一对胃癌发生相关的竞争性内源rna的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一对胃癌发生相关的竞争性内源RNA，该竞争性内源RNA为FER1L4-PTEN；FER1L4与PTEN之间在胃癌组织中存在正相关性，即FER1L4表达高时，PTEN表达也高，FER1L4表达低时，PTEN表达也低，而FER1L4在胃癌组织和癌旁组织中表达相差9.17倍，说明FER1L4-PTEN在胃癌组织表达异常，与胃癌发生存在相关性，对于进一步研究lncRNA与mRNA参与的基因表达调控网络在生命活动和疾病发生中的作用具有重要的意义。
【专利说明】—对胃癌发生相关的完争性内源RNA
【技术领域】
[0001]本发明涉及竞争性内源RNA，具体涉及一对胃癌发生相关的竞争性内源RNA。
【背景技术】
[0002]在生物体内，mRNA、假基因转录物、长链非编码RNA (long noncoding RNA,IncRNA)等转录物可以竞争性结合相同的微小RNAUicroRNA，miRNA)而相互影响各自的表达水平。这些转录物互相称为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)。研究表明，ceRNA参与正常生命活动过程和疾病的发生，特别是在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。VAPA、CN0T6L、ZEB2、versican和CD44等mRNA以ceRNA方式影响结直肠癌、肝癌、乳腺癌和黑色素瘤等肿瘤的发生'PTENPUKRASPI和0CT4_pg4等假基因转录物以ceRNA方式影响前列腺癌和肝癌等肿瘤的发生'HULC等IncRNA以ceRNA方式影响肝癌的发生等等。IncRNA是一类理想的ceRNA，因为它们不受翻译活性的干扰，可以高效地结合miRNA。除了HULC以外，Iinc-MDl、IincRNA-RoR和扭没等IncRNA均可以在ceRNA角色中发挥作用；如2013 年发表在《Journal of Translational Medicine》杂志上的论文 “Long non-codingRNA expression profile in human gastric cancer and its clinical significances，，指出，lncRNA-/--7Z￥在胃癌组织中的表达水平比癌旁组织中的水平低9.17倍。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一对胃癌发生相关的竞争性内源RNA，既FER1L4与/7TEV之间 在胃癌组织中存在正相关性，可以进一步研究IncRNA与mRNA参与的基因表达调控网络、在生命活动和疾病发生中的作用具有重要的意义。
[0004]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一对胃癌发生相关的竞争性内源RNA,该竞争性内源RNA为FER1L4-PTEN。
[0005]该竞争性内源RNA的介导miRNA为miR-106a_5p。
[0006]该竞争性内源RNA为的筛选:利用IncRNA芯片检测胃癌组织和癌旁组织中IncRNA表达水平，筛选出在胃癌组织中低表达9.17倍的\mmk_FERlL4 ;使用miRcode算法预测与相互作用的miRNA，结果显示上存在miR-106a_5p的结合位点；进一步可以采用双萤光素酶报告基因实验证明miR-106a-5p与相互作用；从TarBase数据库获取并实验验证miR-106a_5p祀标mRNA,其中/TSAr为miR-106a_5p的革巴标之一，因此和/7TEV通过miR-106a_5p介导组成一对ceRNA。采用RT-qPCR检测互为ceRNA的FER1L4和PTE味胃癌组织中的表达水平，分析其表达水平的相关性，得出竞争性内源RNA与之间在胃癌组织中存在正相关性。
[0007]与现有技术相比，本发明的优点在于一对胃癌发生相关的竞争性内源RNA，该竞争性内源RNA为FER1L4-PTEN -'FERllA与PTEN之间在胃癌组织中存在正相关性，即FER1L4表达高时，表达也高，FER1L4表达低时，表达也低，而在胃癌组织和癌旁组织中表达相差9.17倍，说明在胃癌组织表达异常，与胃癌发生存在相关性，对于进一步研究IncRNA与mRNA参与的基因表达调控网络在生命活动和疾病发生中的作用具有重要的意义。
【具体实施方式】
[0008]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0009]使用IncRNA 芯片 Human LncRNA Array (Arraystar, Rockville, MD, USA)检测3对胃癌和癌旁组织中IncRNA表达水平。该芯片覆盖18534种IncRNA。杂交、清洗后，使用Axon GenePix 4000B Microarray Scanner (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)进行扫描，NimbleScan v2.5 (Roche NimbleGen, Madison, WI, USA)分析原始数据，筛选出在胃癌组织中低表达9.17倍的\mmk-FMlL4。使用miRcode算法预测与相互作用的miRNA，表明FER1L4上存在miR-106a_5p的结合位点。令沲FER1L4中miR-106a_5p结合位点上下游约200 bp序列，其中野生型中结合位点为5’-GCACUU-3’，突变型中结合位点为 5’ -UACAGG-3’: 野生型序列为:
TGAGCCTCCCCAGGCCCAGCAGGGGTCCACGTTGTCCCGGCTCACCCGAAAGAAGAAAAAGAAAGCCAGAAGGGATCAGACCCCAAAGGCGGTTCCGCAGCACTTGGACGCCAGCCCCGGTGCCGAGGGGCCTGAGATCCCCCGTGCCATGGAGGTGGAGGTGGAGGAGCTGCTGCCGCTGCCAGAGAATGTCCTGGCGCCCTGT突变型序列为:
TGAGCCTCCCCAGGCCCAGCAGGGGTCCACGTTGTCCCGGCTCACCCGAAAGAAGAAAAAGAAAGCCAGAAG
GGATCAGACCCCAAAGGCGGTTCCGCATACAGGGGACGCCAGCCCCGGTGCCGAGGGGCCTGAGATCCCCCGTGCCA
TGGAGGTGGAGGTGGAGGAGCTGCTGCCGCTGCCAGAGAATGTCCTGGCGCCCTGT
质粒转染前一天，将人胚肾细胞HEK 293T接种到24孔板中培养。使用Lipofectamine2000 Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)将 miR-106a_5p 真核表达质粒 GV268(吉凯，上海，中国)、包含结合位点序列(野生型或突变型)的萤火虫萤光素酶质粒GV272(吉凯，上海，中国)和作为对照的海肾萤光素酶质粒pRL-TK Vector (Promega, Madison,WI, USA)共转染HEK 293T细胞。转染24小时后，使用Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega, Madison, WI, USA)试剂盒处理细胞，检测荧光值。结果显示，突变型一组的相对荧光值高出野生型一组约56%。这表明结合位点突变后，miR-106a-5p对的抑制作用减弱，即野生型和miR-106a-5p存在直接相互作用。TarBase数据库获取经实验验证的 miR-106a-5p 靶标，/7TEV为 miR-106a_5p 的靶标之一，和/7TEV通过 miR-106a_5p介导组成一对ceRNA。用RT-qPCR检测胃癌组织中和的表达水平:使用GoTaq2-Step RT-qPCR System (Promega, Madison, WI, USA)试剂盒进行 RT_qPCR，/--7Z￥ 退火温度为54°C，/退火温度为53°C，似作为外参照，从13例胃癌组织中分析互为ceRNA的/?和/TiJV在胃癌组织中表达水平的相关性，得到表1结果。所用引物序列分别如下:
正向引物:5’ -CCGTGTTGAGGTGCTGTTC-3’
反向引物:5’ -GGCAAGTCCACTGTCAGATG-3’
/7TEV正向引物:5’ -GITTACCGGCAGCATCAAAT-3’
/"TEV反向引物:5’ -CCCCCACTTTAGTGCACAGT-3’似正向引物:5’ -AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3，
似户繼反向引物:5’ -AATGAAGGGGTCAITGATGG-3’
表1胃癌组织中FER1L4和PTEN的相对表达水平
【权利要求】
1.一对胃癌发生相关的竞争性内源RNA，其特征在于该竞争性内源RNA为FER1L4-PTEN。
2.如权利要求1所述的一对胃癌发生相关的竞争性内源RNA，其特征在于该竞争性内源 RNA 的介导 miRNA 为 miR-106a_5p。
【文档编号】C12Q1/68GK103937796SQ201410150768
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】郭俊明, 夏天, 肖丙秀 申请人:宁波大学