一种半定量竞争pcr检测基因拷贝数的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法 及其应用。
【背景技术】
[0002] 基因拷贝数是指某一种基因或某一段特定的DNA序列在基因组中出现的数目。随 着转基因以及基因敲除技术的快速发展，许多转基因动植物以及基因敲除鼠等应运而生， 就基因敲除鼠而言，实验人员需要通过拷贝数的鉴定来判断该基因敲除鼠为纯合子或杂合 子，以便于进一步的科学研究。而对转基因植物而言，因为转基因植物的安全性与有效性与 外源基因拷贝数密切相关，所以鉴定转基因植物外源基因拷贝数对保护生态系统以及人类 的健康很必要。拷贝数变异（copy number variations, CNVs)广泛存于基因组中，与一些 遗传性疾病的发生相关，对人类抗病性和易感性表型等变异有重要影响。此外，对某些病毒 感染性疾病的早期诊断可以通过鉴定病毒某段基因的拷贝数来实现，从而诊断出受测者是 否有病毒感染以及病毒感染的严重程度。
[0003] 因此，有必要建立一种快速、准确和低成本的基因拷贝数检测技术。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法，该 方法通过观察或计算待测基因条带强度与内对照基因琼脂糖凝胶电泳条带强度的比值，得 到待测基因的相对拷贝数。该方法不需要构建同源或异源的竞争子；也不需要专门的实时 定量PCR仪来检测实验结果，因此，本发明提供的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法更 加快速、简便、低成本。此外，本发明还提供了一种半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法 的应用。
[0005] 第一方面，本发明提供了一种半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法，包括以下 步骤：
[0006] (1)提供待测样品
[0007] 所述待测样品中含有待测基因和内对照基因，所述内对照基因在所述待测样品所 属种的基因组中具有相同的拷贝数；
[0008] (2)提供多重竞争性PCR引物
[0009] 所述多重竞争性PCR引物由分别针对待测基因和内对照基因的设计的至少一对 待测基因引物和至少一对内对照基因引物组成，
[0010] 所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段间的长度差异能被琼脂糖 凝胶电泳分辨；
[0011] (3)多重竞争性PCR反应
[0012] 配置多重竞争性PCR反应体系，进行多重竞争性PCR反应；
[0013] (4)结果分析
[0014] 对多重竞争性PCR反应所产生的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，观察或计算 待测基因条带强度与内对照基因条带强度的比值，得到待测基因的相对拷贝数。
[0015] 本发明提供了一种半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法，该方法直接从基因组 DNA中任意挑选出所有待测样本都含有的相同拷贝数的DNA片段作为内对照基因，并设计 针对内对照基因与待测基因的多重竞争性PCR引物，使得该内对照基因与待测基因的PCR 扩增产物之间的长度差异能采用琼脂糖凝胶电泳进行区分，通过观察或计算待测基因条带 强度与内对照基因条带强度的比值，得到待测基因的相对拷贝数。相对现有的竞争性PCR 技术，该方法不需要构建同源或异源的竞争子；相对于现有的定量PCR技术，该方法不需要 专门的实时定量PCR仪来检测实验结果，因此，本发明提供的半定量竞争PCR检测基因拷贝 数的方法更加快速、简便、低成本。
[0016] 优选地，所述步骤（2)中，所述多重竞争性PCR引物的长度范围为18~23bp，所述 多重竞争性PCR引物之间的TM值相差不超过3°C。
[0017] 优选地，所述步骤（2)中，所述多重竞争性PCR引物由1~3对待测基因引物和1 对内对照基因引物组成。
[0018] 进一步优选地，所述步骤（2)中，所述多重竞争性PCR引物由1对待测基因引物和 1对内对照基因引物组成。
[0019] 本发明采用的方法在多重竞争性PCR引物优选为1对待测基因引物和1对内对照 基因引物的组合的情况下，可优选采用普通的PCR体系以及普通的PCR程序进行PCR扩增， 并调节PCR体系中待测基因引物和内对照基因引物的摩尔比，所述摩尔比优选为1~3:1， 进一步优选为2:1。
[0020] 本发明采用的方法在多重竞争性PCR引物优选为多对待测基因引物和多对内对 照基因引物的组合的情况下，可调节多重PCR体系中待测基因引物和内对照基因引物的摩 尔比，所述摩尔比优选为1~3:1，进一步优选为2:1，其中，待测基因引物之间的摩尔比优 选为1 :1，内对照基因引物之间的摩尔比优选为1 :1。
[0021] 优选地，所述步骤（2)中，所述多重PCR引物对应的扩增产物的长度范围为100~ 500bp，不同扩增产物片段的长度差异为50~100bp。
[0022] 扩增产物在100~500bp长度范围内，且长度差异为50~100bp的范围内，能保 证各DNA片段的能被琼脂糖凝胶电泳区分开的前提下，使得各DNA片段具有相近的扩增效 率。
[0023] 优选地，所述步骤（3)中，所述多重竞争性PCR反应体系中，所述待测基因引物和 内对照基因引物之间的摩尔比为1 :1~3 :1。
[0024] 进一步优选地，所述步骤（3)中，所述多重竞争性PCR反应体系中，所述待测基因 弓丨物和内对照基因引物之间的摩尔比为2 :1。
[0025] 优选地，所述步骤（1)中，所述待测样品为Bcl-3基因敲除鼠的基因组DNA样品。
[0026] 优选地，所述Bcl-3基因敲除鼠的基因组DNA样品的制备方法是采用碱裂解法提 取基因组DNA。
[0027] 本发明提供的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法对待测DNA样品中的待测基 因的拷贝数进行相对定量，不需要调整各待测样品中起始DNA的用量，因此，本发明提供的 发明对待测DNA样品的质量和含量要求比传统的定量PCR技术要求更宽松，可以采用快捷 的碱裂解法提取DNA,而不用进行DNA纯化。
[0028] 此外，多重竞争PCR技术受DNA样品质量的影响较大，而本发明提供的半定量竞 争PCR检测基因拷贝数的方法采用的内对照基因的来源于待测样品本身，且其在待测样品 的基因组中的拷贝数是已知的，因此，相对于多重竞争PCR技术，本发明提供的半定量竞争 PCR检测基因拷贝数的方法不需要额外设计竞争子，而且实验结果受样品本身质量的影响 更小，相对定量的准确性更高。
[0029] 优选地，所述步骤（2)中，所述待测基因为Bcl-3基因敲除鼠的潮霉素基因。
[0030] 优选地，所述步骤（2)中，所述Bcl-3基因敲除鼠潮霉素基因的上游引物序列和下 游引物序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0: 2所示。
[0031] 优选地，所述步骤（2)中，所述内对照基因Bcl-3基因敲除鼠的Bcl-3基因。
[0032] 优选地，所述步骤（2)中，所述Bcl-3基因敲除鼠Bcl-3基因的上游引物序列和下 游引物序列分别如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。
[0033] 第四方面，本发明提供了如第一方面所述的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方 法在半定量竞争PCR检测基因拷贝数试剂盒中的应用。
[0034] 优选地，如第一方面所述的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法在鉴定生物基 因型中的应用。
[0035] 进一步优选地，所述生物基因型为基因敲除鼠的基因型。
[0036] 本发明提供了的真核重组表达载体及其制备方法和应用具有如下有益效果：
[0037] (1)本发明提供的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法通过观察或计算待测 基因条带强度与内对照基因琼脂糖凝胶电泳条带强度的比值，能得到待测基因的相对拷贝 数；
[0038