一种快速定量检测脑钠肽的均相荧光免疫试剂组及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检验领域，具体设及一种快速定量检测脑钢肤的均相巧光免疫试 剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 脑钢肤炬rain natriuretic peptide,BNP)是由32个氨基酸残基组成的多肤，具 有WS的共有特征，即含有由17个氨基酸通过两个脱氨酸残基之间的二硫键连接构成的环 状结构。人类BNP基因位于染色体lp36. 2。BNP反转录脱氧核糖核酸（cDNA)由1900个核着 酸组成，含有3个外显子和2个内显子。在BNP cDNA的3'端非翻译区有一段TATTAT重复 序列，该个不稳定的重复序列导致BNP mRNA表达活性高，BNP合成、分泌呈爆发式。BNP mRNA 表达产物为含134氨基酸的无活性BNP前原体（Pre-proBNP)，经裂解去除一个26氨基酸的 信号肤，W含108氨基酸的BNP前体（proBN巧形式分泌至细胞内。在屯、肌细胞内，proBNP 再裂解形成活性形式32-氨基酸3. 5-kDa BNP及无活性76-氨基酸肤（amino-N-terminal proBNP，NT-proBNP)。BNP主要在肺和肾内降解，其生物半衰期约为20min。
[000引近年来对屯、力衰竭（HF)的病理生理有了更深入的了解，因而治疗水平有了较大 的提高，但对于HF的诊断及疗效的评估仍缺乏有效的客观指标。BNP因具有重要的病理 生理学意义，可作为屯、力衰竭的血浆标志物，用于屯、力衰竭的诊断、危险度分层并指导治疗 与判定预后。HF时，屯、脏容量负荷或压力负荷增加，屯、肌受到牵张或室壁压力增大，使血中 BNP浓度增高，故可协助诊断HF。研究结果表明，屯、力衰竭患者的BNP水平明显高于肺源性 疾病患者，BNP诊断屯、力衰竭的敏感性为93%，特异性为90%。同时，BNP作为一客观指标 在HF的预后评估及危险分层中具有重要作用，BNP水平升高为屯、脏性死亡或再次入院的独 立危险因素，BNP每升高lOpg/ml，屯、脏病死亡危险将增加4%。患者BNP水平高，则HF预后 差。就诊时BNP > 48化g/ml的病人，在6个月内因HF再次入院或死亡的发生率高达42%; 而BNP < 230pg/ml的患者上述情况发生率仅为2%。
[0004] 急性冠脉综合征（AC巧是常见急症。早期、快速、准确的诊断W及预后评估对于指 导临床医生采取合理的治疗措施有重要意义。研究表明，在急性屯、肌梗死（AMI)后1小时 血浆BNP水平升至正常时的60倍。Affl后血浆BNP浓度曲线呈单相和双相两种模式，单相 曲线在Affl发生后16小时左右达到峰值；双相曲线则在第4-7天出现第二个高峰。小面积 AMI患者BNP多呈单相曲线；前壁AMI、伴HF症状、低射血分数的患者BNP多明显升高并呈 双相曲线；Affl后1?7天BNP持续升高提示有发生屯、衰和死亡的危险性。
[0005] 目前，欧洲屯、脏病协会巧SC)于2001年将BNP列入"屯、力衰竭诊断及治疗指南"， 美国临床生化科学院（NACB)在2004年将BNP列入"屯、肌标志物的应用指南"。临床化验室 采用的有巧光免疫定量法、电化学发光、酶联免疫吸附法等多种免疫检测方法，该些免疫学 方法均W美国临床实验室标准委员会（NCXL巧指南为依据，在医学决定水平附近具有较好 的一致性。其中高通量的免疫发光或是巧光免疫定量法检测范围宽，分析灵敏度高。
[0006] 检测BNP的主要方法固相放射免疫分析（IRMA)法灵敏度和特异性高，且不需要分 离纯化血浆，比酶免疫巧IA)法快捷实用，但仍需花费5?36小时，不适用于全自动分析系 统。美国雅培（Abbott)公司推出的微粒子酶免疫法（MEIA)和罗氏（Roche)公司的电化学 发光发巧CL)试剂盒，都需要昂贵的检测设备。
[0007] 均相巧光分析法化omogeneous fluoroimmunoassay，HFIA)是在时间分辨巧光免 疫分析（time-resolued fluoroimmunoassay，TRFIA)技术的基础上形成的一种新的巧光免 疫分析技术。TRFIA技术采用的巧光物质与传统的巧光染料完全不同，采用的是铜系元素 館巧U)、得（Tb)等作为巧光材料，灵敏度非常高，稳定性好，低温条件可保存=年，因而成 为二十一世纪最热口的免疫分析技术。
[000引均相巧光免疫检测法是用同一抗原的两个抗体分别标记化和巧光染料 Alexa647。化标记抗体在游离状态时，受到340nm光线激发，只发射平均波长为615nm 巧光，而在抗原、抗体复合物形成时，发生能量传递，激发巧光染料Alexa647发射出665nm 巧光。标记抗体直接与待测样品进行抗原、抗体反应，如果能形成抗原、抗体复合物，则在 665nm出可测得巧光信号。该种方法省却了酶联免疫法反复解育和洗板等烦琐操作步骤，几 分钟就能获得结果，省时省力。并且，此法也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境 等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。此外，Eu 3+和 Alexa647该对巧光物质的最大发射光波长之间相差较大，未发生抗原抗体反应的本底巧光 值就非常低。而人血清中非特异性物质产生的300?500nm巧光，不能激发Alexa647发射 巧光信号650nm激发光。因此非特异性巧光非常低。
[0009] 本发明采用均相巧光免疫快速检测技术，利用巧光的高灵敏特点，同样也避免了 胶体金或者巧光BNP干式免疫试纸中的硝酸纤维素膜本身孔隙不均一特性对检测准确度 和重复性的不良影响。由于均相巧光免疫检测中样品与巧光标记抗体全过程都在液相中全 面接触，反应充分，因此可大幅度提高检测灵敏度和线性范围，同时反应在液相进行也增加 了样品的稀释倍数，消除了样品的基质效应影响，使定量结果有很好的可重复性，提高了定 量结果的精密度和准确度，可满足临床诊断大规模检测的要求。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于克服现有BNP检测技术的不足，提供一种快速定量检测BNP的 均相巧光免疫试剂组。本发明根据巧光免疫技术特点和BNP抗原抗体系统特点，设计新的 原材料，试剂和工艺流程，应用本发明提供的试剂组检测BNP水平，具有简单，快速，灵敏和 特异性好等特点，可同时定量检测高值和低值样品，并且性价比高，适用于临床快速检测。
[0011] 本发明的第一个方面是提供一种快速定量检测脑钢肤的均相巧光免疫试剂组，包 括稀±元素馨合物标记的抗脑钢肤单克隆抗体（anti-BNP)、近红外巧光化合物标记的抗脑 钢肤单克隆抗体和系列浓度的脑钢肤校准品。
[0012] 优选地，稀±元素馨合物为化馨合物。
[001引更优选地，稀±元素馨合物为BHHCT-化或1，2-二（1"，1"，1"，2"，2"，3"，3"-走 氣-4"，6"-己二酬-6"-基-对节基）-4-氯横酷基苯与館（III)的配合物炬HHBCB-Eu3+)。
[0014] 优选地，所述近红外巧光化合物为Alexa系列近红外巧光化合物、DyLi曲t系列近 红外巧光化合物和CF系列近红外巧光化合物中的至少一种。
[0015] 更优选地，所述近红外巧光化合物Alexa647、DyLi曲t-DY647和CF647中的至少一 种。
[0016] 优选地，所述系列浓度的脑钢肤校准品由校准品稀释液稀释脑钢肤配制而成， 所述校准品稀释液为含0. 1-0. 8wt%阳G2000、l-5wt% BSA、0. 01-0. 5wt%表面活性剂的 肥阳S盐缓冲液。
[0017] 脑钢肤校准品可用塑料瓶密封包装。
[001引本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的均相巧光免疫试剂组的制 备方法，包括W下步骤：
[0019] 1)稀±元素馨合物标记的抗脑钢肤单克隆抗体的制备：
[0020] 取0. 5-5mg/ml的抗脑钢肤单克隆抗体溶液，加入0. 05-0. 5mol/L的NaHC〇3溶液 后，调抑至8. 5-10,滴加10-100 y g/ml配体化合物溶液，揽拌反应0. 6-化，分离得到配 体化合物标记的抗脑钢肤单克隆抗体，加入终浓度为0. 05-0. 5wt %的BSA和0. 01-lwt % 的NaNs，调抑至5. 5-6. 5,免疫分析前，加入化溶液，使配体化合物与化等摩尔浓 度，即得，其中，抗脑钢肤单克隆抗体溶液、NaHC〇3溶液和配体化合物溶液的体积比为 0. 1-1 ： 1 ： 0. 01-0. 05 ；
[0021] 2)近红外巧光化合物标记的抗脑钢肤单克隆抗体的制备：
[0022] 将抗脑钢肤单克隆抗体用0. 05-0. 5mol/L的Na肥〇3溶液稀释至0. 5-5mg/ml，加入 近红外巧光化合物溶解液，揽匀，室温解育0. 5-化，分离得到近红外巧光化合物标记的抗脑 钢肤单克隆抗体；
[0023] 3)系列浓度的脑钢肤校准品的制备；
[0024] 将脑钢肤用校准品稀释液稀释配制成系列浓度，即得，
[0025] 其中，1)、2)和3)的顺序可W任意颠倒。
[0026] 其中，稀±元素馨合物标记的抗脑钢肤单克隆抗体用于免疫分析时，用标记物稀 释液稀释使用，2-8 °C分装保存。
[0027] 其中，近红外巧光化合物标记的抗脑钢肤单克隆抗体用磯酸盐缓冲液稀释，2-6°C 保存。
[002引其中，脑钢肤校准品2-6 °C保存。
[0029] 优选地，抗脑钢肤单克隆抗体在于配体化合物反应之前，先进行透析处理。
[0030] 优选地，步骤1)中配体化合物为BHHCT或BHHBCB。
[0031] 优选地，步骤1)中分离得到配体化合物标记的anti-BNP通过离屯、和柱层析方式 进行。柱层析采用Se地adexG-SO柱，0. 01-0. Imol/L畑4肥〇3(p服.0)洗脱。
[0032] 优选地，步骤2)中，分离得到近红外巧光化合物标记的anti-BNP通过柱层析的方 式进行。
[0033] 进一步优选地，步骤2)中，柱层析采用G25凝胶柱。
[0034] 优选地，步骤2)中，室温解育时，每隔10-20min混匀一次。
[0035] 本发明的均相巧光免疫试剂的使用；先将稀±元素馨合物标记的anti-BNP溶液 加入反应微孔中，再加入近红外巧光化合物标记的anti-BNP溶液，最后分别加入BNP校准 品和临床检测样品，37°C反应20分钟后，用均相巧光免疫分析仪检测判读结果。
[0036] 本发明提供的快速定量检测脑钢肤的均相巧光免疫试剂组，