专利名称：荧光定量pcr检测醋醅中五种菌的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及荧光定量PCR技术应用于固态酿醋微生物群落中特定种属微生物的定量研究。
背景技术：
我国食醋的生产历史悠久，根据产地、品种的不同，食醋中醋酸含量也不尽相同。例如山西老陈醋的酸味较浓，而镇江香醋的酸味酸中带柔，酸而不烈。各地酿醋工艺、口感等的不同，造就了山西老陈醋、镇江恒顺香醋、福建永春老醋、保宁醋“四大名醋”。但众多的食醋生产厂家的发酵过程都以传统的经验为主，工艺可控性较差，并且产品品质存在批次差异，尤其是风味差异较大。这主要是由于酿造过程中微生物复杂多样，对醋醅发酵过程中的微生物作用机制不清楚。中国食醋的酿造工艺是多菌种混合发酵工艺，通过多种微生物的代谢作用产生风味饱满、酸味柔和的食醋。食醋的生产中有两个主要的发酵阶段:酒精发酵和醋酸发酵。在酒精发酵阶段，淀粉质原料如糯米、高粱等经过霉菌和酵母菌的一系列代谢，最终生成酒精；而在醋酸发酵阶段是包括醋酸菌、乳酸菌在内的众多细菌起主要的作用，该阶段是决定食醋风味和品质的关键步骤。其中乳酸菌属是醋酸发酵过程的优势微生物，乳酸菌可以代谢产生乳酸，不仅可以改善食醋的口感，可以对乙酸的刺激口感起到缓冲作用，使得食醋的酸味更加的柔和。而其中主要的乳酸菌包括瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌等，阐明发酵过程中几种乳酸菌生物量的动态变化对于控制食醋发酵过程以及提高产品的风味具有重要的生产意义。荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了 DNA模板的定量，而且具有特异性强、灵敏度高、高通量、全封闭反应、定量准确、速度快及自动化程度高等特点。本发明成功运用了荧光定量PCR技术对醋醅中瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行定量，并得到其生物量在食醋发酵过程中的动态变化。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有食醋固态酿造分析技术的不足，提供了一种分子生态技术用于定量检测固态酿造食醋发酵过程中瑞士乳杆菌helveticus、、卷曲乳杆菌(Xactobacillus crispatus、、干酪乳杆菌(Xactobacilluscasei )、德氏乳杆菌{Lactobacillus delbrueckii )和嗜酸乳酸菌{Lactobacillusacidophilus)的动态变化，以指导实践。本发明是通过以下方案实现的，本发明针对醋醅群落中的瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌分别设计特异性引物，提取分离纯化得到的几种乳酸菌的基因组，然后分别利用设计特异性引物进行PCR得到特异性目的片段，再将目的片段与PMD19-T Vector连接，获得重组质粒，将重组质粒转化JM109大肠杆菌感受态细胞，挑取成功转化的转化子进行扩大培养，获得高浓度质粒，然将此高浓度质粒做10倍比稀释，作为荧光定量PCR的标准品。利用液氮研磨、酶法和高盐结合的方法提取发酵过程中不同时间点醋醅群落的总DNA作为待测样品，将标准样品和待测样品同时进行荧光定量PCR，绘制标准曲线，然后根据标准曲线分别计算待测样品中瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌的含量。对于瑞士乳杆菌的荧光定量PCR方法，检测拷贝数在4.18 X 104_4.18 X IO11copies/μ L范围时，Real-time PCR的扩增曲线为一组典型的倒S曲线,扩增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区能够汇于一起，线性范围比较宽。质粒标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。该标准曲线的线性方程是y=_0.2997x+12.882，线性相关系数为0.9929，具有较好的线性关系，根据公式E=KTk-1 (k_标准曲线的斜率)，算得Real-timePCR的扩增效率为0.99，在0.8-1.2之间，扩增效率理想。另外瑞士乳杆菌Real-time PCR熔解曲线，在85°C左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非特异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好，以此为基础进行定量是可靠的。对于卷曲乳杆菌的荧光定量PCR方法，检测拷贝数在1.22X IO4-L 22X IO11copies/μ L范围时，Real-time PCR的扩增曲线为一组典型的倒S曲线,扩增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区能够汇于一起，线性范围比较宽。质粒标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。该标准曲线的线性方程是y=_0.3098x+12.206，线性相关系数为0.9988，具有较好的线性关系，根据公式E=10_k-1 (k_标准曲线的斜率)，算得Real-timePCR的扩增效率为1.04，在0.8-1.2之间，扩增效率理想。另外卷曲乳杆菌Real-time PCR熔解曲线，在83.5°C左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非特异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好，以此为基础进行定量是可靠的。对于干酪乳杆菌的荧光定量PCR方法，检测拷贝数在2.04X 104_2.04X IO11copies/μ L范围时，Real-time PCR的扩增曲线为一组典型的倒S曲线,扩增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区能够汇于一起，线性范围比较宽。质粒标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。该标准曲线的线性方程是y=_0.3099x+12.497，线性相关系数为0.9946，具有较好的线性关系，根据公式E=KTk-1 (k_标准曲线的斜率)，算得Real-timePCR的扩增效率为1.04，在0.8-1.2之间，扩增效率理想。另外卷曲乳杆菌Real-time PCR熔解曲线，在83°C左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非特异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好，以此为基础进行定量是可靠的。对于德氏乳杆菌的荧光定量PCR方法，检测拷贝数在8.99 X 104_8.99 X IO11copies/μ L范围时，Real-time PCR的扩增曲线为一组典型的倒S曲线,扩增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区能够汇于一起，线性范围比较宽。质粒标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。该标准曲线的线性方程是y=_0.3123x+12.328，线性相关系数为0.9981，具有较好的线性关系，根据公式E=KTk-1 (k-标准曲线的斜率)，算得Real-timePCR的扩增效率为1.05，在0.8-1.2之间，扩增效率理想。另外卷曲乳杆菌Real-time PCR熔解曲线，在82.5°C左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非特异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好，以此为基础进行定量是可靠的。
对于嗜酸乳杆菌的荧光定量PCR方法，检测拷贝数在1.95X 104-1.95X 10ncopies/μ L范围时，Real-time PCR的扩增曲线为一组典型的倒S曲线,扩增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区能够汇于一起，线性范围比较宽。质粒标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。该标准曲线的线性方程是y=_0.301X+11.513，线性相关系数为
0.9983，具有较好的线性关系，根据公式E=10_k-1 (k_标准曲线的斜率)，算得Real-timePCR的扩增效率为1.00，在0.8-1.2之间，扩增效率理想。另外卷曲乳杆菌Real-time PCR熔解曲线，在79°C左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非特异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好，以此为基础进行定量是可靠的。荧光定量PCR技术检测醋醅微生物群落中瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌的方法，具体步骤如下:
1、设计、合成针对瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌的特异性引物。2、对分离纯化得到的瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行摇瓶培养，利用细菌提取试剂盒分别对其培养液进行DNA提取。3、分别以瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌的DNA为模板，以 Lhe-F/Lhe-R、Lcr-F/Lcr-R、Lca-F/Lca-R、Lde-F/Lde-R 和 Lacid-F/Lacid-R 为引物进行PCR扩增，获得目的片段，并将PCR产物割胶回收。4、构建重组质粒，将目的片段与pMD19-T Vector连接，连接后转化JM109大肠杆菌感受态细胞，挑取转化子扩大培养，提取质粒，并用PCR验证目的片段是否插入PMD19-TVector,验证成功的质粒作为突光定量PCR的标准样品。5、利用液 氮研磨、酶消化和高盐提取结合的方法提取发酵过程中不同时间点醋醅群落的总DNA作为待测样品。6、荧光定量PCR反应体系和反应条件的确立。通过反复试验，确定最优反应体系和循环条件。7、建立标准曲线，重组质粒倍比稀释8个梯度，与待测样品同时进行荧光定量PCR，根据标准样品的拷贝数与CT值建立标准曲线，然后通过标准曲线和待测样品的CT值对醋酸发酵过程不同时间醋醅群落中瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行定量分析。所述的引物，是指其序列为:
权利要求
1.一种应用荧光定量PCR检测醋醅中瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌的方法，其特征及具体步骤如下: ①设计、合成针对瑞士乳杆菌{Lactobacillushelveticus、、卷曲乳杆菌{Lactobacillus crispatus)^ 干酪乳杆舊(XactobaciIIus casei)> 德氏乳杆菌{Lactobacillus 和嗜酸乳酸菌acidophilus、的特异性引物； ②对分离纯化得到的瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行摇瓶培养，利用细菌提取试剂盒分别对其培养液进行DNA提取； ③分别以瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌的DNA为模板，以 Lhe-F/Lhe-R、Lcr-F/Lcr-R、Lca-F/Lca-R、Lde-F/Lde-R 和 Lacid-F/Lacid-R 为引物进行PCR扩增，获得目的片段，并将PCR产物割胶回收； ④构建重组质粒，将目的片段与pMD19-TVector连接，连接后转化JM109大肠杆菌感受态细胞，挑取转化子扩大培养，提取质粒，并用PCR验证目的片段是否插入PMD19-TVector,验证成功的质粒作为突光定量PCR的标准样品； ⑤利用液氮研磨、酶消化和高盐提取结合的方法提取发酵过程中不同时间点醋醅群落的总DNA作为待测样品； ⑥荧光定量PCR反应体系和反应条件； ⑦重组质粒倍比稀释8个梯度，与待测样品同时进行荧光定量PCR，根据标准样品的拷贝数与CT值建立标准曲线，然后通过标准曲线和待测样品的CT值对醋酸发酵过程不同时间醋醅群落中瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行定量分析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征为，步骤①的特异性引物为:
3.如权利要求1所述的方法，其特征为，步骤⑤所述的利用液氮研磨、酶消化和高盐提取结合的方法提取发酵过程中不同时间点醋醅群落的总DNA作为待测样品的方法具体操作为: 称取2 g醋醅，在研钵中加入液氮充分研磨，转移至50 mL离心管；向离心管中加入6mL DNA抽提缓冲液，再加入100 μ L溶菌酶(50 mg/mL)，于225 rpm摇床上37°C摇动30min;向离心管中加入1.5 mL 10% SDS,65°C水浴2 h,每隔15 20 min轻轻颠倒几下，室温6000Xg离心10 min ;收集上清；将上清液用等体积的氯仿-异戊醇(24:1体积比)，抽提一次，以0.6倍体积的异丙醇室温沉淀lh, 16000g离心20 min,收集核酸沉淀,用70%乙醇洗涤沉淀，DNA沉淀干燥后溶于100 μ L TE或ddH20中，加入终浓度为0.5 μ g/mlRNaseA,并在37 °C下水浴消化2 h,以去除RNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳验证DNA提取的效果，如果在10 kb左右出现条带，则DNA提取成功，将成功提取的DNA溶液置于-20°C冰箱保存备用。
4.如权利要求1所述的方法，其特征为，步骤⑥确立的荧光定量PCR反应体系和反应条件如下: 反应体系采用20 μ L体系，其中SsoFast EvaGreen预混液10 μ L，正向引物I μ L，反向引物I μ L，模板DNAlO ng，ddH20加至20 μ L ;反应条件为95°C预变性30 s ;95°C变性5 S，最佳退火温度10 S，读取荧光信号数据，共循环扩增40次。
全文摘要
本发明采用荧光定量PCR来检测醋醅群落中瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌的动态变化，为其他微生物群落的研究提供技术支持。
文档编号C12Q1/06GK103184289SQ20131010747
公开日2013年7月3日 申请日期2013年3月30日 优先权日2013年3月30日
发明者许正宏, 史劲松, 陆震鸣, 陶京兰, 李国权, 钱建瑛 申请人:江南大学