一种茄病镰刀菌荧光定量pcr检测技术及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种茄病镰刀菌的荧光定量PCR检测技术及应用。专用于检测瓜类、菜豆、豌豆、胡椒、山椒农作上的茄病镰刀菌。该技术包括如下步骤：样本中DNA提取，特异性引物设计，应用以SYBRGreenI为基础的染料法荧光定量PCR检测技术对茄病镰刀菌的ITS区基因片段进行实时荧光定量PCR检测，构建标准曲线，计算待测样本中的ITS区基因片段拷贝数和茄病镰刀菌的浓度。该检测技术操作简便、快速；特异性强、灵敏度高；检测灵敏度最高可达到40个拷贝数每个反应，并且可以同时进行大批量的土壤、种子样本分析，为病害的早期预测预报提供了良好的基础，因此该方法适于在植物病害诊断检测领域广泛推广应用。
【专利说明】-种茄病镰刀菌荧光定量PCR检测技术及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明为一种茄病镰刀菌的荧光定量PCR检测技术及应用，专用于检测瓜类、菜 豆、豌豆、胡椒、山椒农作上的茄病镰刀菌，属于农作物病害诊断与防治【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 爺病镰刀菌[/7W1Sariiffl? (Mart. ) Sacc.]是一类世界性分布重要 的植物病原真菌，在真菌分类系统中隶属于无性型真菌（Anamorphic fungi)、丝孢纲 、瘤座抱目、瘤座抱科、鎌刀菌属 (/7W1SarittT?)，马特组（Section Martiella)。有性阶段属于肉座菌科（Hypocreaceae)、丛赤 壳属(Afeciria)。茄病镰刀菌分布非常广泛，普遍存在于土壤，植物和动物体内等，对人类的 生产、生活造成了很大的危害。引起各种粮食作物、园艺作物、中草药等的根腐、茎腐、茎基 腐，造成作物萎蔫死亡，侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并在生长 发育代谢过程中产生毒素危害作物，其寄主范围广泛，仅蔬菜上的寄主就包括5类蔬菜，分 别由瓜类、菜豆、豌豆、胡椒、山椒，是生产上最难防治的重要病害之一(李鹏，2009 ;林清洪， 2007 ;周黎，2008 ;薛彩云，2007)。
[0003] 在病害症状明显表现之前不容易预测和避免茄病镰刀菌的侵染，而且土壤中的病 原菌也会随着灌溉水从一个地方的土壤传播到另一个地方，病害表现前是防治的最佳时 期，一旦发病症状显现就难以治愈，严重威胁到产量，因此，发展有效且快速的茄病镰刀菌 快速检测技术，有效的避免该病的蔓延和传播，对于茄病镰刀菌引起的土传病害的防治具 有十分重要的意义。
[0004] 实时突光定量 PCR 技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 简称（RT-PCR))是在常规定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。通常实时荧光定 量PCR技术所使用的荧光化学剂包括TaqMan荧光探针和SYBR荧光染料。该技术作为一种 快速，灵敏，特异性高并且可以定量检测病原菌的检测方法现已广泛应用于植物真菌的检 测。采用SYBR Green实时定量PCR方法对小麦种传病害进行检测取得了较好效果（McEwan et al.，2000)，应用实时定量PCR方法检测不同感染比例小麦种子上的镰刀菌的含量，表 明种子感染的程度与种子上镰刀菌的含量的相关性（Glynn et al.，2010)。这为我们检测 茄病镰刀菌技术的研究提供了有力基础。
[0005] RT-PCR是通过PCR在指数扩增期间连续检测荧光信号的强弱来即时检测特异性 产物的量，并据此评估目的基因的起始模板量。与常规PCR相比，具有操作简便、高效快速、 敏感性强、可重复性好和特异性高的优点。SYBR Green I荧光定量PCR的工作原理是在常 规PCR的体系中加入荧光染料SYBR Green I，SYBR Green I是一种结合于双链DNA小沟 中的荧光染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。在PCR反应体系中加入过量的SYBR Green I荧光染料，荧光染料能够特异性地掺入到DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链 中的荧光染料分子不发射任何荧光信号。从而随着PCR反应的进行，保证荧光信号的增强 与PCR产物增加完全同步，信号增强到某一阈值的循环次数(用循环阈值Ct表示)被记录下 来，Ct值和PCR体系中起始模板的对数之间有严格的线性关系，利用阳性定量标准品扩增 的Ct值和标准曲线，再根据待测样品的Ct值就可以准确计算出起始模板中某核酸的存在 及数量。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种爺病镰刀菌的突光定量PCR快速检测的方法。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种荧光定量PCR检测技术在瓜类、菜豆、豌豆、胡 椒、山椒茄病镰刀菌引起的土传病害流行监测预报，土壤带菌以及种子带菌检测方面的应 用。
[0008] 该检测技术，在植物病害诊断与防治领域可以大规模推广。
[0009] 本发明的目的通过以下技术方案实现： 该方法的实验步骤为：从待测样本提取DNA ;将加入标准品及待测样品的荧光定量反 应液上机，用荧光定量检测仪进行PCR检测；通过比较待测样品和标准品的循环阈值，根据 标准曲线计算出待测样品的起始DNA浓度。
[0010] 本发明的技术具体包括如下步骤： 1、 取田间自然发病土壤、发病植株、蔬菜种子，进行总DNA的提取纯化，得到DNA样本； 2、 特异性引物设计，为避免由于引物专化性较低，PCR反应中出现假阳性结果或 对非目标真菌产生非特异性扩增，本发明在系统分析茄病镰刀菌的ITS区、18SrRNA和 5. 8SrRNA核酸序列系统发育的基础上，对已经发表在GenBank上的不同国家和地区茄病 镰刀菌rDNA-ITS基因的序列进行比较，利用Primer render 5.0软件在茄病镰刀菌基 因的 rDNA-ITS 区设计一对特异性引物 FSFl :5' -GCTAACAATCATCTACAGAC-3' ；FSR1 :5' -GACGGATGAGAGAGC-3'，扩增片段长度为 487 bp (图 1)。
[0011] 腫 18S rRNA、ITS1、5. 8S rRNA 和 ITS2 部分序列 NCBI 登录号为 (DQ986152. 1)。
[0012] 3、实时荧光定量PCR反应体系为：荧光定量PCR反应体系总体积为25μ1，其中 SYBR Premix Ex Taq(内含 TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I ) 12. 5μ1，浓度为lOMmol/L的正义引物FSFl和反义引物FSRl各0. 5μ1，标准品10倍梯度稀 释液或待检测样品DNA溶液2μ1，CldH2O补齐至25μ1 ; 4、 PCR反应程序为：PCR采用两步法，95°C预变性3min，接着进行35个循环，每个循环 包括95°C变性30s、60 °C退火30s、72 °C延伸1.5min;PCR完成后，按0. 1°C s-1升温速 率从72°C升至95°C进行融解曲线的分析验证； 5、 插入ITS区的pMD-18T载体转化大肠杆菌DH5 α增殖后提取的质粒基因组DNA，DNA 经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释，稀释成6个浓度梯度，按照上述PCR反应体 系和程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值（Ct)采用计算机自动绘制 荧光定量PCR标准曲线； 6、 取步骤1)中得到的DNA样本作为模板，按上述荧光定量PCR反应体系和反应程序在 实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照 采用ddH 20,阳性对照采用质粒基因组DNA ;反应结束后，将DNA样本的循环阈值（Ct)与标 准曲线对照，得到DNA样本中的ITS区基因片段拷贝数，进而得到原来样本中根肿病菌的浓 度。
[0013] 检测茄病镰刀菌的荧光定量PCR检测技术可以转化成商品化的试剂盒，包括标准 阳性DNA模板、荧光定量反应液。
[0014] 标准阳性DNA模板由含有插入目的片段的pGM-T (购自天根公司）载体制备而成。 标准品的制备过程为：采用引物ITSl和ITS4扩增根肿病菌的ITS区，PCR产物电泳后切下 含有目标片段的凝胶，目标片段用凝胶试剂盒回收纯化后与PGM-T载体16°C过夜连接，转 化大肠杆菌DH5a感受态细胞。转化产物涂平板培养，挑去白斑，采用引物为FSF1/FSR1进 行PCR鉴定。阳性克隆通过序列分析进一步鉴定结果的可靠性。选择PCR和序列分析均为 阳性的克隆，接种到含有氨苄青霉素的LB培养基过夜培养，采用质粒小提试剂盒(购自天 根公司)制备质粒DNA。DNA经紫外分光光度计A260定量，经10倍梯度稀释为200ng-200fg/ UL，保存于-20°C。
[0015] 荧光定量反应液由正义引物FSFl、反义引物FSRl、荧光染料SYBR Premix Ex Taq 内含 TaKaRa Ex Taq TM HS, dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I 组成。
[0016] 本发明提供的茄病镰刀菌荧光定量PCR检测技术，针对茄病镰刀菌基因组ITS区 特异的靶序列设计引物，通过优化反应体系（引物浓度、扩增程序等）的优化，采用定量检测 系统(包括ABI Prism系统、PE Applied Bioasystems、Bio_Rad)，可用于各种来源的爺病镰 刀菌的定量检测。引物对的检测限点为13个细胞每个反应。
[0017] 本发明与现有技术相比具有以下优点和效果： 1)特异性好、鉴定快速 引物包括茄病镰刀菌的特异性序列，检测特异性高。环境中，特别是蔬菜根际微生物种 类繁多，不容易进行分离培养后检测，本发明克服了这一不足之处，并且检测快速。
[0018] 2)准确定量、灵敏度高 与普通PCR检测相比，本发明可以准确定量，目标DNA在200ng-200fg/ μ L浓度范 围内，都有良好的线性关系；同时检测具有重复性好的特点。
[0019] 3)实用性好、应用范围广 可以定量检测植物植株、土壤、种子以及水中的茄病镰刀菌，结合蔬菜茄病镰刀菌的田 间发病阈值，可以为病害的早期预测预报提供有力参考。
[0020]
【专利附图】
【附图说明】 图1是引物对FSF1/FSR1特异性检测PCR扩增结果。1的模板为茄病镰刀菌基因组DNA， 2-10的模板分别为马铃薯粉痂菌DNA、禾谷多粘霉菌DNA、尖孢镰刀菌基因组DNA、串珠镰 刀菌基因组DNA、辣椒疫霉菌基因组DNA、瓜果腐霉菌基因组DNA、立枯丝核菌基因组DNA、西 瓜壳二孢基因组DNA、核盘菌基因组DNA、西瓜炭疽菌基因组DNA，N为阴性对照，M为250bp DNA Ladder (Takara 公司）； 图2实施例3荧光定量PCR扩增的标准曲线 纵轴为Ct，横轴为Log CO ;标准误为0. 9985 ; 图3实施例3荧光定量PCR阳性标准品的扩增曲线 纵轴为 Delta Rn ;横轴为 Cycle Number ; 曲线1，2, 3,4, 5和6的模板为阳性标准品，反应体系中DNA含量分别为I. 36ng，136pg， 13. 6pg，I. 36pg，136fg，13. 6fg ; 图4实施例2荧光定量PCR检测威百亩处理后定制黄瓜前土壤中茄病镰刀菌动态变 化 纵轴为茄病镰刀菌孢子数量；横轴为处理时间； 图5实施例2荧光定量PCR检测威百亩处理后定制黄瓜后土壤中茄病镰刀菌动态变 化 纵轴为茄病镰刀菌孢子数量；横轴为处理时间。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实例，进一步阐述发明。应当理解，下列实例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明要求保护范围。应用实例中DNA提取采用的是试剂盒，实际应用中也可以 采用改良CTAB等方法。
[0022] 实施例1 :爺病镰刀菌的特异性引物检测 茄病镰刀菌及其他病原菌真菌和细菌菌菌株见表1。病原真菌菌株用PDA(每1000 ml 培养基马铃薯200 g，葡萄糖20g，琼脂20 g)或Η)液体培养基(每1000 ml培养基马铃薯 200 g，葡萄糖20g)培养；土传病原细菌菌株用NA培养基(每1000 ml培养基牛肉膏5g，蛋 白胨l〇g，氯化钠5g，琼脂20g)或NA液体培养基海1000 ml培养基牛肉膏5g，蛋白胨10g， 氯化钠5g)培养。所有菌株先在固体培养基上活化，然后转入液体培养基培养，1周后收集 菌丝或菌体提取DNA。DNA的提取采用改良的CTAB提取法（Sambr 〇〇k，1989)。
[0023] 对已经发表在GenBank上的不同国家和地区茄病镰刀菌rDNA-ITS基因的序列 进行比较，利用Primer render 5.0软件在茄病镰刀菌基因的rDNA-ITS区设计一对特 异性引物 FSFl :5' -GCTAACAATCATCTACAGAC-3 ' ；FSR1 :5' -GACGGATGAGAGAGC-3'，扩增片 段长度为487bp，引物由上海生工科技有限公司合成。使用时引物用双蒸灭菌水稀释至 10 μ mol · L、
[0024] 以茄病镰刀菌及其它病原菌真菌及细菌的基因组DNA为模板，利用引物FSFl/ FSRl进行普通PCR扩增，以检测该引物的特异性。普通PCR反应体系如下：总反应体积 25 μ L，10 XPCR buffer2. 5 μ L，dNTP (10 μ mol/L) 0· 5 μ L，引物（10 μ mol/L)各 0· 5 μ L，模 板DNA3. 0 μ L，TapDNA聚合酶1 μ L，最后以ddH20补足至25 μ L。PCR反应程序为：94°C预 变性 3min ;94°C变性 30s，52°C退火 lmin，72°C延伸 I. 5min，共 40 个循环；72°C延伸 7 min。 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测（图1)。
[0025] 表1弓丨物特异性检测菌株
【权利要求】
1. 一种茄病镰刀菌的荧光定量PCR检测技术，其特征在于包括以下步骤： 1) 取田间自然发病土壤、发病植株、茄果类蔬菜种子，进行总DNA的提取纯化，得到DNA 样本； 2) 特异性引物设计，对已经发表在GenBank上的不同国家和地区茄病镰刀菌rDNA-ITS 基因的序列进行比较，利用Primer render 5.0软件在茄病镰刀菌基因的rDNA-ITS区设 计一对特异性引物，根据Genbank中公布的爺病镰刀菌rDNA-ITS区序列设计特异性引物 对 EF1/EF2 : 引物对：正向引物 5' -GCTAACAATCATCTACAGAC-3' 反向引物 5 ' -GACGGATGAGAGAGC-3 ' 3) 实时荧光定量PCR反应体系为：荧光定量PCR反应体系总体积为25W，其中SYBR Premix Ex Taq(内含 TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I ) 12. 5W，浓度为10Mm〇l/L的正义引物EF1和反义引物EF2各0. 5W，标准品10倍梯度稀释 液或待检测样品DNA溶液2W，ddH20补齐至25W ; 4. PCR反应程序为：PCR采用两步法，95°C预变性3min，接着进行35个循环，每个循环 包括95°C变性30s、60 °C退火30s、72 °C延伸1.5min;PCR完成后，按0. 1°C s-1升温速 率从72°C升至95°C进行融解曲线的分析验证； 5) 插入ITS区的pMD-18T载体转化大肠杆菌DH5 a增殖后提取的质粒基因组DNA，DNA 经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释，稀释成7个浓度梯度，按照上述PCR反应体 系和程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值（Ct)采用计算机自动绘制 荧光定量PCR标准曲线； 6) 取步骤1)中得到的DNA样本作为模板，按上述荧光定量PCR反应体系和反应程序 在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对 照采用ddH20,阳性对照采用茄病镰刀菌菌株基因组DNA ;反应结束后，将DNA样本的循环阈 值（Ct)与标准曲线对照，得到DNA样本中的ITS区基因片段拷贝数，进而得到原来样本中 茄病镰刀菌的浓度。
2. 权利要求书1所述的检测茄病镰刀菌的荧光定量PCR检测技术可以转化成商品化 的试剂盒，试剂盒包括：正义引物EF1、反义引物EF2、荧光染料SYBR Premix Ex Taq内含 TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I、以及由插入 ITS 区的pMD-18T 载体转化大肠杆菌DH5 a增殖后提取的质粒DNA，DNA经紫外分光光度计A260定量并10倍 梯度稀释。
3. 该技术可以应用于对农田环境中，包括对土壤中越冬菌量和发病植株瓜类、菜豆、豌 豆、胡椒、山椒5类蔬菜上茄病镰刀菌进行实时监测，以及检测瓜类、菜豆、豌豆、胡椒、山椒 等5类蔬菜种子带菌和田间灌溉水中的茄病镰刀菌。
【文档编号】C12Q1/68GK104372068SQ201310348495
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月12日 优先权日:2013年8月12日
【发明者】石延霞, 李宝聚, 赵一杰, 谢学文, 柴阿丽 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所