专利名称：基于新型dna结合染料的实时荧光定量pcr检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种PCR检测方法及其应用，特别是涉及一种基于新型DNA结合染料 的实时荧光定量PCR检测方法及其在制备实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用。
背景技术：
1996年，实时荧光定量PCR技术由美国Applied Biosystems公司首先推出。所谓 实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测 荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化来即时分析目的基因的拷贝数目，通过与加 入已知量的标准品进行比较，可实现实时定量检测。实时荧光定量PCR技术实现了 PCR从 定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应 等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。 目前，根据实时荧光定量PCR所使用的荧光化学物质的不同，荧光定量PCR技术主 要分两类，荧光染料和荧光探针。其中荧光探针包括T叫man探针、分子信标、FRET探针、蝎 式探针等。荧光染料主要包括Y0-PR0-1、 SYBR Green 1、BEB0和LC Green等。荧光染料 定量PCR的优势在于它使用方便，不需要设计复杂的荧光，使检测方法变得简便，同时也降 低了检测的成本。而且，它能监测任何双链DNA序列的扩增，没有引物特异性，可以用于不 同的模板。然而，正是由于荧光染料能和任何双链DNA结合，因此它也能与非特异的双链 DNA(如引物二聚体)结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用熔 解曲线(melting curve)加以解决，来区分特异性和非特异性扩增。因此，作为一种方便快 捷的定量PCR方法，荧光染料定量PCR应用非常广泛。 SYBR Green I因为其毒性低、价格便宜，成为最常使用的一种定量PCR荧光染料。 但是，SYBR Green I也存在一些明显的不足。例如，在未进行优化之前不能用于普通PCR缓 冲液中，并且需要额外的试剂(如DMSO、 BSA等)来增加反应的效率。尽管通过提高MgCl2 的浓度可以在一定程度上减小其抑制效应，但SYBR Green I仍可以浓度依赖的方式抑制 PCR反应。这种抑制效应可能是由于染料的分解产物所致。目前，SYBRGreen I已被广泛应 用于病原的检测。但是，利用该染料所做的熔解曲线(Tm)可受到染料和DNA浓度的影响。 例如，3倍浓度的起始DNA的差异，就可能引起1度的Tm值的变化。SYBR Green I的另一 个缺点是在多重PCR中应用有限。研究发现，进行双重PCR扩增时，熔解曲线只能检测到一 个产物，而电泳分析可以明显观察到两个产物。这个可能与扩增DNA和染料的相对浓度有 关。尽管SYBR Green I的应用范围较广，但是存在染料可用浓度范围小、序列结合偏性大 等缺点。 SYTO家族的染料是一种比较常见的DNA结合染料，它具有很多特性，包括膜通透 性、低细胞毒性、结合DNA后荧光增强等，这些特性使得它们适合于标记活细胞。但是它们 对双链与单链DNA的特异性结合能力不清，或者说它们作为定量PCR的染料是否合适仍不清楚。
发明内容
本发明提供了一种对PCR反应的抑制效应小、可用浓度范围大、序列结合偏性小、敏感性高的新型DNA结合染料，并建立了基于该染料的实时荧光定量PCR检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案一种基于新型DNA结合染料的实时荧光定量PCR检测方法，是以SYTO为荧光染料进行的实时荧光定量PCR检测方法。
所述SYTO荧光染料优选为SYT082 。
所述SYTO荧光染料的浓度优选为2 ii M。 所述PCR反应体系优选为10XPCR缓冲液2. 5iU， dNTP(2. 5mM)2ii1，MgCl2(25mM)2iil，上游引物(lOyM) :0. 5iU，下游引物(10iiM) :0. 5iU， rTaq酶(5U/ii 1) :0. 125 ii 1，模板DNA :1 ill (含1. OX 101 109拷贝)，染料1 y 1，加水补齐至终体积25ii 1。所述实时荧光定量PCRPCR反应条件优选为预变性94°C 3min ;扩增95°C 30s，
52°C 30s，72。C 30s，共40个循环；72。C lOmin。 所述实时荧光定量PCR检测方法可包括以下步骤 1)将SYTO为荧光染料加入上述PCR反应体系中； 2)按上述反应条件进行PCR反应。 本发明的第二个目的是提供一种实时荧光定量PCR检测试剂盒。
本发明所提供实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括10XPCR缓冲液2. 5iU、dNTP(2. 5mM)2ii 1、 MgCl2 (25mM) 2 ii 1、 rTaq酶(5U/ii 1)0. 125 ii 1和荧光染料，所述荧光染料为SYTO荧光染料。 所述SYTO荧光染料优选为SYT082 。
所述SYTO荧光染料的浓度优选为2 ii M。 本发明提供了一种基于新型DNA结合染料的实时荧光定量PCR检测方法。以SYT082为例，探讨了 SYTO染料结合DNA的特性及其在定量PCR中应用的可行性。结果显示，SYTO家族的染料比SYBR Green I更适用于荧光染料实时定量PCR反应，染料可以在一个很宽的浓度范围内使用，DNA熔解曲线不受DNA浓度影响。这是因为l)SYTO染料的PCR抑制效应小。2)比较不同浓度的染料对熔解曲线的影响，结果SG染料只有3个浓度下的扩增产物有熔解曲线，而SYTO染料除了一个最低的浓度外，其余都能分析出熔解曲线。Tm值是分析扩增产物特异性的一个关键步骤，SG的结果显示，在不同染料浓度下，产物的Tm值有1度的差别，而SYTO染料则保持不变，说明不同浓度的SYTO染料对Tm值没有影响。另外，SG熔解曲线的宽度较SYTO的宽，说明SYTO结合到DNA随温度变化明显，特别是在产物解链的过程中，染料可迅速从双链中解离下来。3)选择SG染料的浓度为0. 25 ii M， SYTO染料的浓度为2uM，在该条件下扩增系列稀释模板，PCR结果显示，随着模板量的减少，扩增产物也减少，对应的荧光值也降低，表明SYTO的荧光值能够反映产物量的变化。从结果中我们观察到，在产物量的变化相同的情况下，SYTO荧光值的变化较SG大，这可能是因为SYTO结合DNA后荧光强度本身就要强一些，因此，相同的DNA变化程度将会导致产生更大的荧光值变化。从这一点可以推测，SYTO能够更为准确的对起始模板进行定量。4)线性范围是衡量定量PCR方法的一个指标。通过对系列稀释的模板进行PCR扩增，结合扩增曲线和Ct值
4的变化，确定了 SG和SYTO的线性定量范围，结果显示，它们具有相同的定量范围，即103 108拷贝，这与报道的其它荧光染料定量PCR的线性范围一致。5)利用染料法定量PCR进行多重PCR扩增，需要通过最后的熔解曲线来鉴别多重PCR扩增的效果。结果显示通过熔解曲线的分析可以区分多个PCR扩增产物，虽然SYTO染料也存在一定的偏性，但是这种偏性远远小于SG。据此推测，利用SYTO染料进行多重PCR将具有较好的效果。上述实验结果表明本发明的实时荧光定量PCR检测方法明显优于现有的实时荧光定量PCR检测方法，具有对PCR反应的抑制效应小、可用浓度范围大、序列结合偏性小、敏感性高等优点，适合大面积推广和应用。 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为染料浓度对实时荧光定量PCR反应的抑制效应的检测结果 图2为不同染料浓度下实时荧光定量PCR扩增产物的电泳图 图3为不同染料浓度扩增下的实时荧光定量PCR产物的熔解曲线 图4为不同染料浓度扩增下的实时荧光定量PCR产物的荧光强度变化 图5为不同DNA浓度对染料影响的检测结果 图6为低模板浓度时荧光值随模板DNA量的变化 图7为SG和S82的多重PCR扩增检测结果 图8为SG和S82的单重和多重PCR扩增产物的电泳图
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 实施例1、 SYTO染料结合DNA的特性及其在实时荧光定量PCR中应用的可行性检 以SYT082(S82)染料为例，检测SYTO染料结合DNA的特性及其在实时荧光定量PCR中应用的可行性，以荧光染料SYBR Green I (SG)为对照，具体实验方法如下
—、实时荧光定量PCR扩增
1、引物与质粒 针对甲型H1N1流感特有的序列，人工合成一段序列(序列表中序列l)。根据该序列设计实时荧光定量PCR扩增的引物，引物序列如下
上游引物CCCAAAGTGAGGGATCAAGA
下游引物CCAGCATTTCTTTCCATTGC 。 将PCR扩增产物克隆到载体pMD-18T (购自TaKaRa)上，作为阳性质粒。
2、实时荧光定量PCR扩增 目的基因的荧光定量PCR扩增采用Bio-Rad IQ5荧光定量PCR仪。荧光染料分别采用SYBR Green I和SYT082 (均购自Invitrogen公司)。PCR反应体系(25 ii 1) : 10 X PCR缓冲液2. 5iU， dNTP(2. 5mM)2ii1， MgCl2 (25mM) 2 yl，上游引物(10iiM) :0. 5iU，下游引物(10iiM) :0. 5ii l，rTaq酶(5U/ii l，TAKARA) :0. 125 ii l，模板DNA(阳性质粒)ly l(含1. 0 X 101 109拷贝)，染料1 ii 1 (终浓度为20、 10、5、 1、0. 5、0. 25、0. 1、0. 05 ii M)，加水补齐至终体积25iU。反应条件预变性94。C 3min;扩增95。C 30s，52。C 30s，72。C 30s，共40个循环；72。C 10min。溶解曲线95。C lmin，55。C lmin，55。C 20s (温度变化速率为0. 5°C /s)。 二、染料浓度对实时荧光定量PCR反应的抑制效应 染料浓度对实时荧光定量PCR反应的抑制效应的检测结果如图1所示(A :SG， B :S82) ， SYBR Green I (SG)染料对PCR反应具有很强的抑制效应，因此其可用浓度范围很小。为了分析SG和SYT082(S82)对PCR反应的影B向，在反应体系中加入了不同浓度(0.05到20iiM)的染料，观察其对PCR结果的影响。从结果可以看出，SG只有在浓度为0.05、0. 1、0. 25 ii M时才有扩增曲线，而S82在所有浓度下均显示了较好的扩增曲线。从扩增曲线可以看出，两种荧光染料均呈现随染料浓度增加荧光值增加的趋势。在相同染料浓度下，S82的荧光值大约是SG的6倍，远远高于SG。为进一步确定染料浓度对PCR反应的抑制效应，将PCR产物进行2X琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(A :SG，B :S82，M :DNA marker,1-8 :20、10、5、1、0. 5、0. 25、0. 1、0. 05 y M)，从电泳图可以看出，S82在所有浓度下均有扩增产物，而SG只有能观察到扩增曲线(图l)的那三个浓度才有扩增产物。电泳结果显示，这些染料浓度下的PCR扩增产物的量几乎没有差异。上述检测结果表明SYTO染料对PCR反应基本上没有抑制作用，SYTO家族的染料比SYBR Green I更适用于荧光染料实时定量PCR反应。 四、不同染料浓度对熔解曲线的影响 对不同染料浓度扩增下的PCR产物做熔解曲线，结果如图3所示(A， B:SG;C， D:S82)，从图3中可以看出，SG染料只有在最低的3个浓度下的扩增产物才能观察到熔解曲线，与扩增产物的结果一致(图3A和图3B)。相反，对于S82染料来说，除最低一个浓度外，所有浓度下都可观察到熔解曲线(图3C和图3D)。从熔解曲线上可以看出，SG在3个能够扩增的浓度下的Tm值分别为81. 5和82. 5， S82在大部分浓度下的Tm值为82. 0，只有最高浓度(20 ii M)时的Tm值发生了偏移，为82. 5。由于SG的使用浓度低于S82，因此说明S82对产物Tm值的影响更小。从熔解曲线的宽度看，S82的温度跨度为80 84，而SG的温度跨度为79. 5 85. 0 (表1)。从温度变化与荧光值的变化相关性看，S82随温度变化的强度远远高于SG(图4)。上述检测结果进一步证明SYTO家族的染料比SYBR Green I更适用于荧光染料实时定量PCR反应。 表1SG和S82不同浓度下熔解曲线的特性
6嫁度 Tm值 峰値 起始温度 结束温度 温度跨度
(|iM)rc)rc)rc)rc)
S82-202082,54516,679,584.55.0
S82-101082.04293.776.084.08,0
S82-5582,02914.078,0歸6,0
S82-2282.01TO9.478.083.55,5
S 82-0,50,582.02肌478,584.05,5
S82-0.250,2582.0183.179,583.54.0
S82-0.10,182.047.979.583.54,0
S82-0,050,0582,010.981 ，583.01.5
SG-202062.046,755,063,08,0
SG-101059.078,056,079,523.5
SG-5556.5固56.080,024,0
SG-2255,562.455.076,521,5
SG-0.50.555.525 355,072.017,0
SG-0.250.2582.0220,479.085,56.5
SG-0,10,1§1.5126,179,585.56.0
SG-()-050.0581.561,779,084.05.0 五、检测不同DNA浓度对染料的影响 为了分析DNA浓度对染料的影B向，选取两种染料各自的最佳浓度。根据上面的 分析可以看出，SG在浓度为0. 25iiM时，扩增效率高，荧光信号强，因此，SG的最佳浓度为 0. 25iiM。 S82在所有浓度下均有较高的扩增效率，其荧光强度随染料浓度增加。但是，在染 料浓度为2 ii M时，其荧光值从0. 5 ii M时的280. 4提高到1709. 4，是0. 5 y M时的6倍，尽管 继续增加染料浓度荧光值还会增加，但考虑到染料的强度和浓度，2 M是一个较为合适的 浓度。然后，将模板系列稀释(稀释度依次为101 108拷贝)后分别以SG和S82最佳染 料浓度进行扩增，比较扩增效果的差异，反应体系和反应条件不变。 不同DNA浓度对染料影响的检测结果如图5所示(A， C， E :SG ;B， D， F :S82)，从图 5中可以看出，SG和S82均能对系列稀释模板进行扩增。从整体上看，随着模板浓度的增 加，Ct值降低。熔解曲线分析结果显示，两个染料均显示了单一的熔解曲线，表明扩增都是 特异的(图5A和D)。将熔解曲线进行放大，结果显示，SG的峰的宽度较S82大，并且不同 浓度模板扩增得到的峰型差异较大，而S82的除了最高的模板浓度发生了峰型的偏移外， 其它的都相对较整齐(B和E)。从扩增的荧光值可以看出(C和F)，相同浓度的模板在两种 染料扩增时，Ct值相差不大，但是随着扩增的进行，SG(C)的荧光值很快就达到了平台，而 S82(F)则一直呈上升趋势，没有达到饱和，表明S82能够结合的DNA浓度范围更大。有趣的 是，如图6所示(A:SG;B:S82)， SG在模板浓度较低时，没有出现荧光值随DNA量的增加而增加的趋势，特别是在低浓度时，虽然也有一定的荧光值，但是基本没有变化，相反，S82则
随模板浓度的变化在变化。 六、线性扩增范围 线性扩增范围是定量PCR实用性的一个重要指标，是指能够检测到标本中病原的 浓度范围。检测方法为将模板进行系列稀释后进行实时荧光定量PCR扩增，通过分析扩增 曲线和熔解曲线，决定SG和S82的线性范围。线性扩增范围的选取为，曲线呈现指数扩增， 并且具有随着模板浓度降低，Ct值增大的趋势。实验结果显示，SG和S82具有相同的线性 扩增范围，均为6个数量级，即103 108拷贝，在这个线性范围内能够对模板DNA进行准确 定量。低于上述线性范围，则需要通过熔解曲线来观察是否有扩增产物，判定标准为，扩增 产物的熔解曲线峰值高于二聚体的峰值。根据这个原则，这两种染料扩增的敏感性均能达 到1 10个拷贝。
七、多重PCR扩增 有资料显示，用SG染料进行多重PCR扩增，在进行熔解曲线分析时容易引起染料 的再结合。为了分析S82在多重扩增方面的表现，分别用SG和S82进行双重PCR扩增并结 合溶解曲线和凝胶电泳分析其扩增差异。单重PCR反应时，分别以A型流感(FluA，序列表 中序列2，扩增引物序列为FluA的上游引物ATGGAGTGGCTAAAGACAAGAC，FluA的下游引物 AATGCTGATTCGGTGGTCAC)和B型流感(FluB，序列表中序列3，扩增引物序列为FluB的上游 引物TGATACCTAGTGCGGCTACTC， FluB的下游引物TCAATGAAGAAGGAACGGCATC)为模板进行 扩增。反应体系为:10XPCR缓冲液2. 5ii 1， dNTP(2. 5mM) 2 y 1， MgCl2 (25mM) 2 y l，上游引 物(lOiiM)O. 5ii l，下游引物(lOiiM)O. 5ii 1， rTaq酶(5U/ii 1)0. 125 ii 1，模板DNA(20ng/ y l)liil，染料(2iiM)liil，加水补齐至终体积25ii1。反应条件为94。C 3min ;95。C 30s， 52。C 30s，72。C 30s，共40个循环；72。C 10min。双重PCR反应时，以FluA和FluB的混 合物为模板，反应体系为:10XPCR缓冲液2. 5iU， dNTP(2. 5mM)2ii1， MgCl2 (25mM) 2 yl， FluA的上游引物(lOiiM)l. 25iU， FluA的下游引物(lOiiM)l. 25iU， FluB的上游引 物(10iiM)0. 5iU， FluB的下游引物(10iiM)0. 5iU， rTaq酶(5U/iU)0. 125 iU，模板 DNA(20ng/iU)A和B各liil，染料(2 y M) 1 iU，加水补齐至终体积25 yl。反应条件不变。 结果如图7(A，C，E :SG ;B，D，F :S82)和图8(1， Marker ;2，3为SG单重PCR ;4， SG多重PCR ; 5， 6为S82单重PCR ;7， S82多重PCR)所示，从图7中可以看出，单重扩增时两个产物的熔解 曲线均较好，能够观察到两个产物的Tm值差异，形成两个独立的峰，且峰值相近(A和B)。但 是，当在同一个反应体系中扩增两个产物时，则出现了熔解曲线的差异。用SG作为染料时， 虽然也形成两个峰，但是温度低的峰显著低于温度高的峰(C);相反，以S82作为染料时，熔 解曲线形成两个独立的峰图，两个峰虽然有差异，但这种差异远小于SG组，说明S82也存在 一定的偏性，但其偏性远小于SG组。 在上述实施例中，分析了一类新型的荧光染料SYTO应用于实时定量PCR的可行 性，并与传统的荧光染料SYBR Green I进行了比较。以SYT082为例，通过荧光染料对PCR 反应的抑制效应，染料浓度对熔解曲线的影响等的分析得出结论，SYTO家族的染料比SYBR Green I更适用于荧光染料实时定量PCR反应。 SG染料的一个严重缺点是可使用的浓度范围低，因此，在利用该染料建立定量 PCR方法时，往往需要对染料的浓度进行摸索和优化。此外，由于该染料稳定性的原因，使用中往往因为染料分解而导致检测信号的变化，从而影响定量PCR的定量特性。因此，在本 研究中，首先分析了 SYT0染料对PCR反应的抑制效应。将反应中染料的浓度调整为0. 05 到20uM的范围，浓度相差了 400倍，结果显示，这些不同浓度的染料加入到反应体系中，并 没有抑制PCR反应。电泳结果显示，这些染料浓度下的PCR扩增产物的量几乎没有差异，表 明SYTO染料对PCR基本上没有抑制作用。SYTO的PCR抑制效应小，对于该染料用于定量 PCR方法的建立具有一个很大的优势，即不需要花时间摸索染料的使用浓度，只需要选择其 中一个合适的浓度即可。相对于SG来说，SYTO的另一个优点是，相同浓度下SYTO结合DNA 后的荧光值较SG高，这种结合DNA后荧光值增强是染料是否适合于定量PCR分析的一个要 求。 然后，本发明比较了不同浓度的染料对熔解曲线的影B向，SG染料只有3个浓度下 的扩增产物有熔解曲线，而SYTO染料除了一个最低的浓度外，其余都能分析出熔解曲线。 Tm值是分析扩增产物特异性的一个关键步骤，SG的结果显示，在不同染料浓度下，产物的 Tm值有1度的差别，而SYTO染料则保持不变，说明不同浓度的SYTO染料对Tm值没有影响。 另外，SG熔解曲线的宽度较SYTO的宽，说明SYTO结合到DNA随温度变化明显，特别是在产 物解链的过程中，染料可迅速从双链中解离下来。这种双链DNA结合的特性，有利于熔解曲 线的分析，以及多重扩增时不同产物的解析，这在后面的多重PCR分析中也得到了证实。
要对产物进行定量，所用的染料必须要随产物的量的增加荧光强度也增加。为了 比较分析SYTO染料这种特性，选择了 SG染料的浓度为0. 25uM，SYT0染料的浓度为2uM，在 该条件下扩增系列稀释模板，PCR结果显示，随着模板量的减少，扩增产物也减少，对应的荧 光值也降低，表明SYTO的荧光值能够反映产物量的变化。从结果中我们观察到，在产物量 的变化相同的情况下，SYTO荧光值的变化较SG大，这可能是因为SYTO结合DNA后荧光强 度本身就要强一些，因此，相同的DNA变化程度将会导致产生更大的荧光值变化。从这一点 可以推测，SYTO能够更为准确的对起始模板进行定量。 线性范围是衡量定量PCR方法的一个指标。通过对系列稀释的模板进行PCR扩增， 结合扩增曲线和Ct值的变化，确定了SG和SYTO的线性定量范围，结果显示，它们具有相同 的定量范围，即103 108拷贝，这与报道的其它荧光染料定量PCR的线性范围一致。
利用染料法定量PCR进行多重PCR扩增，需要通过最后的熔解曲线来鉴别多重PCR 扩增的效果。过去的研究发现，以SG作为染料进行多重PCR反应，在做熔解曲线时会发生染 料结合偏移的情况，即染料从Tm值低的产物上解离下来之后，会再结合到Tm值高的产物， 导致Tm值高的产物的峰值很高，而Tm值低的很低，这样，就无法准确得知两个产物的量的 多少，甚至是有和无的判断。从本实施例的比较结果看，SYTO染料也存在一定的偏性，但是 这种偏性远远小于SG。据此推测，利用SYTO染料进行多重PCR将具有较好的效果。
实施例2、实时荧光定量PCR检测试剂盒的制备 将10 X PCR缓冲液2. 5 ii 1 、 dNTP (2. 5mM) 2 ii 1 、 MgCl2 (25mM) 2 ii 1 、 rTaq酶(5U/ iil)O. 125iU、SYT082染料(2 y M) 1 共同包装，得到实时荧光定量PCR检测试剂盒。使
用时用户根据实验需要加入引物及模板即可。
序列表
〈160>3
〈210>1
9
〈211>134〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>1CCC3朋gtg3gggatc朋gaaactettectggacactegt卿gCCggg360gac朋朋teacattcgaagcctegtggteccgagatetgcattcgcaatg120g朋3ga朋tgctgg134〈210>2〈211>463〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>2C3g3g3Cttgaagatgtctttgctgg腿gaacaccgatcttgaggctctcatggagtgg60cte朋gac朋gaccgatcctgtcacctctg3cteaggggatttteggatttgtgttcacg120ctcaccgtgcccagtgagcg3gg3CtgC3gcgtegacgctttgtccaaaatgccctteat180ggg朋tggggtetggac3gagcagtte皿ctgtetcga皿gctte卿gg240gagateacattccatggggcgcactcagttattctgctggtgcacttgcc300agttgtetgggactcateteC皿C3gg3tgggggctgtgaccaccgaatcagcatttggc360ctgatetgcgcaacctgtgaacagattgccgactcccagcateagtctcateggca朋tg420gteac朋c朋ccaatccatttgg463〈210>3〈211>396〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>3tccatecatgtctcttcatcttttgcatte3g朋g3ttgC60agtccatcccacaagtettctttgtttccaatgtttttgatecctegtgcggctectccc120agcacggtegategcatettaaacattcccatcatcatccC3ggCg3C朋agatgccgtt180ccttcttcattg皿g皿tggtttcagctttttteattttgcccttgtttcttcattetet240ctttcteatggtetgcte皿caaggtetttgtgccttcagtctttttgtt300ttecttgttetcateaatccttttcccaatctggctettttettggag朋C朋g3CCggt360gctetectecgggctg39权利要求
一种基于新型DNA结合染料的实时荧光定量PCR检测方法，是以SYTO为荧光染料进行的实时荧光定量PCR检测方法。
2. 根据权利要求1所述的PCR检测方法，其特征在于所述SYTO荧光染料为SYT082。
3. 根据权利要求1所述的PCR检测方法，其特征在于所述SYTO荧光染料的浓度为 2iiM。
4. 根据权利要求1所述的PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应体系为IOXPCR 缓冲液2. 5iU， dNTP(2. 5mM)2ii1， MgCl2 (25mM) 2 yl，上游引物(10 y M) 0. 5 yl，下游引物 (10iiM)0. 5ii l，rTaq酶(5U/ii 1)0. 125 ii l，模板DNA(含1. 0X101 109拷贝)1 ii l，染料 1 iil ，加水补齐至终体积25 iil 。
5. 根据权利要求1至4任一项所述的PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应条件 为预变性94。C 3min ;扩增95°C 30s，52。C 30s，72。C 30s，共40个循环；72。C 10min。
6. 根据权利要求4或5所述的PCR检测方法，其特征在于所述检测方法包括以下步骤1) 将SYTO为荧光染料加入权利要求4所述的PCR反应体系中；2) 按权利要求5所述的反应条件进行PCR反应。
7. —种实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括10XPCR缓冲液2. 5iU、 dNTP(2. 5mM)2ii 1、 MgCl2 (25mM) 2 ii 1、rTaq酶(5U/ii 1)0. 125 ii 1和荧光染料，其特征在于， 所述荧光染料为SYTO荧光染料。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述SYTO荧光染料为SYT082。
9. 根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于所述SYT0荧光染料的浓度为2iiM。
10. SYTO荧光染料作为实时荧光定量PCR检测荧光染料的用途。
全文摘要
本发明公开了一种基于新型DNA结合染料的实时荧光定量PCR检测方法及其应用。该方法是以SYTO为荧光染料进行的实时荧光定量PCR检测方法。实验结果显示，SYTO家族的染料比SYBR Green I更适用于荧光染料实时定量PCR反应，染料可以在一个很宽的浓度范围内使用，DNA熔解曲线不受DNA浓度影响。表明本发明的实时荧光定量PCR检测方法明显优于现有的实时荧光定量PCR检测方法，具有对PCR反应的抑制效应小、可用浓度范围大、序列结合偏性小、敏感性高等优点，适合大面积推广和应用。
文档编号C12Q1/68GK101696451SQ20091023649
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月23日 优先权日2009年10月23日
发明者孙岩松, 徐杰, 杜昕颖, 汪舟佳, 王玉飞, 钟志军, 陈泽良, 黄留玉 申请人:中国人民解放军疾病预防控制所;