专利名称：一种荧光定量pcr检测aapb的方法
技术领域：
本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及一种荧光定量PCR (聚合酶链式反应) 检测AAPB的方法。
背景技术：
好氧不产氧光合细菌，Aerobic anoxygenic phototrophic bacteria (AAPB)是一类能利用光能进行光合作用的细菌。AAPB有着独特的生理生态特征(1)专性好氧；(2) 营光合作用生长却不全依赖于光；(3)细菌叶绿素a (BChla)含量比厌氧光合细菌低很多， 含有类胡萝卜素。AAPB在水生态系统中有着特殊的意义，现有的文献表明(I)AAPB分布广泛，在海洋、酸性矿山污水、热泉、江河和河口以及湖泊中都有发现；( 在水生生态系统中占有较大比例，如在海洋中占总细菌的10%，(通过荧光显微镜发现在太平洋中占总原核细胞数的 5%，在大西洋中则是2%-16%)，河口中占34%，在某些高山淡水湖泊中则超过50%，但是也有文献表明AAPB在15公里的近海的18个点位中一般只在1%左右，最多也不超过3% ； (3) AAPB在海洋生态系统的碳循环中有重要作用。将Bchla (细菌叶绿素a)产生的光合能量转换为呼吸消耗所需的相应的碳量， 在陆架海和大洋分别为0.27 mgC m_3 day—1和0.11 mgC πΓ3 day—1相当于各自海区初级生产力的2. 4%和5.4%。根据政府间气候委员会(IPCC)的模型，海洋吸收和释放二氧化碳的差值大约是2%，所以基于BChla的光能利用足以改变一个海区碳的“汇” “源”格局 (Jiao et al. , 2010 "Significant roles of bacteriochlorophylla supplemental to chlorophylla in the ocean” The ISME Journal, 4(4) : 595-597)。现在世界各国极其关注全球碳排放。截止到2009年2月，一共有183个国家通过了《京都议定书》。因此研究 AAPB对于我们理解全球碳排放、气候变化、温室效应等有重要现实意义。但是以上研究几乎都是针对海洋而针对湖泊，水库，河流的研究较少，对AAPB在淡水水生态系统中碳循环作用知之甚少。现有技术使用流式细胞仪检测AAPB，需要大型仪器流式细胞仪。流式细胞仪检测方法主要运用于海洋水体中，相对于海洋水体湖泊、河流等水体中颗粒性物质浓度更高，粒径更大对流式细胞仪有较大损耗；而且流式细胞仪价格昂贵一般科研机构不具备。 使用的试剂DAPI染料等是强烈致癌物质，对人体和环境都不友好，现有技术中缺乏一种快捷简便、安全的检测AAPB的方法。因此，AAPB检测方法还有待发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种荧光定量PCR检测AAPB的方法，旨在解决现有的检测AAPB的技术操作困难并对环境不友好的问题。本发明的技术方案如下
一种荧光定量PCR检测AAPB的方法，其中，根据AAPB的基因片段设计出的引物，进行实时荧光定量PCR检测；其中，所述引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO. 1 的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQ ID NO. 2的核苷酸序列。所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其中，所述荧光定量PCR检测AAPB的方法具体包括以下步骤
51、采集水体DNA样品将采集到的水体样品经过过滤，得到水体中的细菌，并对细菌进行总DNA的提取纯化，得到水体样品DNA ；
52、建立AAPB荧光定量PCR标准曲线取好氧不产氧光合细菌作为标准菌株，提取其 DNA并稀释成多个浓度梯度，用好氧不产氧异养细菌基因引物对，分别以各个浓度的 DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值绘制荧光定量PCR标准曲线；
53、建立水体总细菌荧光定量PCR标准曲线
将大肠杆菌作为标准菌株，提取DNA并稀释成多个浓度梯度，按照步骤S2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，用总菌引物分别以各个浓度的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值绘制荧光定量PCR标准曲线；
54、样品检测
取步骤Sl中得到的水体样本DNA作为模板，按步骤S2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，分别用总菌引物和风/#基因引物，进行实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增；其中阴性对照采用去离子水，阳性对照采用好氧不产氧光合细菌的DNA ；将DNA样本的循环阈值C (t)与标准曲线对照，得到DNA样本中的pufM 基因片段拷贝浓度。所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其中，所述步骤Sl具体为
将采集到的水体样品经过5 μ m的微孔滤膜过滤，得到的滤液再用0. 2 μ m的微孔滤膜进行过滤；对0. 2 μ m微孔滤膜上的物质进行细菌的总DNA提取纯化，得到水体样品DNA。所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其中，所述步骤S3中的总菌引物，其正向引物具有序列表中SEQ ID NO. 3的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQ ID NO. 4的核苷酸序列。 所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其中，步骤S2中所述荧光定量PCR检测的反应体系为
20 μ L SYBR-Green Master Mix, 1 μ L纯化后的DNA样品，用于扩增的引物对，每条引物浓度10 pmol、添加量为0. 4 μ L，以去离子水补足至25 μ L的终体积。所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其中，步骤S2中所述实时荧光定量PCR的反应程序为50°C 2 min,95°C 30 s，接着进行40个循环，每个循环包括94°C 10 s,54°C 20 s 和 72°C 10 s。有益效果本发明所提供的检测AAPB的方法与流式细胞仪检测方法相比，准确度更高，容易操作，成本低廉，效率高而且更加安全，无毒无害，更加适合应用于湖泊、河流等颗粒性物质浓度高、颗粒粒径大的水体AAPB的检测中。本发明方法定量检测重复性好，可以对样品进行高通量的检测且仅需2个小时左右就能完成。
图1为本发明实施例2中荧光定量PCR敏感度检测的荧光信号图。图2为本发明实施例2中荧光定量PCR熔链曲线图。图3为本发明实施例2中AAPB荧光定量PCR标准曲线。图4为本发明实施例3中总细菌荧光定量PCR标准曲线。
具体实施例方式本发明提供一种荧光定量PCR检测AAPB的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明提供的一种荧光定量PCR检测AAPB的方法，能快速准确地定量检测水体中 AAPB，能用于对湖泊、水库、河流等淡水水体中AAPB的检测。本方法具有操作简单、对环境友好、检测结果准确等优点，采用本方法建立的标准曲线灵敏度高、重复性好，在AAPB的鉴定领域具有良好的应用前景。本发明所提供的荧光定量PCR检测AAPB的方法，是利用根据AAPB的基因片段设计出的引物，进行实时荧光定量PCR检测，其中所述引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO. 1的核苷酸序列，forward (5，-TATAAYCCATTTCAYGC-3，)；反向引物具有序列表中 SEQ ID NO. 2 的核苷酸序列，reverse (5' -GCRAACCACCAAGCCCA-3')。本发明的方法主要步骤包括采集和处理，过滤水体样品并提取DNA，应用STOR Green I嵌合荧光法针对基因片段进行实时荧光定量PCR检测，应用计算机获取标准曲线，计算待测样品中基因片段拷贝数和AAPB的数量。本发明的方法具体包括以下具体步骤 Si、采集水体DNA样品
将采集到的水体样品经过5 μ m的微孔滤膜过滤，得到的滤液再用0. 2 μ m的微孔滤膜进行过滤；对0. 2 μ m微孔滤膜上的物质进行细菌总DNA的提取纯化，得到水体DNA样
P
BFI οS2、建立AAPB荧光定量PCR标准曲线
取已知的好氧不产氧光合细菌作为标准菌株，提取其DNA并按10倍稀释法稀释成 IO3 IO8拷贝每微升的6个浓度梯度，每个稀释梯度重复3次，用好氧不产氧异养细菌基因引物对，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，反应结束后，根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。S3、建立水体总细菌荧光定量PCR标准曲线
通过确定总细菌的16S rRNA gene的拷贝数，可确定水体总菌数。将大肠杆菌作为标准菌株，提取DNA并按10倍稀释法稀释成10° IO5拷贝每微升的6个浓度梯度，每个稀释梯度重复3次，按照步骤S2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，用总菌引物在实时荧光定量PCR仪上进行扩增；反应结束后，根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。所使用的总菌引物，正向引物具有序列表中SEQ ID NO. 3的核苷酸序列，(5' -CCTACGGGAGGCAGCAG-3')，反向引物具有序列表中SEQ ID NO. 4 的核苷酸序列，(5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，)。S4、样品检测取步骤Sl中得到的DNA样本作为模板，按步骤S2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，分别用总菌引物和基因引物，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增。其中阴性对照采用去离子水，阳性对照采用好氧不产氧光合细菌的DNA。反应结束后，将DNA样本的循环阈值C(t)与标准曲线对照，得到DNA样本中的基因片段拷贝浓度，据此得到原水样中的/7 /#基因拷贝浓度，进而得到原水样中好氧不产氧光合细菌数量和占总细菌的比例。在本发明方法中，所述荧光定量PCR检测的反应体系可以为
20 μ L SYBR-Green Master Mix, 1 μ L纯化后的DNA样品，用于扩增的引物对，每条引物浓度10 pmol、添加量为0.4 μ L，以去离子水补足至25 μ L的终体积。所述实时荧光定量PCR的反应程序可为
500C 2 min，95°C 30 s，接着进行40个循环，每个循环包括94°C 10 s,54°C 20 s和 72°C 10 s。PCR完成后，按0. 1°C每秒的升温速率从72°C升至95°C进行溶解曲线的分析验证。本发明方法优点明显，与流式细胞仪检测方法相比准确度更高，容易操作，成本低廉，效率高而且更加安全，无毒无害。流式细胞仪检测方法主要运用于海洋水体中，相对于海洋水体湖泊、河流水体中颗粒性物质浓度更高，粒径更大对流式细胞仪有较大损耗；而且流式细胞仪价格昂贵一般科研机构不具备。采用本发明的方法对湖泊、河流等水体AAPB进行检测则不存在这些问题，定量检测重复性好，可以对样品进行高通量的检测且仅需2个小时左右就能完成。实施例1样品的采集与预处理
对TH湖主要入湖河流水体的水样进行AAPB的定量。采集水体样品TH广9，将得到的水体样品分别经过5 μ m的微孔滤膜过滤后再用0.2 μ m的膜过滤滤液，压力小于100 mbar; 然后对0. 2 μ m滤膜上的物质进行总DNA的提取纯化，得到水体DNA样品TH广9。实施例2建立AAPB荧光定量PCR标准曲线
取已知的好氧不产氧光合细菌作为标准菌株，提取其DNA并按10倍稀释法稀释成 IO3 IO8拷贝每微升的6个浓度梯度，用好氧不产氧异养细菌/^//#基因引物对，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。本实施例中是采用STORGreen I嵌合荧光法进行实时荧光定量 PCR0将上述各浓度梯度DNA作为模板，进行扩增反应每个浓度加入3个反应管同时进行。所述荧光定量PCR检测的反应体系为
20 μ L SYBR-Green Master Mix, 1 μ L纯化后的DNA样品，用于扩增的引物对，每条引物浓度10 pmol、添加量为0.4 μ L，以去离子水补足至25 μ L的终体积。所述引物对为
正向引物/^I forward (5，- TATAAYCCATTTCAYGC-3，)； 反向引物pufM reverse (5，-GCRAACCACCAAGCCCA-3')。所述实时荧光定量PCR的反应程序为
500C 2 min，95°C 30 s，接着进行40个循环，每个循环包括94°C 10 s,54°C 20 s和 72°C 10 s。PCR完成后，按0. 1°C每秒的升温速率从72°C升至95°C进行溶解曲线的分析验证。反应结束后，根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。AAPB阳性克隆DNA中基因片段拷贝浓度(拷贝/ μ L)按照如下方法进行计算
DNA中的风/对考贝浓度(拷贝/mL) = [6. 02 X IO23 (拷贝/mol)]X [DNA浓度(g/mL)]/ [一个基因组的摩尔质量(g/mol)]。以初始模板DNA量的对数为横坐标，以PCR反应过程中每个稀释样品的C(t)值为纵坐标，分别绘制AAPB及总菌的标准曲线，如图3和图4所示。实施例中荧光信号的采集和相关数据处理都由实时荧光定量PCR仪所带的软件完成。 按0. 1°C每秒的升温速率从72°C升至95°C进行溶解曲线的分析验证。图1荧光定量PCR敏感度检测的荧光信号图，说明经过40个循环待测样品PCR都进入平台期，循环数再增加不会对实验结果产生影响。图2荧光定量PCR熔链曲线图，熔链温度在86°C左右，熔链曲线的峰单一，说明PCR扩增反应过程中没有非目的片段扩增；扩增效率高、特异性好。3为本实施例中AAPB荧光定量PCR标准曲线，y = -3. 260 X log (conc) + 8. 041 (注conc表示反应体系中的标准质粒拷贝数)。实施例3建立总细菌荧光定量PCR标准曲线
将大肠杆菌作为标准菌株，提取DNA并按10倍稀释法稀释成10° IO5拷贝每微升的 6个浓度梯度，按照实施例2中的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。将上述各浓度梯度DNA作为模板，进行扩增反应每个浓度加入3个反应管同时进行。所使用的总菌引物
正向引物(5' -CCTACGGGAGGCA GCAG-3，)； 反向引物(5，-ATTACCGCGGCTG CTGG-3，)。反应结束后，根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。图4为本实施例中总细菌荧光定量PCR标准曲线，y = -2. 936 X log (conc) + 8. 601 (注conc表示反应体系中的标准质粒拷贝数)。实施例4样品检测
以实施例1提取的TH湖入湖河流的水样DNA样品TH1、为模板，按实施例2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。反应体系和扩增条件与作标准曲线时一致，每个样品重复3次，同时做阳性对照(以克隆的AAPB菌株DNA 替代待测样品DNA)和阴性对照(以去离子水代替待测样品DNA)。反应结束后根据样品的循环阈值C(t)值，用标准曲线方程计算出总菌及风/#基因片段的初始拷贝数，两者之比即为AAPB在样品中的丰度。
所测水样中AAPB的丰度如下表所示
权利要求
1.一种荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，根据AAPB的基因片段设计出的引物，进行实时荧光定量PCR检测；其中，所述引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO. 1的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQ ID NO. 2的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，所述荧光定量 PCR检测AAPB的方法具体包括以下步骤51、采集水体DNA样品将采集到的水体样品经过过滤，得到水体中的细菌，并对细菌进行总DNA的提取纯化，得到水体样品DNA ；52、建立AAPB荧光定量PCR标准曲线取好氧不产氧光合细菌作为标准菌株，提取其 DNA并稀释成多个浓度梯度，用好氧不产氧异养细菌基因引物对，分别以各个浓度的 DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值绘制荧光定量PCR标准曲线；53、建立水体总细菌荧光定量PCR标准曲线将大肠杆菌作为标准菌株，提取DNA并稀释成多个浓度梯度，按照步骤S2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，用总菌引物分别以各个浓度的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值绘制荧光定量PCR标准曲线；54、样品检测取步骤Sl中得到的水体样本DNA作为模板，按步骤S2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，分别用总菌引物和风/#基因引物，进行实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增；其中阴性对照采用去离子水，阳性对照采用好氧不产氧光合细菌的DNA ；将DNA样本的循环阈值C (t)与标准曲线对照，得到DNA样本中的pufM 基因片段拷贝浓度。
3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，所述步骤Sl具体为将采集到的水体样品经过5 μ m的微孔滤膜过滤，得到的滤液再用0. 2 μ m的微孔滤膜进行过滤；对0. 2 μ m微孔滤膜上的物质进行细菌的总DNA提取纯化，得到水体样品DNA。
4.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，所述步骤S3中的总菌引物，其正向引物具有序列表中SEQ ID NO. 3的核苷酸序列，反向引物具有序列表中 SEQ ID NO. 4的核苷酸序列。
5.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，步骤S2中所述荧光定量PCR检测的反应体系为20 μ L SYBR-Green Master Mix, 1 μ L纯化后的DNA样品，用于扩增的引物对，每条引物浓度10 pmol、添加量为0.4 μ L，以去离子水补足至25 μ L的终体积。
6.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，步骤S2中所述实时荧光定量PCR的反应程序为50°C 2 min,95°C 30 s，接着进行40个循环，每个循环包括 94°C 10 s，54°C 20 s 和 72°C 10 s。
全文摘要
本发明公开一种荧光定量PCR检测AAPB的方法，所述荧光定量PCR检测AAPB的方法是根据AAPB的pufM基因片段设计出的引物，进行实时荧光定量PCR检测；其中，所述pufM引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO.1的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQIDNO.2的核苷酸序列。本发明所提供的检测AAPB的方法与流式细胞仪检测方法相比，准确度更高，容易操作，成本低廉，效率高而且更加安全，无毒无害，更加适合应用于湖泊、河流等颗粒性物质浓度高、颗粒粒径大的水体AAPB的检测中。本发明方法定量检测重复性好，可以对样品进行高通量的检测且仅需2个小时左右就能完成。
文档编号C12Q1/04GK102399902SQ20111043270
公开日2012年4月4日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者吴世凯, 杜如虚, 郭亮 申请人:广州中国科学院先进技术研究所