运用SYBR Green I荧光染料进行特异性DNA检测的试纸条技术的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种运用SYBR?Green?I荧光染料在试纸条上进行特异性DNA快速检测的技术，它包括以下步骤：选择尼龙膜作为试纸条的材料；将探针点到尼龙膜上，探针为待检测的特异性核苷酸序列，然后紫外线照射，烘烤，黑暗干燥储存；以待测样本为模板、以探针为模板设计的引物为引物，进行PCR扩增，之后94℃变性10min，立即放4℃，得到待测序列；缓冲液冲洗尼龙膜，在尼龙膜上点杂交液，其中杂交液中包含SYBR?Green?I和待测序列，室温黑暗杂交，用缓冲液、去离子水顺次清洗尼龙膜，用488-nm激光的成像扫描仪成像，根据尼龙膜是否发光判定结果。该方法简单﹑廉价﹑快速、适用于临床快速诊断。
【专利说明】运用SYBR Green I荧光染料进行特异性DNA检测的试纸条
技术
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术应用领域，具体地说是一种运用SYBR Green I荧光染料在试纸条上进行特异性DNA快速检测的技术。
【背景技术】
[0002]病原体检测在很多研究领域一直都有很重要的应用价值，尤其是在医疗和食品行业。病原体的快速、准确检测和识别是有效控制感染和早期治疗的关键。但是，标准的病原体培养不仅需要在培养基上孵育至少8小时，还要进行额外的生化或免疫识别，既繁琐又费时。相比之下，定量聚合酶链式反应(qPCR)和微阵列等基于核酸的检测方法，更快速、灵敏，然而，这些方法中仍然有许多既复杂又昂贵。
[0003]近年来，已报道的侧向层析检测方法对纸质生物学鉴定的发展做出了巨大贡献。侧向层析检测方法最初是用来进行免疫分析，它运用纳米粒子和乳胶微球体能够对潜在的核酸进行即时的可视化检测。但是此方法标记步骤复杂，不能进行多重检测。
【发明内容】
[0004]本发明所 要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种简单、廉价、快速、适用于临床快速诊断的进行特异性DNA检测的试纸条技术。
[0005]本发明所采用的技术方案为:
[0006]一种运用SYBR Green I荧光染料进行特异性DNA检测的试纸条技术，包括以下步骤:
[0007](I)试纸条材料的选择:选择尼龙膜作为试纸条的材料。
[0008](2)探针感知层的制备:将探针点到尼龙膜上，所述探针为待检测的特异性核苷酸序列，然后用紫外线对尼龙膜进行照射，然后烘烤，最后黑暗干燥储存。该步骤可以有效提高探针与待测样品的杂交信号。
[0009](3)待测样本的目标序列获得:运用普通PCR技术，根据待测样本和探针的同源序列特征设计一对引物进行PCR扩增，扩增完之后再94°C变性lOmin，然后立即放4°C，得到待测序列。
[0010](4)目标DNA的检测:使用缓冲液冲洗固定了探针的尼龙膜，然后在尼龙膜上点上杂交液，其中杂交液中包含SYBR Green I和步骤(3)得到的待测序列，室温黑暗杂交，接着用缓冲液、去离子水顺次清洗尼龙膜，最后用488-nm激光的成像扫描仪对湿润的尼龙膜成像，根据尼龙膜是否发出绿色荧光判定结果的阴阳性。
[0011]如果待测样本中存在待检测的特异性核苷酸序列，那么通过普通PCR扩增就能扩增出与探针互补的核苷酸片段，那么杂交液中便存在能与尼龙膜试纸条上的探针序列互补形成双链结构的序列，那么SYBR Green I荧光染料就插入到该双链DNA中，这样在紫外线的照射下，显出明亮的绿色荧光，此为阳性结果；反之，就是阴性结果。[0012]作为优选，所述步骤(1)中尼龙膜为长条状，尺寸为3cmX 0.5cm。
[0013]作为优选，所述步骤(2)中探针为若干个，该若干个探针以固定的间隔点在尼龙膜上。所述若干个探针为某一疾病/病毒相关的若干个靶序列或相关疾病/病毒的若干个靶序列。如设置于尼龙膜试纸条上的探针为流感病毒A、B、H1、H3四种，这样通过一次检测就可以同时进行对上述四种流感病毒类型进行同时检测，可以用于区分各种特异性DNA的类型，方便快速，检测结果针对性强，精确度高，对比性强，可区分度高。
[0014]作为优选，所述步骤(2)中探针的浓度为500nM、用量为0.5μ L。通过实验研究发现，当探针浓度为500ηΜ时，杂交信号达到饱和。
[0015]作为优选，所述步骤(2)中紫外线的波长为254nm、照射时间为2min。实验发现，经紫外照射的尼龙膜与未经照射的相比，杂交信号提高了 20-30%。紫外照射促进了探针与尼龙膜的交联反应，减少了杂交孵化阶段从膜上逃离的探针DNA，因此，能得到更高的荧光信号。
[0016]作为优选，所述步骤(2)中烘烤的温度为60°C、时间为5min。实验发现，将紫外交联过和未经紫外交联的膜均60°C烘烤5分钟，分别能将荧光信号提高20%和40%。实验证实更长的烘烤时间并不能进一步提高杂交信号。
[0017]作为优选，所述步骤(4)缓冲液为TE缓冲液。
[0018]作为优选，所述步骤(4)杂交液中SYBR Green I的浓度为2.5mM、目标序列的浓度为 250nM。
[0019]作为优选，所述步骤(4)中室温黑暗杂交的时间为5min。通过实验研究发现，杂交5分钟与杂交20分钟产生的荧光信号相似，更长的杂交时间反而会使信号减弱。这可能是由于长时间的杂交孵化会导致一些固定了的探针从膜上释放。
[0020]本发明将点在尼龙膜上未经修饰的核苷酸序列作为捕获探针，检测过程仅需要使靶DNA与SYBR Green I混合物孵育5分钟，短暂清洗膜条之后，用平板扫描仪进行成像，如果在膜条特定位置出现荧光点，说明存在与此处探针互补的靶基因。与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果:
[0021](I)本发明开发了一种在尼龙膜上用紫外交联(254nm，2min)和短暂热处理(60°C，5min)来固定探针的方法，紫外交联将DNA信号提高了 20%_30%，热处理将DNA信号提闻了 20% ；
[0022](2)通过荧光染料的SYBR Green I显色进行结果的判断，无需对探针进行标记(如TaqMan?探针或分子信标(molecular beacon)),操作简单,灵敏度高,特异性强,在很大程度上降低了检测费用；
[0023](3)选用SYBR Green I作为荧光染料、尼龙膜作为试纸条的组合进行特异性DNA检测，经过检测，证实了该组合与包括 SYBR Green 1、LCGreen, EvaGreen, SYT09、SYTOl3,LightCycler480ResoLight在内的双链DNA染料和包括尼龙膜、硝化纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)在内的纸质垫板的其他组合相比，其在进行核酸检测时，信噪比最大，最适于进行试纸条特异性核酸的检测；
[0024](4)本发明无需用到成本昂贵的生化或免疫仪器，仅需一台普通的PCR仪便可实现特异性DNA的检测，这使检测成本大大降低；
[0025](5)本发明检测方法操作简单，结果显示快速，专一针对性强，非常适合医生在望闻问切、初步确认了几种可疑的病因之后，进行进一步的病症确认，适用于临床推广。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1所示的是运用本发明进行流感病毒A、B、H1、H3检测的结果图。
【具体实施方式】
[0027]以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属【技术领域】人员通常理解的相同含义。
[0028]主要材料和试剂:
[0029]SYBR Green I 购于 Invitrogen (Life Technology Pte Ltd, Singapore);尼龙膜购于Bio-Rad (Hercules, USA);流感病毒A、B、Hl、H3样本分别来自于4位感染流感病毒A、B、Hl、H3病人的鼻拭子浸出液；探针A、B、H1、H3、各引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。
[0030]实施例1:
[0031]本实施例旨在检测流感病毒A、B、H1、H3以及它们的混合物。具体探针及靶DNA的核苷酸序列如表1.所示。
[0032]表1.流感病毒A、B、H1、H3探针及靶DNA序列
[0033]
【权利要求】
1.一种运用SYBR Green I荧光染料进行特异性DNA检测的试纸条技术，其特征在于包括以下步骤: (1)选择尼龙膜作为试纸条的材料； (2)将探针点到尼龙膜上，所述探针为待检测的特异性核苷酸序列，然后用紫外线对尼龙膜进行照射，然后烘烤，最后黑暗干燥储存； (3)运用普通PCR技术，以待测样本为模板、以探针为模板设计的一对引物为引物进行PCR扩增，扩增完之后再94°C变性lOmin，然后立即放4°C，得到待测序列； (4)使用缓冲液冲洗固定了探针的尼龙膜，然后在尼龙膜上点上杂交液，其中杂交液中包含SYBR Green I和步骤(3)得到的待测序列，室温黑暗杂交，接着用缓冲液、去离子水顺次清洗尼龙膜，最后用488-nm激光的成像扫描仪对湿润的尼龙膜成像，根据尼龙膜是否发出绿色荧光判定结果的阴阳性。
2.根据权利要求1所述的运用SYBRGreen I荧光染料进行特异性DNA检测的试纸条技术，其特征在于:所述步骤(1)中尼龙膜为长条状，尺寸为3cmX0.5cm。
3.根据权利要求1所述的运用SYBRGreen I荧光染料进行特异性DNA检测的试纸条技术，其特征在于:所述步骤(2)中探针为若干个，该若干个探针以固定的间隔点在尼龙膜上。
4.根据权利要求 3所述的运用SYBRGreen I荧光染料进行特异性DNA检测的试纸条技术，其特征在于:所述若干个探针为某一疾病/病毒相关的若干个靶序列或相关疾病/病毒的若干个靶序列。
5.根据权利要求1所述的运用SYBRGreen I荧光染料进行特异性DNA检测的试纸条技术，其特征在于:所述步骤(2)中探针的浓度为500nM、用量为0.5μ L。
6.根据权利要求1所述的运用SYBRGreen I荧光染料进行特异性DNA检测的试纸条技术，其特征在于:所述步骤(2)中紫外线的波长为254nm、照射时间为2min。
7.根据权利要求1所述的运用SYBRGreen I荧光染料进行特异性DNA检测的试纸条技术，其特征在于:所述步骤(2)中烘烤的温度为60°C、时间为5min。
8.根据权利要求1所述的运用SYBRGreen I荧光染料进行特异性DNA检测的试纸条技术，其特征在于:所述步骤(4)缓冲液为TE缓冲液。
9.根据权利要求1所述的运用SYBRGreen I荧光染料进行特异性DNA检测的试纸条技术，其特征在于:所述步骤(4)杂交液中SYBR Green I的浓度为2.5mM、待测序列的浓度为 250nM。
10.根据权利要求1所述的运用SYBRGreen I荧光染料进行特异性DNA检测的试纸条技术，其特征在于:所述步骤(4)中室温黑暗杂交的时间为5min。
【文档编号】C12Q1/68GK103898229SQ201410151521
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】李孟皇, 边红武, 韩凝, 武金霞 申请人:杭州希诺生物科技有限公司