针与引物所扩增序列内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引 物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，当到达探针处，Taq酶发挥5' 3' 核酸外切酶活性而发生置换切断探针，使报告荧光基团和淬灭基团分离， 淬灭基团的抑制作用消失，荧光发射基团脱离3'端淬灭基团的屏蔽，接 受光刺激发出荧光信号。这时荧光探测系统便会检测到光密度增加。模板 每复制一次，就有一个探针被切断，同时伴有一个荧光信号的释放。由于 理论上被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度 和被释放的荧光基团的数目也是正比关系，因此荧光信号的累积与PCR 产物完全同步。在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量， 可推断出模板最初的含量，对模板进行准确定量。由于模板较短时扩增效 率较高，故扩增长度一般以50 bp 150 bp为佳。
在实时荧光定量PCR中，模板定量有2种方法相对定量法和绝对定 量法。相对定量法是指在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变 化；绝对定量法是指用已知的标准曲线来推算未知样本的量。绝对定量法 一般采用外标准品定量的制备来实现，质粒DNA和体外转录的RNA常作为 绝对定量的标准品。将标准品(质粒DNA)稀释成不同浓度的样品，并作 为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT 值(荧光信号阈值)为纵坐标，绘制标准曲线。对未知样品进行定量时，200810043596.8根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中计算出样品的拷贝数。
脂蛋白a[Lp (a)]是挪威遗传学Kara Berg在1963年首先发现的，1987 年，McLean等发现Lp(a)与纤维蛋白原之间具有结构高度同源性及交叉免 疫反应性，自此Lp(a)与动脉粥样硬化的关系即成为研究的热点，被认为 是一种新的致动脉粥样硬化性脂蛋白，是冠心病等动脉粥样硬化性疾病的 独立危险因素之一，并促进粥样硬化血栓形成及进展。
Lp(a)是一种特殊脂蛋白颗粒，主要由LDL成分和载脂蛋白a组成。 其颗粒大小与遗传因素有关，Lp(a)与溶解纤维蛋白的纤溶酶原具有同源 性，干扰纤溶酶原在纤溶过程中的作用，参与动脉粥样硬化形成和发展的 整个过程，是动脉粥样硬化和血栓形成的独立危险因素。动脉粥样硬化风 险社区研究提示高Lp(a)血症(Lp(a)X).3g/L)者患缺血性脑卒中的风 险比低Lp (a)者(Lp (a) <0. lg/L)高79%。 Barbara等对429名I型糖尿病 病人进行长达6年的前瞻性研究，结果表明高Lp (a)血症(Lp (a)》0. 3g/L) 是冠心病的独立危险因素。高Lp(a)血症的糖尿病患者与血Lp(a)正常 (Lp(aX0.3g/L)的糖尿病患者相比，其患冠心病的风险是后者的2倍 (服二2. 23， 95%CI: 1.28-3. 87， P=0. 004)。现有研究认为血Lp(a)水平是 由一个基因(lipoprotein (a) ， LPA)的主要效应和多基因的微效作用所 决定。Wong等运用全基因组的比较基因组杂交技术(whole-genome tiling BAC array, CGH)证实了人类基因组部分染色体的DNA片段存在重复和缺 失，涉及了 1000多个基因，其中大部分基因与疾病相关，包括LPA基因。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测冠心病的基因拷贝数的方法。
为了解决以上技术问题，本发明提供的应用实时荧光定量PCR技术检
测冠心病的基因拷贝数的方法，其特征在于，包括如下步骤
(1) 、抽提与纯化人外周血基因组DNA;
(2) 、制备阳性质粒标准品；
(3) 、建立Taqman荧光定量PCR检测方法。
本发明还提供了一种利用上述方法检测人脂蛋白a基因拷贝数的试 剂盒以及该方法和试剂盒在冠心病预警诊断和高危人群早期筛査中的应 用。
本发明的冠心病的基因拷贝数的检测方法能达到如下效果
1、 本发明根据目的基因LPA和内参基因白蛋白基因(ALB)的非特 异性管家序列，设计相应的引物和Taqman探针，利用T叫man特异性探针 对定量分子进行识别，达到靶序列由引物和探针双重控制的目的。
2、 在人体基因组DNA和质粒中分别进行重复性检验提示组内及组间 变异系数均在合理范围(<5%)，体现了 Taqman实时荧光定量PCR对于临 床检验反应特异性好、准确性高、线性关系好的优势。
3、 对于样本浓度和变异系数的相关性分析得出人基因组DNA浓度为 2ng/uL时，两基因变异系数最小，差值也最小，提示2ng/u L是临床样 本检验较为合适的浓度。
4、 PCR的扩增和检测在同一管中同时进行，实时监测，减少了污染 的可能性，反应的试剂均具备尿嘧啶糖苷酶(UNG/DUTP)防污染技术， 有效防止了来自扩增产物的污染，降低假阳性率，保证结果的准确性。5、本发明的针对目的基因LPA和内参基因ALB的Taqman实时荧光 定量PCR系统有较高的临床检验价值，为探索LPA基因拷贝数变异与冠心 病的关系奠定了实验基础。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。
图1是LPA基因和ALB基因PCR扩增条带电泳结果图2是LPA基因和ALB基因阳性单克隆菌落PCR扩增条带电泳结果
图3是实时荧光定量PCR检测体系对LPA基因按10倍等拷贝数梯度 稀释质粒的扩增曲线图4是根据LPA基因扩增曲线建立的标准曲线图5是实时荧光定量PCR检测体系对ALB基因按10倍等拷贝数梯度 稀释质粒的扩增曲线图6是根据ALB基因扩增曲线建立的标准曲线图。
具体实施例方式
实施例l人脂蛋白(a)基因拷贝数荧光定量检测体系建立
1. 人基因组DNA抽提与纯化
抽取人外周静脉血lOmL，置于含有ACD(枸橼酸8g/L，枸橼酸钠 22g/L，葡萄糖24.5g/L)的抗凝管中，振荡混匀后提取DNA。采用 FlexiGene DNA Kit (250) (QIAGEN， Cat. No. 51206)试剂盒抽提人外周血基 因组DNA。
2. 阳性质粒标准品的制备2.1. PCR扩增目的基因
参照GeneBank收录的目的基因LPA和内参基因ALB的基因组全序列， 选择保守区域，采用美国ABI Primer Express3. 0实时荧光定量PCR引物 设计软件，分别扩增89bp(LPA)和139bp(ALB)的片段。其中LPA探针选自 SEQ ID NO: 1的序列，其正向引物包括SEQ ID NO: 3序列，反向引物包 括SEQ ID NO: 4序列；ALB探针选自SEQ ID NO: 2的序列，其正向引物 包括SEQ ID NO: 5序列，反向引物包括SEQ ID NO: 6序列。所扩增片 段为非特异性管家序列，不存在任何已报道的基因内结构变异。在PCR 反应体系中使用不同的Mg2+、探针、引物的浓度以确定最佳的反应体系 PCR反应总体积25 u L，体系组分为1. 5 y L 10 X buffer、 3 u L betaine、 1. L 25匪ol/L MgCl2、 0. L 10mmol/L dNTPs、 20mmol/L上下游引物 各0. 2 u L、0. 12 u L Taq DNA聚合酶、7. 08 u L高压灭菌双蒸水、1 u L 20ng/ ii L DNA模板。PCR反应条件95。C预变性3分钟，95。C变性30秒，60 'C退火30秒，72匸延伸40秒，共40个循环。PCR结束后用1. 5%琼脂糖 凝胶检测扩增结果，具体结果如图l所示。PCR产物用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)纯化。
2. 2.采用氯化钙制备新鲜大肠杆菌DH5a感受态细胞
1) 于新鲜平板上37。C培养大肠杆菌DH5a 16-20小时。
2) 从隔夜培养的平板上挑取一个单菌落(直径2-3mm)，转到一个含有 100mlLB或SOB培养基的1L烧瓶中。3) 于旋转摇床上37i:， 300rpm剧烈振摇培养3小时，每隔30分钟 测量OD600值来监测培养物的生长情况，保持0D600=0. 35 0. 4
(活细胞数不超过108细胞/mL)。
4) 用冰预冷一次性无菌50mL聚丙烯管(Falcon 2070)。
5) 无菌条件下将细菌转移到预冷的聚丙烯管中，冰上放置10分钟，
使培养物冷却至ox:。
6) 于4。C 4000rpm离心IO分钟，回收细胞。
7) 倒出培养液，将管倒置1分钟使残留的培养液流尽。
8) 取10mL用冰预冷的0. lmol/L氯化钙重悬沉淀的细胞，冰浴30 分钟。
9) 于4。C以4000rpm离心IO分钟，再次回收细胞。
10) 再次倒出培养液，将管倒置1分钟使残留的培养液流尽。
11) 加入100 u L用冰预冷的0. lmol/L氯化钙重悬细胞，冰浴2小时 后，4'C保存备用。
2. 3.重组DNA的转化
在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5uL: Pmd 18-T Simple Vector氺l luL， insert D膨3 0.1-0.3 pmol，高压灭菌双蒸7夂方口至5 u L，加入5uL (等量)的Ligation Mix， 16。C反应30分钟。10uL连接 产物加入到100 ii L感受态细胞中，冰中放置30分钟。然后将离心管转入 42。C水浴，热冲击45秒后，迅速将其放在冰上1分钟静置。在离心管中 加入S0C培养基890uL，枪头混匀，37°C、 150rpm温和摇振60分钟。将 200u L转化菌液均匀地涂布于LB/Amp/X-Gal/IPTG平板上。37。C倒置培养过夜，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。挑选白色菌落进行鉴定。PCR
反应总体积15uL，体系组分为1.5uL10Xbuffer、 0. 12uL5腿ol/L dNTPs、 3 u L betaine、 1. 5 ii L 25mraol/L MgCl2， 5 mmol/L上下游引物各 0. 15uL、 11.85uL高压灭菌双蒸水。用经灭菌的10uL枪头挑取白色菌 落，迅速地使挑取物溶入上述混合液中。在沸水上温育10分钟。将样品 冷却至室温，离心数秒，然后加入TaKaRarTaq酶0.25iiL。按以下条件 进行PCR反应95。C预变性5分钟，95。C变性30秒，6(TC退火30秒， 72。C延伸30秒，共40个循环。取PCR产物1 y L，点样于含EB(O. 5mg/L) 的2g/kg琼脂糖凝胶电泳，电压150V，电泳15min，紫外线透视仪下对凝 胶进行观察和摄影。具体结果如图2所示，其中，1、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 10为ALB基因菌落PCR扩增条带(289bp) ， 11、 12、 15、 16为LPA基 因菌落PCR扩增条带(239bp) ， 2、 9、 13、 14为不纯条带。 2.4.阳性克隆质粒抽提
1) 取1.5-5mL菌液，于室温下10， 000rpm离心1分钟以沉淀菌种。
2) 弃去培养基，往沉淀中加入250uL的ZL-I/RNaseA混和液，漩 涡振荡使细胞完全重新悬浮。
3) 往重悬混和液中加入250 u L ZL-II和10u蛋白酶混和物，轻轻翻 转试管4-6次混和溶液，获得澄清的裂解液。
4) 往上述混和液中加入350uL ZL-III，温和地上下颠倒离心管数 次，直至形成白色絮狀沉淀。于室温下10，000rpm离心10分钟。5) 取一干净的Mu-Pu质粒微量分离柱装在2mL收集试管上，小心吸 出上清，并将其转置于柱子內，确保转至柱內的上清中没有细胞 杂质沉淀。
6) 室温下10，000rpm离心l分钟，使裂解液完全流过柱子。
7) 弃去离心甩出液，加入500iiL的ZL缓冲液到柱子上。
8) 室温下10，000rpm离心l分钟，除去残余的蛋白质。
9) 弃去收集液，加入750 u L用乙醇稀释的DNA洗涤缓冲液洗涤柱子， 室温10， OOOrpm离心1分钟，弃去洗涤液。
10) 重复上述步骤，再用750 u L的DNA洗涤缓冲液洗涤柱子一次。
11) 室温下10， OOOrpm离心空柱1分钟，以甩干柱子基质。
12) 将柱子置于一干净的1.5mL小离心管中，直接加入50-lOOliL灭 菌去离子水至柱子基质上，10， 000rpm离心1分钟以洗脱出DNA。
13) 应用核酸蛋白分析仪测定D260nm，并计算提取质粒的含量，质粒 -20。C保存备用。
14) 将抽提出的DNA进行测序鉴定。
3.Taqman荧光定量PCR检测方法的建立
使用ABI7300实时荧光定量PCR仪，在PCR反应体系中使用不同的 Mg2+、探针、引物的浓度以确定最佳反应体系PCR反应总体积25uL，体 系组分为5tiL 5 X buffer 、 5yL betaine、 0. 5 ii L 250腿ol/L MgCl2、 0. 5 u L 10画1/L dNTPs、 2. 5 y mol/L LPA基因禾口 ALB基因上下游引物各 0. 5 y L、 20 u mol/L LPA基因禾口 ALB基因Taqman荧光探针各0. 2 y L、 0. 25 u L T叫DNA聚合酶、1. 35u L高压灭菌双蒸水、DNA模板10u L。其中LPA探针选自SEQ IDN0: 1的序歹U，其正向引物包括SEQ ID NO: 3序列， 反向引物包括SEQ ID NO: 4序列；ALB探针选自SEQ ID NO: 2的序歹ij， 其正向引物包括SEQ ID NO: 5序列，反向引物包括SEQ ID NO: 6序列。 反应条件9(TC预变性1秒，95。C变性2分30秒；95。C退火15秒；60 r延伸l分钟，共40个循环。
4. 标准曲线的建立
(1) 根据公式拷贝数=(浓度乂 1023 乂6.02)/(分子质量乂109)，应用高 压灭菌双蒸水将不同浓度的LPA质粒和ALB质粒稀释至等拷贝数；
(2) 将等拷贝数的LPA质粒和ALB质粒振荡混匀作为模板，以105、 104、 103、 102、 IO倍梯度稀释，按步骤3所述体系在ABI7300荧光定量PCR仪 上扩增检测，每份模板重复三次，根据所得的扩增曲线建立相应的标准曲 线。
5. 样本检测
PCR反应总体积25 u L，体系组分为5 u L 5 Xbuffer、 5 u L betaine、 0. 5 u L 250画1/L MgCl2、 0. 5 u L 10画1/L dNTPs、 2. 5 y mol/L LPA基因和ALB基因上下游引物各0. 5 u L、 20 u mol/L LPA基因和ALB基 因Taqman荧光探针各0. 2 u L、 0. 25 u L Taq DNA聚合酶、1. 35 u L高压 灭菌双蒸水、DNA模板10uL。反应条件90。C预变性1秒，95。C变性2 分30秒；95。C退火15秒；6(TC延伸1分钟，共40个循环。样本基因组 DNA浓度为2ng/uL，阴性对照的模板为高压灭菌双蒸水，标准品为实施 例1中所述的浓度梯度的质粒。每份模板重复三次，根据标准品的扩增曲 线建立相应的标准曲线，计算样本LPA基因拷贝数。实施例2 Taqman实时荧光定量PCR体系稳定性检测 1.对浓度20ng/u L的人基因组DNA按10倍浓度梯度稀释后，按照 实施例l步骤5对各浓度梯度进行检测，结果显示(见表l):各浓度组 CT值变异系数均在合理范围(<5%)，组间离散度小，表明人基因组DNA 在2-20ng/txL的浓度范围内均可按以上方法进行扩增。其中，在浓度为 2ng/iiL组，LPA和ALB的变异系数最小(0. 35 ^0.4)，差值最小，提 示2ng/ u L是人基因组DNA检测较为合适的浓度。
浓度循环阈值(CT)变异系数
(ng/uL)123平均值(标准差)ccv%)
20LPA21. 57621.41621.89021. 627(0. 241)1.11
ALB23.06322. 57023. 08822. 907(0, 292)1. 272 .LPA25.29725.12625.17325.199(0. 088)0. 35
ALB26.37626.21726.17426.256(0. 106)0. 40
0.2LPA28.76628.45028. 73228.649(0. 173)0. 60
ALB29.85729.49529. 22229.525(0.319)1.08
0. 02LPA32. 04731. 97731.54731.857(0. 565)1. 77
ALB32. 77432. 27431.64732.232(0. 271)0. 84
表l
2.对拷贝数107 u L的质粒标准品按10倍等拷贝数梯度稀释后， 按照实施例1步骤5对各浓度梯度进行检测，结果显示(见表2):各浓 度组CT值变异系数均在合理范围(<5%)，组间离散度小，表明在102-107 li L的范围内建立的标准曲线稳定性好,可用于LPA基因拷贝数变异的检拷贝数循环阈值(CT)变异系数
(pg/yL)123平均值(标准差)(CV90
105LPA19. 76719.70219. 76219.744(0. 362)1.83
ALB22. 24622, 07122. 00122. 106(0.126)0. 57
104LPA23. 0222.86522.90422. 930(0.081)0. 35
ALB25. 25925. 07225. 03125.121(0. 122)0. 49
103LPA26. 74026.45926. 48526. 561(0. 155)0. 58
ALB29. 24028.72028.77528.912(0. 286)0. 99
102LPA29. 85529.94130.14529. 980(0. 149)0. 50
ALB32. 46832. 04232. 29732. 269(0. 214)0. 66
表2
3.随机挑选3例人基因组DNA样本，测定，;OD260值后用高压灭菌水稀释至浓度为2ng// U L，按照实施伊J 1步骤5进行检测，结果显示(表3):各样本CT值变异系数均在合理范围(<5%)，组间离散度小，稳定性高。样品循环阈值(CT)变异系数
(2ng/wL)123平均值(标准差)(cn)
1LPA23.68923.60823.68423.66(0. 045)0. 19
ALB25.68225. 79126.01625. 83(0. 170)0. 66
2LPA22. 83122. 67922. 76422. 758(0. 076)0. 34
ALB24.91424.89624. 94724. 919(0. 026)0. 10
3LPA24. 05324.11723. 96124. 044(0. 078)0. 33
ALB26. 09126. 09625. 89426. 027(0. 115)0.44
表3
本发明对于样本拷贝数的定量方式采用绝对定量法。将样本PCR产物 克隆至载体上，抽提质粒后经过测量浓度和拷贝数建立标准曲线。因质粒 的拷贝数可通过浓度换算，故可利用已知拷贝数的标准曲线来推算未知样 本的量。因质粒是环状DNA，不易降解，故具有准确、稳定的优点。本发 明建立的标准曲线参数显示双引物双探针扩增条件下，单基因标准曲线相关系数r=0. 999，表明所建立的标准曲线可准确计算样本DNA的绝对含 量及相对拷贝数。
本发明选择人ALB基因为内参基因，利用双引物双探针法建立适合目 的基因(LPA)的Taqman实时荧光定量PCR检测方法，通过比对不同的反 应组分，优化反应条件，减少双引物竞争底物降低基因扩增效率的影响。 通过计算标准曲线参数以及重复样本的变异系数，评估检测方法的可行 性。该方法体系的建立对于今后应用Taqman实时荧光定量PCR检测疾病 相关易感基因具有重要参考价值。本发明的人脂蛋白(a)基因拷贝数的 检测与冠心病具有密切相关性，且本发明的检测方法及试剂盒对冠心病的 预警诊断和高危人群早期筛查方面能发挥重要作用，有利于鉴别冠心病高 风险个体，尽早实施预防、监控、干预和/或治疗，尽可能避免发病或延 迟发病。
实施例3人脂蛋白(a)基因拷贝数变异与冠心病的相关性研究
1. 从上海交通大学医学院附属瑞金医院心脏科2006年11月至 2007年5月住院病人中选取稳定性心绞痛患者203例和对照组207名， 采用实施例l中的检测方法检测人脂蛋白(a)基因拷贝数变异情况。
2. 利用SPSS13. 0 (SPSS Inc. ， Chicago, USA)进行统计分析。研 究共检测到Nu^1、 2、 3三种人脂蛋白(a)基因拷贝数变异，其中N^A二1 为单倍体，N^=2、 3为多倍体，人脂蛋白(a)基因拷贝数变异在稳定性 心绞痛组和对照组的分布频率具有显著差异(义^=13. 614，代1X10—3)， 稳定性心绞痛组单倍体分布频率显著低于对照组(26.1% ^43.5%)，单 倍体相对比值比0^0.459(95。/。CI:0. 303-0. 697)。校正发病年龄、性别、体重指数、收縮压、舒张压、血糖、血脂、吸烟、血Lp(a)水平等相关因 素，经多因素Logistic回归分析发现人脂蛋白(a)基因单倍体相对比 值比0R=0. 27(95%CI:0. 15-0. 489，尸<1 X 10—3)。结果表明，人脂蛋白(a) 基因拷贝数变异与稳定性心绞痛发病相关，稳定性心绞痛患者单倍体分布 频率显著降低，人脂蛋白(a)基因单倍体可能是稳定性心绞痛的保护因 素。进一步比较人脂蛋白(a)基因单倍体和多倍体携带者高Lp(a)血症
(血Lp(a)^0.3g/L)与稳定性心绞痛的相关性后发现单倍体携带者稳 定性心绞痛组高Lp(a)血症比例与对照组相似(36.7% ^40. 7%，尸〉 0.05);多倍体携带者稳定性心绞痛组高Lp(a)血症比例显著高于对照组
(39.4% ^21. 7%， /M). 028)。校正发病年龄、性别、收縮压、舒张压、 体重指数、血脂、血糖、吸烟等相关因素，经多因素Logistic回归分析 发现多倍体携带者，高Lp(a)血症的相对比值比0R=2.246
(95%CI: 1.09-4. 631)。结果表明，人脂蛋白(a)基因单倍体、多倍体拷 贝数分布频率不同影响了稳定性心绞痛患者高Lp(a)血症的发生率。序列表
〈110〉上海交通大学医学院附属瑞金医院
〈120〉人冠心病易感基因一脂蛋白a基因拷贝数变异检测方法和试剂盒
〈160〉 6
〈210〉 1 <211〉 26 〈212〉 DNA 〈213〉 artificial
〈400〉 1
TAGGTTGATG CTTCACTCTG TCTCCC 26
<210〉 2 〈211〉 27 〈212〉 DNA〈213> artificial <400> 2
CCTGTCATGC CCACACAMT CTCTCCC 27
<210> 3 〈211〉 23 〈212〉薩 <213> artificial
〈400〉 3
CTTGGATTGA GGGAATGATG AGA 23
〈210〉 4 <211〉 23 〈212〉 DNA <213〉 artificial<400> 4
CCTTACCCAC GTTTCAGCTT CTA 23
<210> 5 〈211〉 22 〈212〉 DNA 〈213〉 artificial
〈400〉 5
GCTGTCATCT CTTGTGGGCT GT 22
〈210〉 6 〈211〉 21 〈212〉 DNA 〈213〉 artificial
<400> 6ACTCATGGGA GCTGCTGGTT C 2权利要求
1、一种人脂蛋白a的基因拷贝数的检测方法，其特征在于，采用实时荧光定量PCR方法，包括如下步骤(1)抽提与纯化人外周血基因组DNA；(2)制备阳性质粒标准品；(3)建立Taqman荧光定量PCR检测方法。
2、 根据权利要求1所述的人脂蛋白a的基因拷贝数的检测方法，其 特征在于，步骤(3)所述建立Taqman荧光定量PCR检测方法，以脂蛋白 a基因为目的基因，白蛋白基因为内参基因。
3、 根据权利要求2所述的人脂蛋白a的基因拷贝数的检测方法，其 特征在于，步骤(3)所述建立Taqman荧光定量PCR检测方法包括设计 探针和引物，建立扩增体系和建立标准曲线。
4、 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述设计探针和 引物为针对所述的脂蛋白a基因和白蛋白基因分别设计合成2组Taqman 探针及引物。
5、 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述脂蛋白a基 因的探针选自SEQ ID NO: 1序列，或其互补序列，或与SEQ ID NO: 1 及其互补序列至少70%同源性的序列；LPA探针正向引物包括SEQ ID NO: 3序列，或其互补序列，或与SEQ ID NO: 3及其互补序列至少70%同源性 的序列；反向引物包括SEQ ID NO: 4序列，或其互补序列，或与SEQ ID NO: 4及其互补序列至少70%同源性的序列。
6、 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，LPA探针选自SEQID NO: l序列，LPA探针正向引物包括SEQ ID NO: 3序列，反向引物包 括SEQ ID NO: 4序列。
7、 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述脂蛋白a基 因的探针的荧光标记选择FAM为荧光报告基团，白蛋白基因的探针的荧光 标记选择VIC为荧光报告基团，两者的淬灭基团均为TAMRA。
8、 根据权利要求3所述的人脂蛋白a的基因拷贝数的检测方法，其 特征在于，所述的建立标准曲线包括如下步骤将标准品稀释成不同浓度的样品，并作为模板进行PCR反应； 以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制 标准曲线；对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中 计算出样品的拷贝数。
9、 一种利用权利要求1所述的方法检测人脂蛋白a的基因拷贝数的 试剂盒。
10、 权利要求1所述的检测方法和权利要求9所述的试剂盒在冠心 病预警诊断和高危人群早期筛查中的应用。
全文摘要
本发明涉及基因拷贝数实时荧光定量PCR检测，公开了一种冠心病相关的人脂蛋白a基因拷贝数检测方法及其试剂盒，该方法包括如下步骤(1)抽提与纯化人外周血基因组DNA；(2)制备阳性质粒标准品；(3)建立Taqman荧光定量PCR检测方法。以脂蛋白a基因为目的基因，白蛋白基因为内参基因，并利用双引物双探针法建立适合目的基因的定量PCR检测方法。还建立标准曲线，并通过计算标准曲线参数以及重复样本的变异系数，评估检测方法的可行性。该方法及试剂盒在冠心病预警诊断和高危人群早期筛查方面能发挥重要作用，有利于鉴别冠心病高风险个体，尽早实施预防、监控、干预和/或治疗，尽可能避免发病或延迟发病。
文档编号C12Q1/68GK101619346SQ20081004359
公开日2010年1月6日 申请日期2008年7月4日 优先权日2008年7月4日
发明者吴志俊, 盛海辉, 肖华胜, 玮 金 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院