专利名称：枯草芽孢杆菌Fengycin A同系物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种枯草芽孢杆A同系物的应用，属于微生物农药技术领域。
背景技术：
随着越来越多的有毒化学农药逐渐被限制使用，生物农药由于具有生产原料来源广泛，对非靶标生物安全、毒副作用小、对环境兼容性好等特点，已成为全球农药产业发展的新趋势。丝状真菌源生防制剂在病、虫、草害的防治上具有相当的潜力如 Trichoderma 属，尖抱键刀菌(Fusarium oxysporum), Pythium oligandrum, Verticilliumchlamydosporium等。在利用丝状真菌开发生物农药中，产生厚垣孢子是非常重要的，因为其含有丰富的内源营养，抗逆性大大高于分生孢子和菌丝体，能够克服分生孢子制剂存活期短，商品货架期短，而且厚垣孢子在土壤中存活能力要优于分生孢子，能在土壤中定殖而不需要添加外源营养，从而提高防效。我们知道真菌在自然条件下形成的厚垣孢子很少，很多因素如营养、渗透压、光、 PH值、温度、空气、细菌、药物处理和植物的刺激都能诱导真菌形成厚垣孢子。人们通常利用一些特殊C/N比例的培养基，或者在培养基中加入灭菌土壤、土壤浸出液、植物碎片或植物浸出液，或者调整发酵条件的手段使真菌形成大量的厚垣孢子。Venkat Ram[l]首先证明了从土壤中分离的细菌能诱导F. solani形成厚垣孢子，并认为是细菌产生的代谢物诱导的。但到目前为止，只有李蕾等[2]报道枯草芽孢杆菌中的能诱导木霉形成厚垣孢子的代谢物与抗真菌环肽物质IturinA很相似，而本发明中报道的能诱导真菌形成厚垣孢子的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis C2)的代谢物是 FengycinA同系物，其通常被认为是一类抗菌肽[3]，未见其能用于诱导丝状真菌形成厚垣孢子的应用。而我们发现在常规培养基中含有低浓度的此类同系物时，能诱导丝状真菌高效快速地形成大量的厚垣孢子，具有普遍性。参考文献[l]Venkat Ram, C. S. ,1952. Soil bacteria and chlamydospore formation in Fusarium solani. Nature 22 :4334[2] Li L. , Qu Q. , Tian B. Y. , Zhang K. Q. , 2005. Induction of Chlamydospores in Trichoderma harzianum and Gliocladium roseum by Antifungal Compounds Produced by Bacillus subtilis C2. Journal ofPhytopahtology 153 :686-693[3]Ongena, M.，and Jacques, P. 2008. Bacillus lipopeptides versatiIe weapons for plantdisease biocontrol.Trends Microbiol. 16(3) :115-125.
发明内容
本发明的目的在于提供一种能诱导丝状真菌源生物农药形成厚垣孢子的枯草芽孢杆菌代谢物i^engycin A同系物的应用，为制备丝状真菌源生物农药的制剂提供新的方法。本发明是这样实现的生产菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis C2)，该菌株已于2010年1月18 日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路 1号院3号、中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No :3586.将B. subtilis C2用液体培养基常规发酵，发酵液离心后除去菌体，用HCL沉淀， 离心收集沉淀，将沉淀用甲醇溶解，甲醇溶解部位用kphadexLH-20分离得到活性成分C。 将活性成分C用DMSO (二甲基亚砜)配成100 μ g/μ 1，待用。枯草芽孢杆菌i^engycin A同系物利用液相色谱-质谱联用仪测定其分子量和鉴定其
结构。其结构为:
D-allo-Thr4
L-Glu5
I.H
C-H
Ih
C-H
D-〇m2
h4/C—C—N
H OOHH
、 μ Iμ ι ι
N-C——C一N— C——C——N-/Il'
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L-Tyr9R = CnH2n+1 (n = 14-19)。实验表明丝状真菌在含有i^engycin A同系物和脂质成分的普通液体培养基中培养时能形成厚垣孢子。本发明与现有的诱导丝状真菌形成厚垣孢子的方法相比，具有 Fengycin A同系物用量少，形成厚垣孢子的液体培养基和发酵条件简单的特点。Fengycin A同系物的制备(1)将B. subtilis C2用液体培养基常规发酵，液体培养基配方为蛋白胨5g、牛肉膏 3g、NaCl 5g、蒸馏水 1000ml、pH 7.2;(2)发酵液在IOOOOrpm下离心10分钟除去菌体，用HCL将发酵液的pH调节至2，然后置于冰上静止8小时，离心收集沉淀，将沉淀用甲醇溶解，甲醇溶解部位浓缩，将甲醇浓缩馏分用kphadexLH-20在甲醇下洗脱，每15秒接1滴，每瓶收集液体 lml，将收集到的每瓶洗脱液用硅胶G薄层层析检测(展开剂氯仿甲醇水甲酸 6.5 2.5 0.4 0.2;茚三酮显色)，将&值为0.44的洗脱液合并浓缩，得到枯草芽孢杆菌的活性成分C。将活性成分C用DMSO (二甲基亚砜)配成IOOyg/μ 1，待用。(3)枯草芽孢杆菌的活性成分C利用液相色谱-质谱联用仪(High performance liquidchromatography-Electrospray ionization mass spectrometry,LC-ESI-MS)须||定
4其分子量和鉴定其结构。采用XterraMS柱(C18，3. 0X 150mm，3. 5 μ m)进行分析，HPLC的流动相是含有0. 5%甲酸的水和甲醇，流速为0. 5ml/min，梯度洗脱。电喷雾源操作电压为 4. 5KV，操作温度为300°C，操作压力为20abr。它们的特征在于用ESI-MS检测是分子量为 1435. 6，1449. 2，1463. 5，1478. 1的一组峰，每个峰之间的分子量相差14Da.本发明从B. subtilis C2中分离Wi^ngycin A同系物用于诱导厚垣孢子的实验(1)将丝状真菌哈茨木霉CTrichoderma harzianum)，尖孢镰刀菌 (F. oxysporum)，毛头鬼伞(Coprinus comatus)接种于PDA上，PDA培养基配方为马铃薯200克，蔗糖20克，琼脂18克，自来水1000ml，pH自然。将捕食线虫真菌少孢节丛孢 (Arthrobotrys oliospora)接种于CMA上，CMA培养基配方为玉米粉20克，琼脂18克， 水1000毫升。将这三株菌于下培养6-10天。(2)将活化的菌种制备成菌丝悬液，接种到灭过菌的装有IOOml液体培养基的三角瓶中，摇床培养，28°C，180rmp，2-3天。以三角瓶中生物量不增加作为培养结束的指标。(3)丝状真菌哈茨木霉(T. harzianum)，尖孢镰刀菌(F. oxysporum)，毛头鬼伞 (C. comatus)的液体培养基为含有i^engycin A类同系物和脂质成分的PDB培养基，其配方为马铃薯200克，蔗糖20克，脂质(如油酸、亚油酸、棕榈油酸或硬脂酸)10g-30g， Fengycin A :l-5mg，自来水1000ml，pH自然。捕食线虫真菌少孢节丛孢(A. oliospora)的液体培养基为含A类同系物和脂质成分的CMB培养基，其配方为玉米粉20克， 脂质(如油酸、亚油酸、棕榈油酸和硬脂酸)1-50克，FengycinA :l-5mg，自来水1000ml，pH 自然。空白对照为不含有i^ngycin A同系物和脂质成分的PDB或CMB培养基，PDB培养基配方为马铃薯200克，蔗糖20克，自来水1000ml，pH自然；CMB培养基配方为玉米粉 20克，水1000毫升。(4)将培养好的大量菌丝球经纱布过滤后，置于_20°C低温冰箱冷冻，30分钟后， 将冷冻的菌丝球研磨至粉状，菌丝球中的厚垣孢子即分离为单个的孢子，而后烘干，即得到含有大量厚垣孢子的真菌粉状物。(5)厚垣孢子的鉴定①厚垣孢子的显微照相将含有厚垣孢子的真菌粉状物用普通显微镜观察并照相。②厚垣孢子的荧光染色用荧光染色剂DAPI染厚垣孢子的核，用Nile Red染厚垣孢子的脂质成分。丝状真菌在空白对照中生长则无厚垣孢子，而培养基中含有低浓度l_5mg/l的 Fengycin A同系物时丝状真菌形成大量的厚垣孢子，应用于生物农药制备中。厚垣孢子经普通显微镜观察具有厚的双层壁，DAPI染色证明含有核，用Mle Red染色表明含有脂质颗粒，具备厚垣孢子的所有特征。本发明具有i^engycin A同系物用量少，培养厚垣孢子的液体培养基和发酵条件简单的特点，为开发丝状真菌源生物农药制剂提供新的物质。
图1显示丝状真菌在含有i^engycin A同系物和脂质成分的液体培养基中得到的厚垣孢子。图中(A，B)哈茨木霉(T.harzianum)的厚垣孢子；(C)尖孢镰刀菌(F. oxysporum)的厚垣孢子；(D)毛头鬼伞(C. comatus)的厚垣孢子；(E)少孢节丛孢 (A. oliospora)的厚垣孢子。图2显示丝状真菌在含有i^engycin A同系物和脂质成分的液体培养基中得到的厚垣孢子用荧光染色剂DAPI和Nile Red染色。图中A1，B1为普通照相，A2为DAPI染色的 M>t B2 ^Nile Red|fefe^JM>t。 Fo (F. oxysporum) ；Ao (A. oliospora) ；Cc (C. comatus)。
具体实施例方式实施例一Fengycin A同系物用于诱导丝状真菌形成厚垣孢子1、将哈茨木霉(T. harzianum)，尖孢镰刀菌(F. oxysporum)，毛头鬼伞 (C. comatus)接种于PDA上，PDA培养基配方为马铃薯:200克，蔗糖20克，琼脂18克，自来水1000ml，pH自然，将这三株菌于下培养6-10天。2、将活化的菌种制备成菌丝悬液，接种到灭过菌的装有100ml液体培养基的三角瓶中，摇床培养，28°C，180rmp，3天。以三角瓶中生物量不增加作为培养结束的指标。液体培养基为含有脂质成分和I^ngycin A同系物的PDB，其配方为马铃薯200克，蔗糖20 克，脂质成分油酸或亚油酸10克或20克或30克，Fengycin A Img或3mg或5mg，自来水 1000ml,pH自然。空白对照为不含有i^ngycin A同系物和脂质的PDB培养基，其培养基配方为马铃薯200克，蔗糖20克，自来水1000ml，pH自然。3、将培养好的大量菌丝球经纱布过滤后，置于-20°C低温冰箱冷冻，30分钟后，将冷冻的菌丝球研磨至粉状，菌丝球中的厚垣孢子即分离为单个的孢子，而后烘干，即得到含有大量厚垣孢子的真菌粉状物。4、厚垣孢子的鉴定及计数a.厚垣孢子的显微照相将含有厚垣孢子的真菌粉状物用普通显微镜观察并照相，能观察到这些厚垣孢子都有典型的双层壁。(图l.A，B，C，D)。b.厚垣孢子的荧光染色用荧光染色剂DAPI染厚垣孢子的核，用Nile Red染厚垣孢子的脂质成分，能见到这3中真菌的厚垣孢子含有核和脂质成分，部分真菌(图2 =Fo, Ce,)。c.厚垣孢子的数量丝状真菌在含有脂质成分和i^engycin A同系物的PDB培养基中产的厚垣孢子数量如下表表1.哈茨木霉形成厚垣孢子数量
权利要求
1. 一种枯草芽孢杆菌i^engycin A同系物的应用，其特征在于在常规的丝状真菌液体培养基中加入l_5mg/l Wi^ngycin A同系物，10g/l_30g/l的油酸、或亚油酸、或棕榈油酸、 或硬脂酸，诱导丝状真菌形成厚垣孢子；枯草芽孢杆菌i^engycin A同系物用于丝状真菌源生物农药的厚垣孢子的制备。
全文摘要
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌Fengycin A同系物的应用，属于微生物农药技术领域。本发明的枯草芽孢杆菌Fengycin A同系物，由枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C2经常规液体发酵和分离得到。本发明在常规的丝状真菌液体培养基中加入1-5mg/l的Fengycin A同系物、10g/l-30g/l的油酸、或亚油酸、或棕榈油酸、或硬脂酸，诱导丝状真菌形成厚垣孢子。本发明具有Fengycin A同系物用量少，培养厚垣孢子的液体培养基和发酵条件简单易操作的特点，为开发丝状真菌源生物农药的厚垣孢子制备提供新的物质。
文档编号C12R1/645GK102533631SQ20111043248
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者周敬伟, 张克勤, 李蕾 申请人:云南大学