专利名称：一种使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法
技术领域：
本发明涉及一种使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法，属于 分子生物学领域。
背景技术：
随着人类基因组图谱的完成，人们开始进入后基因组时代，重点也转向了研究各 基因在生命中的作用，包括基因在生长发育、遗传、疾病、外型体征等方面的作用。其中，对 于RhoGDP dissociation inhibitor (GDI) beta基因(ARHGDIB基因)表达的研究也越来越 多。 基因表达的检测有几种方法。经典的方法是根据在细胞或生物体中所观察到的生 物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。随着大分子分离技术的进步使得特异 的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术的运用，现在有可能检 测、分析任何基因的转录产物。目前有好几种方法广泛应用于研究特定RNA分子。这些方 法包括RT-PCR、原位杂交、NORTHERN凝胶分析、打点或印迹打点、S-1核酸酶分析、RNA酶保 护研究以及基因芯片等。 荧光探针PCR技术是今年兴起并得到快速发展的技术，是将同时带有关联的荧光 发光基团(能量供体)和淬灭基团(能量受体)的荧光探针结合PCR技术而产生的一种 新的检测技术，具有灵敏度高、特异性强，且不易发生产物污染等特点，包括Taqman探针技 术、分子信标(Beacan探针)等，由于该技术操作简便，检测速度快，且各方面性能都有优 势，目前在临床、研究等核酸检测领域得到广泛的应用。 本发明将RT-PCR与荧光探针技术结合，通过广泛筛选和优化检测引物和探针，实 现了快速准确的对ARHGDIB基因mRNA进行定量分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简便的使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基 因mRNA的方法。 为解决上述问题，本发明提供了一种使用一步法荧光RT-PCR技术对ARHGDIB基因
mRNA进行定量的方法，根据GeneBank序列号为NC_000012的基因序列为模板，设计了一对
引物及特异性探针，检测长度为139bp的目标mRNA，其引物探针序列分别为 引物1 :5—-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3— (Seq No. 1) 引物2 :5—-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3— (Seq No. 2) 探针1 :5—-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3—(Seq No. 3) 或探针2 :5— -TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3— (Seq No. 4) 或探针3 :5—-TGTGGTGACAGATCCGAA-3— (Seq No. 5) 或探针4 :5—-TTCGGATCTGTCACCACA-3— (Seq No. 6)
或者上述弓I物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75 %的序列。 设计的探针跨越了 NCJ)00012基因序列中第111098-111743位核苷酸的内含子，
分别与其两端的外显子特异性匹配，这样可非常有效的避免基因组DNA对实验结果的影
响，同时也省去了使用DNA酶对样本进行消化用以去除DNA干扰的步骤。 上述方法中使用的探针，其5—端的荧光发光基团可为FAM、 TET、 JOE、 Cy3、 Cy5、
Cy5. 5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、0regon
Green488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、 HEX、 FITC、
Acridineorange或ROX中任意一种；3—端荧光淬灭基团可为DABCYL、 DABSYL、 Eclipse、
TAMRA、 BHQ-1 、 BHQ_2、 BHQ-3或MGB基团中的任意一种。 本发明提供的使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法是使用一 步法RT-PCR的技术，使操作更为简便、快速。使用已知浓度的人工合成的RNA序列制作标 准曲线，能对标本中的ARHGDIB基因mRNA进行定量分析。其人工合成的RNA序列如下AC本发明提供的使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法形成的试
剂盒组成包括组成成分(20人份/盒)体积One st印RT-PCR反应缓冲液380 ii 1混合酶60 ii 1RNA标准百^ 120 ii 1RNA标准百20 ii 1RNA标准百20 ii 1RNA标准百20 ii 1DEPC水lml其中，Onest印PCR反应组分(终浓度)包括50mM Tris-HCl (PH 8. 3) 、50mM
KCl、300uMdNTP、3mM MgCl2、200nM引物1、200nM引物2和200nM探针1。混合酶的组成成 份(终浓度)包括0. 5U AMV酶、0. 5U RNase Inhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT、1. 5U Taq 酶、0. 05U UNG酶。另外，探针1的5—端标记的发光基团为FAM，在3—端标记的淬灭基团为 Eclipse。 本发明提供的方法形成的试剂盒操作步骤如下 PCR反应液的配制按每人份One st印RT-PCR反应缓冲液19ul、混合酶3ul的 配方配制PCR反应液，并按22u1/管分装到0. 2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并 补充DEPC水(RNA阳性对照品直接取8ul)，使反应总体积为30ul，按如下程序进行一步法 RT-PCR检测反应管先在5(TC反应5分钟，然后95。C保温5分钟，再按94。C 20秒一60°C 35 秒循环40次(6(TC退火条件下采集FAM通道荧光)。 传统的RT-PCR使用两步法扩增，时间长，操作相对复杂，且因多了一个步骤而易 发生污染，所以本发明提供的试剂盒采用一步法RT-PCR技术，将RT步骤与PCR步骤一步完 成，无须开管进行二次加样，将少了污染的机会。由于反应体系中RT步骤是使用特异性引 物进行延伸，与传统的随机引物法相比，逆转录需要的时间更短，通常可在1. 5小时内完成全部RT-PCR反应，并且由于试剂盒使用热稳定性较强的AMV逆转录酶，可在5(TC进行RT反 应，产品的特异性非常高。
图1为人工合成RNA稀释产物荧光PCR扩增曲线图 其中，最高浓度的人工合成RNA浓度为1E+7copies/ml，用DEPC水进行50倍稀释
3个浓度梯度，在ABI7300上进行检测的扩增曲线图。 图2为临床标本总RNA稀释产物荧光PCR扩增曲线图 其中，健康人全血标本经总RNA提取后，用DEPC水进行10倍稀释4个浓度梯度， 在ABI7300上进行检测的扩增曲线图。
具体实施例方式
根据GeneBank中的人类基因组12号染色体ARHGDIB基因相关序列进行比对和分 析，设计和制备引物与探针(设计模板GeneBank序列号为NCJ)00012):
引物1 :5—-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3— (Seq No. 1) 引物2 :5—-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3— (Seq No. 2) 探针1 :5—-FAM-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-Eclipse-3— (Seq No. 3)
设计并制备人工合成RNA序列
(Seq No. 7) 将该人工合成的RNA序列用DEPC处理过的水溶解并稀释成1E+7copies/ml、 1E+6copies/ml、lE+5copies/ml和1E+4copies/ml，依次作为RNA标准品1-4。
按如下配方配制One st印RT-PCR反应缓冲液(终浓度)50mM Tris-HCl(Ph 8. 3) 、50mMKCl、300uM dNTP、3mM MgCl2、200nM引物1、200nM弓|物2禾P 200nM探针1。
按如下配方配制混合酶(终浓度):0.5U AMV酶、0.5U RNase Inhibitor、0. lmg/ ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。试剂盒组成为组成成分(20人份/盒)体积One st印RT-PCR反应缓冲液380 ii 1混合酶60 ii 1RNA标准g]口 120 ii 1RNA标准g]口220 ii 1RNA标准g]口320 ii 1RNA标准g]"20 ii 1DEPC水lml本发明提供的方法形成的试剂盒未提供mRNA提取试剂，用户可根据自身要求使用传统的酚-氯仿提取方法或购买商业化的RNA提取试剂盒c 检测步骤
6
PCR反应液的配制按每人份One st印RT-PCR反应缓冲液19ul、混合酶3ul的配 方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0. 2ml PCR管中，然后加入适量待检的RNA并补充 DEPC水(RNA标准品直接取8ul)，使反应总体积为30ul。 按如下程序进行一步法RT-PCR检测反应管先在5(TC反应5分钟，然后95。C保温 5分钟，再按94°C 20秒一60°C 35秒循环40次(6(TC退火条件下采集FAM通道荧光)。
结果分析与监控 根据仪器分析的结果，在如下情况视实验有效RNA标准品1-4的Ct值均< 35，且 呈较好的线性(r > 0. 9)。 直接读取仪器分析的定量值即为ARHGDIB基因mRNA的定量值。 当定量值< 1E+2copies/ml时，判断为阴性；当1E+2copies/ml《定量值
< 1E+3copies/ml时，判断为检测灰区，建议重新检测。SEQUENCE LISTING〈110〉上海复星医药(集团)股份有限公司上海复星医学科技发展有限公司剑军，何懿，夏〈120〉 一种使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法〈160>7〈170>PatentIn version 3. 3〈210>1〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>13CC3C3g朋g tccctga朋g agct〈210>2〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2ggtgagccgg gtgacaacga c〈210>3〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3tcggatctgt caccacagga cca〈210>4〈211>23
7
〈212>DNA 〈213〉人工序列
〈400>4
tggtcctgtg gtgacagatc cga 〈210>5 〈211>18 <212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>5 tgtggtgaca gatccgaa 18 〈210>6 〈211>18 〈212>DNA <213>人工序列 〈400>6 ttcggatctg tcaccaca 18 〈210>7 〈211>139 〈212>RNA 〈213>人工序列 〈400>7 3CC3C3g朋g UCCCUg朋3g 3gCUgC3gg3朋Ugg3C朋3 g￡lUg￡lUg￡lg￡l gUCU￡l￡lUU￡l￡l 60 gimc朋g朋3 3cgcugcugg g3g肌ggucc uguggugac3 g肌ccg3朋g ccccc朋ugu 120 cguugucacc cggcucacc 139
权利要求
一种使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法，其特征在于包含一对特异性引物和一条特异性探针，扩增目标片段长度为139bp，引物和探针序列为引物15`-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3`(Seq No.1)引物25`-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3`(Seq No.2)探针15`-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3`(Seq No.3)或探针25`-TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3`(Seq No.4)或探针35`-TGTGGTGACAGATCCGAA-3`(Seq No.5)或探针45`-TTCGGATCTGTCACCACA-3`(Seq No.6)或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。
2. 根据权利要求1所述的使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方 法，其特征在于标记探针5—端的荧光发光基团为可以FAM、 TET、 J0E、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Fluorescein、 Rhodamine、 Rhodamine Red、 Rhodamine Green、 Rhodamine 6G、 Oregon Green488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、 FITC、 Acridine orange或R0X中任意一禾中;3—端荧光淬灭基团为DABCYL、 DABSYL、 Eclipse、 TAMRA、 BHQ-1 、 BHQ_2、 BHQ-3或MGB基团中的任意一种。
3. 根据权利要求1所述的使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法， 其特征在于使用一步法RT-PCR荧光检测技术，对标本中的ARHGDIB基因mRNA进行定性或 定量分析。
4. 根据权利要求1所述的使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法， 其特征在于，使用人工合成的RNA序列作为RNA阳性对照品，序列如下No. 7)。
5.根据权利要求1所述的使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法， 其特征在于，可形成定量检测试剂盒，试剂盒组成包括组成成分(20人份/盒) 体积 One st印RT-PCR反应缓冲液 380 ii 1混合酶 60 ii 1RNA标准品 120 illRNA标准品 220 illRNA标准品 320 illRNA标准品 420 illDEPC水 1ml其中，One st印PCR反应组分(终浓度)包括50mM Tris-HCl(Ph 8.3)、50mM KCl、 300uM dNTP、3mM MgCl2、200nM引物1、200nM引物2和200nM探针1。混合酶的组成成份 (终浓度)包括0.5U AMV酶、0.5U RNase Inhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq 酶、0. 05U UNG酶。另外，探针1的5—端标记的发光基团为FAM，在3—端标记的淬灭基团为 Eclipse。
6.根据权利要求5所述的使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法，其特征在于，操作步骤如下PCR反应液的配制按每人份One st印RT-PCR反应缓冲液19ul、混合酶3ul的配方 配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0. 2ml PCR管中，然后加入适量提取好的总RNA并 补充DEPC水(RNA阳性对照品直接取8ul)，使反应总体积为30ul，按如下程序进行一步法 RT-PCR检测反应管先在5(TC反应5分钟，然后95。C保温5分钟，再按94°C 20秒一60°C 35 秒循环40次(6(TC退火条件下采集FAM通道荧光)。
全文摘要
本发明涉及一种使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法。本发明针对人的ARHGDIB基因mRNA两个外显子结合部位设计荧光探针并筛选到最佳PCR检测方案，并提供相应的一步法RT-PCR定量检测方法并形成了相应试剂盒。本发明提供人工合成的RNA，制作标准曲线，用于对mRNA进行定量分析；本发明定量准确，检测速度快，能排除基因组DNA的干扰，特异性强，且灵敏度高，可用于ARHGDIB基因表达方面的研究和临床。
文档编号C12Q1/68GK101760524SQ200810201648
公开日2010年6月30日 申请日期2008年10月23日 优先权日2008年10月23日
发明者何剑军, 夏懿 申请人:上海复星医药(集团)股份有限公司;上海复星医学科技发展有限公司