转基因水稻科丰2号品系特异性实时荧光定量pcr检测引物、检测方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了转基因水稻科丰2号品系特异性实时荧光定量PCR检测引物、检测方法和试剂盒。所述PCR检测引物的核苷酸序列为SEQ?ID?No.2和SEQ?ID?No.3所示，所述探针的核苷酸序列为SEQ?ID?No.4所示。本发明还公开了一种转基因水稻科丰2号品系特异性的实时荧光定量PCR检测方法，包括：（1）提取待检测水稻样品的DNA；（2）以提取的DNA为模板，以所述特异性检测引物建立PCR反应体系并进行扩增；（3）根据收集的荧光曲线和Ct值判定检测结果。特异性、灵敏度、可靠性和检测限实验结果表明，本发明转基因水稻科丰2号品系特异性实时荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可靠性好。
【专利说明】转基因水稻科丰2号品系特异性实时荧光定量PCR检测引物、检测方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及转基因水稻品系特异性的PCR检测引物及检测试剂盒，尤其涉及转基因水稻科丰2号品系特异性的实时荧光定量PCR检测引物、检测方法及检测试剂盒，属于转基因水稻品系特异性检测领域。
【背景技术】
[0002]随着转基因植物的广泛种植，转基因食品的安全性问题也引起人们极大的关注，已有30多个国家相继实施转基因产品标识制度，包括中国。转基因标识制度的实施依赖于对转基因植物及其加工产品的成分检测。PCR技术是目前国内外检测转基因产品中应用最广泛的方法。在应用这种技术进行转基因作物定性检测时，根据其特异性，将其分为筛选检测法、基因特异性方法、构建特异性方法和品系特异性方法。品系特异性检测是通过检测插入载体与植物基因组的连接区序列实现的，由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，和前三种方法比较，品系特异性具有更高的特异性和准确性，最适合做转基因产品检测。
[0003]目前，已有部分专利和文献报道了转基因植物的品系特异性检测方法。例如:张大兵等人于2006年建立了转基因M0N863玉米的品系特异性检测方法；谢家建等人建立了转基因水稻克螟稻、Bt汕优63、科丰6号和科丰8号等一系列品系特异性检测方法；卢长明等人于2007年建立了一系列转基因油菜的品系特异性检测方法。但是，迄今为止，缺乏一种转基因水稻科丰2号的品系特异性的实时荧光定量PCR检测方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供用于检测转基因水稻科丰2号的品系特异性实时荧光定量PCR检测引物及探针；
[0005]本发明的目的之二是建立一种转基因水稻科丰2号的品系特异性实时荧光定量PCR检测方法；
[0006]本发明的目的之三是提供一种转基因水稻科丰2号的品系特异性实时荧光定量PCR检测试剂盒。
[0007]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0008]本发明首先提供了一对用于检测转基因水稻科丰2号的品系特异性实时荧光定量PCR检测引物以及探针，所述引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.4所示。
[0009]本发明根据转基因水稻科丰2号品系中插入的目的基因为SCK基因(SEQ ID N0.5)通过H1-TAIL PCR获得外源插入基因5’端水稻侧翼序列和3’端水稻侧翼序列，所获得的含有SCK基因的外源插入载体及其两侧5’端和3’端侧翼水稻序列的连接区核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示；根据科丰2号外源插入载体和3’端水稻侧翼序列所形成的连接区核苷酸序列筛选出了一对特异性强、灵敏度高的转化体特异性引物及探针序列，其核苷酸序列为SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3所示；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.4所示。
[0010]本发明的目的之二是提供一种转基因水稻科丰2号的品系特异性的实时荧光定量PCR检测方法，该方法包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA ; (2)以提取的DNA为模板，以SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示核苷酸为扩增上下游引物，以SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列为探针，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)PCR反应结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果；
[0011]其中，在扩增样品的同时，进行SPS内标准基因扩增，在SPS内标准基因扩增时，空白对照无典型扩增曲线，阴性对照和阳性对照出现典型的扩增曲线；在转化体特异性序列扩增时，空白对照和阴性对照无典型扩增曲线，阳性对照出现典型的扩增曲线，表明反应体系工作正常；在反应体系正常的情况下，测试样品出现典型扩增曲线，且Ct值小于等于38，则表明检测出科丰2号转化体成分。
[0012]其中，所述的从待检测水稻样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA的各种常用方法，例如可以是CTAB法、异硫氰酸胍法或盐酸胍法等各种方法。
[0013]本发明中所述的PCR扩增体系可参考以下方法建立:反应体系的总体积为 20.0 μ L，其 Φ, 2XMixl0.0 μ L, 10.0 μ mol/L SEQ ID N0.2 所示上游引物 0.8 μ L,
10.0 μ mo I/LSEQ ID N0.3 所示下游引物 0.8 μ L, 10.0 μ mo I/LSEQ ID N0.4 所示探针 0.4 μ L，25ng/ μ L DNA模板2.0 μ L，余量为双蒸水。 [0014]所述的PCR扩增条件优选为:第一阶段95°C /1min ;第二阶段95°C /15s,95°C /60s，循环数 40 ；
[0015]本发明进一步的目的是提供一种转基因水稻科丰2号的品系特异性的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括:2 XMix缓冲液，扩增引物对，探针和双蒸水。
[0016]所述的PCR检测试剂盒中还含有SPS内标准基因扩增体系。
[0017]特异性、灵敏度、可靠性、检测限测试结果表明，本发明建立的转基因水稻科丰2号的品系特异性实时荧光光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高(灵敏度可达到20个拷贝)、可靠性好。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是H1-TAIL PCR扩增结果；M:1Kb plus Markerl:下游第二轮PCR产物2:下游第三轮PCR产物；3:上游第二轮PCR产物4:上游第三轮产物。
[0019]图2是上下游测序拼接结果(2614bp)。
[0020]图3是从已知序列的两端设计H1-TAIL PCR的嵌套引物。
[0021]图4是H1-TAIL PCR扩增结果；M:1Kb plus Markerl、上游第二轮PCR产物；2、上游第三轮产物；注:下游引物无条带。
[0022]图5是上下游测序拼接结果。
[0023]图6中，M:1Kb plus Markerl:空白对照；2:明恢86阴性对照3:科丰2号。
[0024]图7是长片段验证获得的整合结构、②、③、④、⑤分别代表:从所示意的位置设计长片段引物进行扩增。
[0025]图8是I号引物扩增结果:M:lKb plus Marker ；1:空白对照2:明恢86阴性对照3:科丰2号。
[0026]图9是2号引物扩增结果:M:100bp Marker ；1:空白对照2:明恢86阴性对照3:
科丰2号。
[0027]图10是3号引物扩增结果:M:lKb plus Marker, 1:空白对照2:明恢86阴性对照3:科丰2号。
[0028]图11是4号引物扩增结果:M:1Kb plus Marker, 1:空白对照2:明恢86阴性对照3:科丰2号。
[0029]图12是5号引物扩增结果:M:1Kb plus Marker, 1:空白对照2:明恢86阴性对照3:科丰2号。
[0030]图13是本发明定量方法的特异性测试结果。
[0031]图14是本发明定量方法的可靠性实验结果。
[0032]图15是灵敏度测试结果；拷贝数为5c0pieS和lcopies时，实时荧光扩增曲线及位于标准曲线的位置。
[0033]图16是检测极限第1次试验结果；A:SPS实时荧光图及标准曲线图；B:KF2实时荧光图及标准曲线图。
[0034]图17是检测极限第2次试验结果；A: SPS实时荧光图及标准曲线图；B:KF2实时荧光图及标准曲线图。
[0035]图18是检测极限第3次试验结果；A:SPS实时荧光图及标准曲线图；B:KF2实时荧光图及标准曲线图。
[0036]图19是检测极限第4次试验结果；A: SPS实时荧光图及标准曲线图；B:KF2实时荧光图及标准曲线图。
[0037]图20是检测极限第5次试验结果；A: SPS实时荧光图及标准曲线图；B:KF2实时荧光图及标准曲线图。
【具体实施方式】
[0038]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，这些实施例仅是范例性的，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0039]实验例I转基因水稻科丰2号品系中外源插入的SCK基因的侧翼序列的获得
[0040]转基因水稻科丰2号品系外源插入目的基因为SCK基因，共415bp，其碱基序列为SEQ ID N0.5所示。通过H1-TAIL PCR获得整合结构(外源插入基因侧翼序列)。
[0041] 1、第一步:在目的基因SCK上设计H1-TAIL PCR的嵌套引物
[0042]①下游引物:
[0043]Sck-spl CTTTCTCATCATCTTCATCCCTGGACTTG
[0044]Sck-sp2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCGATTTGCAAGCCGAGTGACACGAATT
[0045]Sck-sp3 TTGATTTAGTGCAGATGCATGAATCGC
[0046]上游引物:
[0047]Sck-Apl GCACCATCTTCTTTGCTCTCTTTCTCTGT
[0048]Sck-Ap2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCTTTCGTTTTAAAGGTGTGTGTGCTGGTAC[0049]Sck-Ap3 TGATGACTCAAGCGATGAACCTTCTGAG
[0050]随机引物:
[0051]ADl-1 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA
[0052]AD1-2 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT
[0053]AD1-3 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAA
[0054]AD1-4 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNAGGT
[0055]AD-C ACGATGGACTCCAGAG
[0056]②PCR结果见图1。
[0057]③上下游测序拼接结果(2614bp)见图2。
[0058]2、第二步:从已知序列的两端设H1-TAIL PCR的嵌套引物
[0059]图3为嵌套引物设计的示意图。
[0060]①下游引物:
[0061]OSP-SPI AGATTAAAATAGCTTTCCCCCGTTGTAGC
[0062]0SP-SP2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCAAAGTGCTATCCACGATCCATAGCAAG
[0063]0SP-SP3 CAATAGTCTCCACACCCCCCCACTATC
[0064]上游引物:
[0065]hptl1-APl GCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATC
[0066]hptI1-AP2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAG
[0067]hptI1-AP3 CGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCG
[0068]随机引物:同上。
[0069]②PCR结果见图4。
[0070]③上下游测序拼接结果(3840bp)见图5。
[0071]3.第三步:根据5’端获得的水稻序列，得到3’端水稻序列。然后，在水稻启动子上设上游引物，水稻3’端序列上设下游引物，通过长片段扩增得到3’端侧翼序列。
[0072]①下游引物:
[0073]0SJ-3’ -AP: CGCTTTGACCTAAGTTTGCACGGAC
[0074]上游引物:
[0075]OSP-SP: CAATAGTCTCCACACCCCCCCACTATC
[0076]②PCR结果见图6。
[0077]③测序拼接结果(5423bp)见图7。
[0078]4、全部测序结果:全部的连接区序列(外源插入载体(含有SCK基因)和两侧的水稻侧翼序列的连接区)为SEQ ID N0.1所示。
[0079]5、长片段验证获得的整合结构
[0080]按照图7中①、②、③、④、⑤分别代表所示意的位置设计长片段引物进行扩增，预期大小分别为:1.4Kb、1176bp、817bp、2.3kb、4443bp ;扩增结果分别见图8、图9、图10、图
11、图 12。
[0081]实验例2转基因水稻科丰2号品系特异性实时荧光定量PCR检测方法的建立
[0082]1、定量引物、探针及扩增片段
[0083]I TAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTTTGCTCTAGTTGCGAATCGCGCATATGAAAT[0084]61 CACACCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGC<CGA,\(x(:(;rT((:T(T
[0085]121 Egctaa^aIcGGCCGCAGCGATCGCATCCTTAGGTCAAAGCGGTTTGTTTGCTCTAACAT
[0086]181 CACAACTTGTATAGTCCGTGC
[0087]Kefeng2-F-dl:TAGTGTATTGACCGATTCCTTGC (SEQ ID N0.2)
[0088]Kefeng2-R-dl:GCACGGACTATACAAGTTGTGATGT (SEQ ID N0.3)
[0089]Kefeng2-P:CGAACCCGCTCGTCTGGCTAAGAT (SEQ ID N0.4)
[0090]预期扩增片段大小:132bp。
[0091]2、DNA 提取
[0092]采用天根植物基因组提取试剂盒提取待检测植物材料的DNA，并将DNA稀释至25ng/μ L0
[0093]3、PCR反应体系建立
[0094]表1实时荧光PCR检测反应体系
[0095]
【权利要求】
1.用于检测转基因水稻科丰2号品系特异性的实时荧光定量PCR检测引物及探针，其特征在于:所述引物的核苷酸序列分别为SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.4所示。
2.—种转基因水稻科丰2号品系特异性的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA ；(2)以提取的DNA为模板，以SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.3所示核苷酸为扩增上、下游引物建立PCR反应体系并进行PCR扩增；(3)根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
3.按照权利要求2所述的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括:在反应体系正常的情况下，如果待检测样品出现典型扩增曲线，且Ct值小于或等于38，则表明待检测样品中含有转基因水稻科丰2号转化体成分。
4.按照权利要求2所述的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于:所述的PCR反应体系的总体积为20.0 μ L，其中，2 XMixl0.0 μ L, 10.0 μ mol/L SEQ ID N0.2所示的上游引物0.8 μ L，10.0 μ mol/L SEQ ID N0.3 所示的下游引物 0.8 μ L，10.0 μ mol/L SEQ ID N0.3 所示探针0.4 μ L，25ng/ μ L DNA模板2.0 μ L，余量为双蒸水。
5.按照权利要求2所述的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于:所述的PCR扩增条件为:第一阶段950C，1min ;第二阶段95°C，15s，95。。，60s，循环数40。
6.一种转基因水稻科丰2号的品系特异性的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括:2XMix，扩增引物对，探针和双蒸水；其特征在于:所述扩增引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID N0.2和SEQ ID N0 .3所示；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.4所示。
7.按照权利要求6所述的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:含有SPS内标准基因扩增体系。
【文档编号】C12Q1/68GK104031982SQ201410081751
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】宛煜嵩, 梁利霞, 张秀杰, 朱祯, 金芜军, 苗朝华, 李亮, 董美 申请人:中国农业科学院生物技术研究所