专利名称：具有抑制胃癌细胞bgc-823增殖功能的基因及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因及其制备方法。
背景技术：
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居我国恶性肿瘤的前二位。胃癌因缺乏特异性的初筛指标以及早期患者症状不明显，因此早期胃癌很难发现，大部分胃癌患者就诊时已进入进展期。目前，尽管采用手术、化疗和放疗等综合措施治疗胃癌，但总体疗效仍欠理想。随着胃癌分子生物学研究的不断深入，针对肿瘤细胞生长、凋亡、细胞周期、侵袭浸润以及血管生成等分子生物靶点提出的分子靶向治疗成为胃癌综合治疗的重点和热点。信号转导和转录活化因子(signaltransducers and activators of transcription, Stats)家族是一种存在于胞楽并在激活后能够转入核内与DNA结合的蛋白家族，具有信号转导和转录调控的双重功能。Stat5作为该家族的成员之一，它涉及到由细胞因子，激素和生长因子所介导的各类信号转导过程，参与了细胞生长、分化、凋亡等多种生理功能的调控，并与造血功能、免疫反应以及肿瘤的发生和发展关系密切。RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA (double stranded RNA,dsRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing ,PTGS)的过程，通过反义链与正义链形成双链RNA，特异性地抑制靶基因的表达，即通过人为地弓丨入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA (正义RNA和反义RNA)，从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因。本发明的目的之二在于提供该基因的制备方法。本发明的目的之三在于提供该基因在制备抑制胃癌细胞增殖药物中的应用。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因，其特征在于该基因为SEQ NO. I所示的碱基序列。一种制备上述的具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为根据SilenCircle RNAi转录试剂盒中载体设计的具体要求,设计对应于Stat5基因中GGCG TTA TAT GGC CAG CAT AC核心序列的shRNA的两条部分互补的寡核苷酸序列进行合成，即得到具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因；所述的两条互补寡核苷酸序列为
Sense 5’-ACA CCG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TGC TTG AAG AAT GCT GGC CATATA ACG CCT-3，
Anti-sense: 5’-AM MG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TCA AGC MG AAT GCT GGCCAT ATA ACG CCG -3
其中GGCG TTA TAT GGC CAG CAT AC为与Stat5b基因进行互补配对的序列。上述的具有抑制胃癌细胞增殖功能的基因在制备抑制胃癌细胞增殖药物中的应用。本发明设计对与胃癌细胞BGC-823增殖有关联的基因的RNAi，并应用胃癌细胞BGC-823模型研究其对胃癌细胞BGC-823增殖的抑制作用。为RNAi在胃癌治疗应用提供了一种新方法。
图I为shRNA的寡核苷酸序列引物和pSil—质粒的连接图。图2为实验分组与检测指标未转染对照组数据对比图。
具体实施例方式I.胃癌细胞BGC-823的培养将长满细胞的培养皿中培养基吸出，加2ml无菌I XD-Hanks洗涤两次，弃去洗涤液，加0. 25%胰蛋白酶1-1. 5 ml,消化液均匀覆盖细胞表面，消化时间约1-3分钟。消化后在倒置显微镜下可见细胞皱缩变圆，边缘折光性增强，在细胞尚未脱落时倒掉消化液，立即加入血清或含血清的培养基，终止消化。将培养瓶壁上的细胞吹打下来，1000 rpm/分钟，离心5分钟，弃去培养基，加入含10%FBS的RPMI-1640培养液6ml，吹打混匀，视细胞密度以1:2或1:3分皿培养，当细胞长满培养瓶且形成致密单层时即可再传代。2. Stat5b-RNAi 质粒的设计和转染根据 SilenCircle TM RNAi TranscriptionKit中载体设计的具体要求，设计对应于Stat5b基因的干扰碱基，各为57bp，并进行合成。Stat5b-RNAi对应的序列为
SEQ NO. I:
Sense 5’-ACA CCG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TGC TTG AAG AAT GCT GGC CATATA ACG CCT-3，
Anti-sense: 5’-AM MG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TCA AGC MG AAT GCT GGCCAT ATA ACG CCG -3，
根据SilenCircle RNAi Transcription Kit中载体设计的具体要求,将设计的shRNA和SilenCircle质粒连接，参见图1，然后转染进胃癌细胞BGC-823。图I为SilenCircle 质粒原理的图解，它使用基于RNA的U6聚合酶III启动子和优化的终止子，从而在靶细胞内可以精确地形成小分子干扰RNA(shRNA)。shRNA的表达质粒是一个预切好的备用载体。通过质粒上携带的筛选标记，进行哺乳动物细胞的共转染，可建立shRNA表达的稳定细胞系。通过两个Silencircle 的质粒各自与正义的DNA插入片段及反义的DNA插入片段相连接，便可介导shRNA的产生。或者单个质粒与一个具有发夹结构的DNA插入片段相连接，也可介导shRNA的产生。无论哪种方法，首先必须合成两段互补的DNA片段。而U6启动子则控制着shRNA的生成(参附图)。对于需要进行干扰的目的基因，选择一段靶序列为A2GN17C的DNA片段(祀序列的正义序列)，其GC含量接近50%。3. Stat5b-RNAi质粒的转染转染前一天，在含有5ml无抗生素的RPMI 1640生长培养基的60-mm培养皿里种上2 X IO7个胃癌细胞BGC-823。然后用500 U I无血清的培养基(RPMI1640)溶解 8. 0 ii g 的 Stat5b-RNAi 表达载体，用 500 yl 培养基(RPMI1640)溶解Lipofectamine 2000 (20 U I)，轻轻地混匀，再室温孵育5分钟。孵育5分钟后，这个shRNA表达载体与LipofectamineTM2000充分结合，然后将它们轻轻混匀，室温孵育20分钟，这样做是为了形成Lipofectamine 2000的复合物。DNA-Lipofectamine 2000复合物被加入到60mm培养皿里，之后细胞在37°C，5% CO2培养箱内培养6小时，换上正常细胞培养液。4.实验分组与检测指标未转染对照组组未经转染Stat5b_RNAi的人胃癌细胞BGC-823细胞；空载体对照组转染空载体质粒的人胃癌细胞BGC-823细胞；RNAi组转染Stat5b-RNAi的人胃癌细胞BGC-823细胞。胃癌细胞BGC-823增殖在转染后48小时，将CCK-8加入细胞培养液后l h，使用酶标仪检测胃癌细胞BGC-823的增殖情况。结果请参见图2，图2结果RNAi组胃癌细胞BGC-823在48h以后胃癌细胞增殖明显少于对照组胃癌细胞BGC-823 0°〈O. 05)。说明在胃癌细胞BGC-823中Stat5b_RNAi在48h后可明显胃癌细胞增殖。
权利要求
1.一种具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因，其特征在于该基因为SEQ NO. I所不的喊基序列。
2.一种制备根据权利要求I所述的具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为根据SilenCircle RNAi转录试剂盒中载体设计的具体要求，设计对应于Stat5基因中GGCG TTA TAT GGC CAG CAT AC核心序列的shRNA的两条部分互补的寡核苷酸序列进行合成，即得到具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因；所述的两条互补寡核苷酸序列为Sense 5’-ACA CCG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TGC TTG AAG AAT GCT GGC CATATA ACG CCT-3，Anti-sense: 5’ -MA AAG GCG TTA TAT GGC CAG CAT TCT TCA AGC MG MT GCT GGCCAT ATA ACG CCG -3， 其中GGCG TTA TAT GGC CAG CAT AC为与Stat5b基因进行互补配对的序列。
3.一种根据权利要求I所述的具有抑制胃癌细胞增殖功能的基因在制备抑制胃癌细胞增殖药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因及其制备方法。该基因是根据胃癌细胞BGC-823设计出的Stat5b-shRNA的两条部分互补核苷酸序列，再将该两条互补核苷酸序列和市售SilenCircleTMRNAi转录试剂盒中的SilenCircle质粒进行连接，得到具有抑制胃癌细胞BGC-823增殖功能的基因。本发明设计对与胃癌细胞BGC-823增殖有关联的基因的RNAi，并应用胃癌细胞BGC-823模型研究其对胃癌细胞BGC-823增殖的抑制作用。为RNAi在胃癌治疗应用提供了一种新方法。
文档编号C12N15/113GK102653762SQ201110431938
公开日2012年9月5日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者余抗抗, 宋一超, 朱静嬿, 李哲, 武岳, 陈付学, 陈媛媛 申请人:上海大学