专利名称：一种通过nos3基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测用的试剂盒，具体涉及一种通过N0S3基因拷贝数预测高肺 水肿发病风险的试剂盒，用于评定人体高原肺水胖的易感性.
背景技术：
高原肺水肿(high altitude pulmonary edema,缩写HAPE)是一种特发于高 原低氧环境的肺水肿，起病急，进展快，危害大，如果救治不及时，可在较短 的时间内发展至呼吸衰竭，甚至死亡，是严重威胁进入高原人群健康和生命的 急性重症高原病。近年的调查表明，在从平原进入海拔3000米以上高原的汉族 人群中，高原肺水肿的发病率高达0.4%-2%.高原肺水肿发病有明显的家族和个 体易感倾向，环境因素和遗传因素均可以影响高原肺水肿的发生。近年来，遗 传因素在高原肺水肿发病机制中的作用逐渐受到重视张雪峰，高原施工人群 急性重型高原病患病率调查，《高原医学杂志》，2005; 15(3): 7-8;陈有，高 原肺水肿发病机制研究进展，《高原医学杂志》，2005， 15 ( 2 ): 62-64;高钰琪， 高原肺水肿的发病机制及防治，《人民军医》，2005; 482 ( 2 ): 108-111。
目前，认为高原肺水肿发生的基本机制有肺动脉压过度升高；肺毛细血 管通透性增强；肺泡上皮堆水清除障碍；血浆胶体渗透压降低。其中肺动脉压 过度升高是高原肺水肿发病的中心环节。NO (—氧化氮)具有血管扩张作用， 能迅速降低缺氧造成的肺动脉高压，降低高原肺水肿的发生。 一氧化氮合成酶 (nitric oxide synthase,缩写为N0S3 )是NO生成过程中最主要的限速因子，是NO合成的关键酶。Ahsan A等报道N0S3的单核苦酸多态性与高原肺水肿的发 生密切相关，Ahsan A, eN0S allelic variants at the same locus associate with HAPE and adaptation,《Thorax》，2004; 59 (11): 1000-1002.目前有文 献报道， 一些基因的拷贝数与疾病的易感性相关，是一些疾病的遗传标记
Braude I， Large scale copy number variation (CNV) at 14ql2 is associated with the presence of genomic abnormalities in neoplasia,
《BMC Ge誦ics》，20067: 138.,关于N0S3拷贝数与高原肺水肿易感的相关性 尚无才艮道。
通过SYBR (即SYBR GREEN染料，缩写SYBR)定量PCR (聚合Sl^反应)的 方法检测N0S3拷贝数，发现N0S3拷贝数与高原肺水肿易感性之间存在相关性。 具体做法是
(1 )健康对照组标本(25例)在成都采集拟进入高原人员静脉血2ml (EDTA 抗凝)，然后与他们一起乘飞机达到拉萨(海拔3658米)，并观察他们在拉萨一 周内没有发生高原肺水肿；
(2)高原肺水肿病例组标本(25例)为与健康对照组标本年龄匹配，按 高原病诊断标准我国高原病命名、分型及诊断标准，《高原医学杂 志》，1996:2-4符合高原肺水肿诊断标准的病例。样本收集过程中遵循"赫尔 辛基"宣言，^研究得到了收集对象的知情同意，采集静脉血2ml (EDTA抗凝)，
(3 )分别用上海生工生物技术服务有限公司UNIQ-10柱式临床样品基因组 抽提试剂盒(货号SK1342 )提取健康对照组标本和高原肺水肿病例组标本血液 白细胞DNA，然后采用定量PCR ( SYBR染料法)的方法分别扩增健康对照组标本 和高原肺水肿病例组标本的N0S3基因和核基因编码的看家基因Beta-actin;再
5分别计算每例标本的N0S3拷贝数与Beta-act in的拷贝数的比值，结果经SPSS 12. 0 (—种统计软件)中的独立样本T检验进行检验，以P<0. 05为相差显著， 并通过该软件计算95 %的可信区间，以分别得到健康对照组和高原肺水肿病例 组N0S3/Beta-actin拷贝数的参考值，结果发现在高原肺水肿病例组中 N0S3/Beta-actin的拷贝数比值显著升高(表l)。
表l高原肺水肺病例组和健康对照组中N0S3/Beta-actin拷贝数比值
健康对照组(n=25 )高原肺水肿病例组(n=25)
N0S3/Beta-actin0. 1086 ± 0. 03660. 0667 ± 0. 0307*
95%可信区间0. 0872-0. 12390. 0497-0. 0837
高原肺水肿病例组vs健康对照组P=0. 00
发明内容
本发明的目的是提供一种通过N0S3基因拷贝数预测高肺水肿发病风险的试
剂盒，能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导高原肺水肿
的预防和治疗，减轻急性重症高原病的威胁。
本发明所述的一种通过N0S3基因拷贝数预测高肺水肺发病风险的试剂盒，
包括分离包装的N0S3引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌
去离子水，定值标准品，健康对照DM,其特征是，
所述的NOS3引物混合液中的上游引物(F)和下游引物(R)的序列为 F:-TGTCCAGAGGCTGCAAGG- 3'和R: -AAGAAACAGGAAGCGGGTG-3'; 所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为 F: 5，-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3'和R: 5，-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3，； 所述的PCR反应液，含有PCR緩冲液、MgCl2、 dNTPs(脱氧核苷三磷酸)、SYBR染料、Ex Taq酶；
所述的定值标准品是用Be ta-act i n的上下游引物在PTC-2 00 PCR仪中进行目 的片段的扩增，得到含有目的片段的PCR产物，然后将目的片段插入克隆载体 pMD18-T中，并将阳性克隆增菌后测序验证；从证实含Beta-actin基因片段的菌
液中提取质粒。
所述的一种通过N0S3基因拷贝数预测高肺水肿发病风险的试剂盒，其所述 的健康对照MA是采集拟进入高原前的人员的静脉血2ml (EDTA抗凝)，并且到 高原后在一周内没有发生高原肺水肿，然后，提取血液白细胞DNA，再将DNA 浓度调为50ng/p 1。
所述的一种通过N0S3基因拷贝数预测高肺水肿发病风险的试剂盒，其所述 的N0S3引物混合液为100pl;其中上游引物和下游引物各50pl，浓度均为 10pmo1/p1。
所迷的一种通过N0S3基因拷贝数预测高肺水肺发病风险的试剂盒，其所述 的Beta-actin引物混合液为400 |i 1;其中上游引物和下游引物各200 p 1,浓 度均为10pfflol/p 1。
所述的一种通过N0S3基因拷贝数预测高肺水肿发病风险的试剂盒，其所述 的定值标准品用无菌去离子水倍比稀释为5管，每管体积200ji1,浓度分別为 lxio4、 lxio5、 lxio'、 lxio7、 1"08拷贝"1。
所述的一种通过N0S3基因拷贝数预测高肺水肿发病风险的试剂盒，其所述 的无菌去离子水为1500m1。
本发明建立了利用定量PCR( SYBR染料法)方法检测来NOS3拷贝数的方法， 能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导高原肺水肿的预防和治疗，减轻急性重症高原病的威胁，有利于进入高原人群健康；该试剂盒使
用简单，操作方便，检测快速。
具体实施例方式
本发明所述的一种通过N0S3基因拷贝数预测高肺水肿发病风险的试剂盒， 包括分离包装的N0S3引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌 去离子水，定值标准品，健康对照DNA;
试剂盒中的N0S3引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为
F:-TGTCCAGAGGCTGCAAGG-和R: -AAGAAACAGGAAGCGGGTG-3';
所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为
F: 5，-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3，和R: 5，-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3，；
试剂盒中的PCR反应液，含有PCR援冲液、AfgCh、 dATTPs (脱氧核苷三磷酸)、 SYBR染料、ExTaq酶，均直接购于宝生物工程(大连)有限公司，货号DRR(M1S。
试剂盒中的定值标准品是用861&-&"^的上下游引物在？1"(:-200 PCR仪中 进行目的片段的扩增，得到含有目的片段的PCR产物，然后将目的片段插入克隆 载体pMD18-T中，并将阳性克隆增菌后测序發逸；从证实含Beta-actin基因片段 的菌液中提取质粒，
试剂盒中的A^t照DNA是采集拟i^高原前的人员的静脉血2ffll (EDTA抗 凝)，并且到高原后在一周内没有发生高原肺水肿，然后，提取血液白细胞DNA, 再将dna浓度调为50ng/ m 1,
试剂盒中的N0S3引物混合液为100p l;其中上游引物和下游引物各50p 1, 浓度均为10pmol/u 1。
试剂盒中的Beta-act in引物混合液为400 u 1;其中上游引物和下游引物各200 p 1,浓度均为10pmol/u h
试剂盒中的定值标准品用无菌去离子水倍比稀释为5管，每管体积200/j 1， 浓度分别为lx104、 lxio5、 lxio6、 lxio7、 lxio'拷贝/pl。
试剂盒中的无菌去离子水为1500n 1,
试剂盒中的定值标准品用Beta-actin上下游引物，在PTC-200PCR仪中进行 扩增，条件为94lC预变性5min, 941C变性30s， 60X:退火30s， 72"C延伸45s， 94 t:变性30s， 60t:退火30s， 72"延伸45s……其中94TC变性30s， 60r退火30s, 72 TC延伸45s循环29次，721C终末延伸8fflin， PCR产物经电水险測后用将目的片段 (扩增产物)插入克隆载体pMD18-T (购于宝生物工程有限>/>司)中，并将阳性 克隆增菌后测序發逸；
从证实含有Beta-actin基因片段的菌液中提取质粒，采用分光光度仪测得 质粒浓度，再算出摩尔浓度Ct量除以碱基数+ 324. 5 + 10),再乘以阿拂加的罗 常数(6. 02xl0")，得到质粒的浓度为1 x 108拷贝/^11。将质粒进行倍比稀释(共 稀#^五个梯度)，稀释后将标准品(即上迷质粒)分別装在200*1 1小管内，于 -20t:的水箱内^^，避免质粒反复冻融导致降解；
M对照DNA，在成都采集拟进入高原人员静脉血2ml，然后，与他们一起 乘飞机达到拉萨，并观察他们一周且在这周内没有发生高原肺水肿，抽取静脉 血2ml (BDTA抗凝)并提^Uk液白细胞DM,
该试剂盒的使用说明
第一步，待測个体样品准备，采用上海生工生物技术服务有限公司UNIQ-10 柱式临床样品基因組抽提试剂盒(货号SK1342 )提取待測个体静脉血液中白细 胞基因组总DM，然后用紫外分光光;l仪对DM进行定量；
9第二步，PCR反应体系配制，共配制十管； 第一管到第五管为定值标准品，共5管，浓度分别为 取10 p 1浓度为1 x 108拷贝/ u 1的质粒；
取10Ml浓度为lxlO^拷贝/jLil的质粒，加入90Ml无菌去离子水，混匀 得到浓度为lxl(T拷贝/M 1的质粒；
取10p 1浓度为1 x 1(T拷贝/ji 1的质粒，加入90p 1无菌去离子水，混匀 得到浓度为lxlO'拷贝/pl的质粒；
取10pl浓度为lxio'拷贝/pl的质粒，加入90p l无菌去离子水，混匀 得到浓度为lxl(r拷贝/ P 1的质粒；
取10M 1浓度为1 x 1()5拷贝/M 1的质粒，加入90n 1无菌去离子水，混匀 得到浓度为^104拷贝/" 1的质粒；
各取0. 5 ji 1浓度从1 x 1 x 10'拷贝/ u 1的标准品，然后，每管都依
次加入Beta-act in引物混合液lyl， pcr反应液12. 5 m 1，无菌去离子水11 y 1，混匀；
第六管为待测个体N0S3的扩增，取降测个体的DNAO. 5nl，然后依次加入 N0S3引物混合液lpl, PCR反应液12. 1,无菌去离子水llpl，混匀；
第七管为待测个体看家基因Beta-actin的扩增，取待测个体的WfAO. 5 p 1， 然后依次加入Beta-act in引物混合液1 p 1, PCR反应液12. 5 p 1,无菌去离子 水llMl，混匀；
笫八管为空白对照，分別取Beta-actin引物混合液1 p 1， PCR反应液12. 5 lil，无菌去离子水11.5pl，混匀；
第九管为M对照样本N0S3的扩增，取对照DNA 0.5"1，然后依次加入N0S3引物混合液1m 1， PCR反应液12. 1，无菌去离子水llpl，混匀；
第十管为健康对照样本看家基因Beta-actin的扩增，取对照DNA 0. 5ju 1, 然后依次加入BeU-actin引物混合液1 p 1, PCR反应12. 5pl，无菌去离子水 11 H 1，混匀；
第三步，PCR扩增条件，将第二步的十管已经混匀的物质分別放入Opticoii monitor 1定量PCR仪中，均按以下条件进行PCR反应95t:预变性10s; 95 iC变性5s，60"C退火延伸20s，读板，重复39个循环；
其中，NOS3引物扩增产物长度为163bp，序列如下
tgtccagaggctgcaaggaUcagcaUaUcctccaggaaggagcaaaacgcctcttttccct ctctaggcctgttgcctcgggcctgggtccgcctUatctggaaggcccctcccagcagcggtacccc agggcctactgccacccgcttcctgtttcttj
Beta-actin引物扩增产物长度为180bp，序列如下
cgggaaatcgtgcgtgacatcaagaagctgtgcUcgtcgccctggacttcgagcgggagatgg ccatggtggccyccagctcctccctggagaagagctacaagctgctcgatggccaggtcatcaccatc ggcaacgagcggttccactgccccgaggcgctcttccagccttccttCo
第四步，数据分析，PCR反应结束后，定量PCR仪通过比较待测标本的Ct 值与标准曲线Ct值，自动生成每例样本N0S3和Beta-act in的拷贝数，然后， 用N0S3拷贝数除以Beta-actin拷贝数，分别求得待测个体和对照的 N0S3/Beta-actin拷贝数比值，如^t照的N0S3/Beta-actin (第九管/第十管) 拷贝数比值位于0. 0872-0.1239之间时，提示我们实验准确性和灵敏度可信， 当此时待测个体N0S3/Beta-actin (第六管/第七管)的拷贝数比值位于高原肺 水肿易感者的该基因拷贝数(0. 0497-0. 0837 )之间时，提示我们该个体有可能就是高原肺水肿的易感个体。
第一至第五管为定值标准品的扩增，以获得标准曲线；
第六、七管是为了获得待测个体的N0S3基因和Beta-actin基因的拷贝数;
第八管为空白对照管，以检测整个PCR过程中是否有污染；
第九、十管是为了获得健康对照的N0S3基因和Beta-actin基因的拷贝数。序列表
<110〉中国人民解放军第三军医大学
<120> —种通过N0S3基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒 <130>
<140> 200810232916.4
<141> 2008-10-24
<160> 6
<170> Patentln 3. 3
<210> 1 <211> 18 <212> DM <213>人工合成 <221> NOS3上游引物 <400> 1
tgtccagagg ctgcaagg 18
<210> 2 <211> 19 <212> DM <213>人工合成 <221> N0S3下游引物 <400> 2
aag纖cagg aagcgggtg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DM
<213>人工合成
<221> Beta-act in上游引物
<400> 3
cgggaaatcg tgcgtgacat 20
<210> 4
<211> 20
<212>腿
<213>人工合成
<221> Beta—actin下游引物
<400〉 4
gaaggaaggc tgga汪gagtg 20
<210> 5<211> 163 <212>腿
<213> N0S3核^列 <221> N0S3 PCR扩增产物 <400> 5
aggagcaaaa cgcctctttt 60 atctggaagg cccctcccag 120 ctt 163
tgtccagagg ctgcaaggat tcagcattat tcctccagga ccctctctag gcctgttgcc tcgggcctgg gtccgcctta cagcggtacc ccagggccta ctgccacccg cttcctgttt
<210> 6 <211> 180 <212> DM
<213> Beta-act in ;f亥齡列 <221> Beta-actin PCR扩增片段 <400> 6
cgggaaatcg tgcgtgacat caagaagctg tgctacgtcg ccctggactt cgagcgggag 60 atggccatgg tggccyccag ctcctccctg gagaagagct acaagctgct cgatggccag 120 gtcatcacca tcggcaacga gcggttccac tgccccgagg cgctcttcca gccttccttc 180
1权利要求
1、一种通过NOS3基因拷贝数预测高肺水肿发病风险的试剂盒，包括分离包装的NOS3引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌去离子水，定值标准品，健康对照DNA，其特征是，所述的NOS3引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为F5′-TGTCCAGAGGCTGCAAGG-3′和R5′-AAGAAACAGGAAGCGGGTG-3′；所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为F5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’和R5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’；所述的PCR反应液，含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SYBR染料、Ex Taq酶；所述的定值标准品是用Beta-actin的上下游引物在PTC-200PCR仪中进行目的片段的扩增，得到含有目的片段的PCR产物，然后，将目的片段插入克隆载体pMD18-T中，并将阳性克隆增菌后测序验证；从证实含Beta-actin基因片段的菌液中提取质粒。
2、 根据权利要求1所述的一种通过N0S3基因拷贝数预测高肺水胂发病风 险的试剂盒，其特征是，所述的健康对照DNA是采集拟进入高原前的人员的静 脉血2ml，并且到高原后在一周内没有发生高原肺水肿，然后，提取血液白细胞 DNA，再将DNA浓度调为50ng/ p 1,
3、 根据权利要求1所述的一种通过N0S3基因拷贝数预测高肺水肿发病风 险的试剂盒，其特征是，所述的N0S3引物混合液为100jil;其中上游引物和下 游引物各50yl，浓度均为10pmol/M 1.
4、 根据权利要求1所述的一种通过N0S3基因拷贝数预测高肺水肿发病风 险的试剂盒，其特征是，所述的Beta-act in引物混合液为400 pl;其中上游 引物和下游引物各200 p 1，浓度均为10pmol/u 1。
5、 根据权利要求1所述的一种通过N0S3基因拷贝数预测高肺水肺发病风 险的试剂盒，其特征是所述的定值标准品用无菌去离子水倍比稀释为5管，每 管体积200 Ml，浓度分别为lx104、 lx105、 lxio'、 lxl07、 lxlO'拷贝/pl。
6、 根据权利要求1所述的一种通过N0S3基因拷贝数预测高肺水肿发病风 险的试剂盒，其特征是，所述的无菌去离子水为1500 n 1
全文摘要
本发明涉及一种通过NOS3基因拷贝数预测高肺水肿发病风险的试剂盒，包括分离包装的NOS3引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌去离子水，定值标准品，健康对照DNA，其特征是，所述的NOS3引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为F5′-TGTCCAGAGGCTGCAAGG-3′和R5′-AAGAAACAGGAAGCGGGTG-3′；所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为F5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’和R5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’。本发明能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导高原肺水肿的预防和治疗，有利于进入高原人群健康；该试剂盒使用简单，操作方便，检测快速。
文档编号C12Q1/68GK101475980SQ20081023291
公开日2009年7月8日 申请日期2008年10月24日 优先权日2008年10月24日
发明者刘福玉, 罗勇军, 高文祥, 高钰琪 申请人:中国人民解放军第三军医大学