专利名称：使用移植了nog确立癌细胞株的非人动物模型进行的抗癌药靶探索以及筛选方法
技术领域：
本发明涉及癌病态非人动物模型，其特征在于可以再现以人类癌症组织的癌症干细胞为顶点的等级结构、癌症进展过程，探讨其生物学特性。本发明还涉及抗癌药的筛选方法或受检物质的药理效果的评价方法，该方法是使用该非人动物模型或对严重免疫缺陷动物一N0D/SCID/ Y (C)(裸)(NOG)小鼠移植人肿瘤组织并确立的NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系。
背景技术：
人的肿瘤细胞中可见各种组织构建，已知其呈以癌症干细胞为顶点的等级结构(非专利文献I)。例如对于结肠癌，已知可大致分为形成腺腔结构的区域和浸润区域这两个等级，该腺腔结构由分化为结肠上皮样的细胞形成；浸润区域显示分化为间充质系细胞 的倾向(非专利文献2、3)。上述认识是由膨大的人结肠癌症组织形态学观察的积累获得的，但是可再现该癌症组织的等级结构的模型动物很稀少，因此，该结构的形成过程、以及癌症干细胞在其中的参与情况尚不明确。另一方面，在对严重免疫缺陷动物一N0D/SCID/ Y (C)(裸)(NOG)小鼠移植人肿瘤组织并确立的NOG确立癌细胞株中，近年来正显示出显示与人类癌症组织类似的组织构建(非专利文献4)。但是目前为止，用于在体内系统中形态学观察癌细胞株的等级结构的形成过程、或者了解其形成过程中癌症干细胞的参与的有用的模型动物尚不存在。已知在用于治疗或预防癌症疾病的药物的开发或评价中，使用反映人的癌症疾病的癌症病态动物模型来进行抗癌药的筛选或评价受检物质的药理效果，这可获得与人临床数据接近的结果。由以上可知，人们需求保有与人的癌症疾病更为类似的病态的非人动物模型。人们还需求在体外系统中呈现与人的癌症疾病病态更为类似的细胞形态的细胞培养体系。现有技术文献 非专利文献
非专利文献 I =Dalerba P.等人·，Annu Rev Med. 2007; 58: 267-284 非专利文献 2 :Brabletz T.等人·，Nat Rev Cancer. 2005; 5: 744-749 非专利文献 3 :Kirchner T.等人·，Am J Pathol. 2000; 157: 1113-1121 非专利文献 4:Fujii E.等人·，Pathol Int. 2008; 58: 559-567。
发明内容
本发明的课题在于提供癌症病态非人动物模型，其特征在于可再现人类癌症组织的等级结构、癌症进展过程及其生物学特性。本发明的课题还在于提供抗癌药靶的探索方法，该方法是使用该非人动物模型或对严重免疫缺陷动物一N0D/SCID/Y (c)(裸)(NOG)小鼠移植人肿瘤组织并确立的NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系。本发明的课题还在于提供对癌症疾病的预防或治疗有效的抗癌药的筛选方法，该筛选方法是使用该非人动物模型或对该NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系。本发明的课题进一步在于提供受检物质对人的癌症疾病的预防效果或治疗效果的评价方法，该方法是使用该非人动物模型或该NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系。本发明人为解决上述课题进行了深入的研究。本发明人认为，在将对严重免疫缺陷动物NOG小鼠移植人肿瘤组织并确立的NOG确立癌细胞株移植到NOG小鼠之后，形态学观察其组织构建，这可以对其等级结构的形成过程、和癌症干细胞在其中的参与、或者其生物学特性进行了解，因此进行了以下的研究。首先，在结肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌的NOG确立癌细胞株移植到该小鼠后进行形态学观察，在人类癌症组织中观察到呈现上皮样结构的区域、和由部分显示间充质系性质的细胞形成的浸润区域(
图1-4)。该等级结构与作为移植源的人类癌症组织酷似，在形成其等级结构的癌症进展过程中可见随时间的变动。并且，如果随时间观察由组织形态不同的移植源肿瘤确立的细胞株，则显示各细胞株经由特有的变动的进展过程，呈现与移植源肿瘤类似的组织图像(表I)，其可重复再现(图5);并且在该过程中，癌症干细胞的样态随时间变迁(推移)(图6、7)。虽然在人结肠癌中部分地预测了该变迁的癌症干细胞的存在，但是，现在通过使用NOG小鼠以及该确立癌细胞株，首次明确了其经验性存在、以及其在肿瘤组织所构建的等级中的参与(图8)。如上所述，从各细胞株重复地经过了特有的变化的进展过程可知，其中所含的癌症干细胞具有特有的最终分化终点这样的生物学特性的一部分(图5、表I)。并且，如果跨两代进行癌症干细胞变迁的追踪，则可以明确在第I代中失去癌症干细胞性并分化的细胞在第2代中重新获得干细胞性，S卩，显示所谓的干细胞的可塑性这样的生物学特性(图9)。近年来已经明确了干细胞获得分化多能的所谓的重编程现象与P53等蛋白质表达的减少有关。因此，在对P53蛋白进行免疫染色时也显示，在同一模型中发现的癌症干细胞中，该P53蛋白表达减少(图10)。由以上可以明确，在该模型中，癌症干细胞的重编程的生物学特性得以忠实再现。同样，近年来有人指出存在于肿瘤间充质的成纤维细胞可能在肿瘤生长·进展方面发挥较大作用，推定在一部分肿瘤中，该成纤维细胞可能通过完全上皮间充质转化(完全EMT)，由肿瘤本身产生(Radisky DC,等人，JCell Biochem. 2007; 101: 830-9)。本发明中，通过对NOG确立癌细胞株移植到小鼠后的随时间观察，发现了不是宿主(小鼠)的成纤维细胞、而是来自于移植的人组织的成纤维细胞，因此表明在同一模型中再现了包含肿瘤间充质形成的等级结构的形成(图11、12)。并且，通过使用本发明的NOG确立癌细胞株，成功地构建了抗癌药抗性模型细胞(图13)。以上显示通过将上述NOG确立癌细胞株移植到该小鼠中并随时间观察，可以制备体内动物模型，该体内动物模型的特征在于(I)可以制备重复再现移植源人类癌症组织的等级结构的模型动物；(2)发现具备形成各等级结构的性质的特有的癌症干细胞，在其上再现癌症干细胞的生物学特性；(3)在该等级结构的再现过程中，发现癌细胞通过完全EMT转化为形成肿瘤间充质的成纤维细胞的过程。这些特征在NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系中也可以再现。
接着，由于可以制备具有上述特征的新的模型动物，因此，对于该模型作为新的抗癌药靶的探索、及其新的筛选方法的应用进行了研究。新的抗癌药靶的探索方法可以如下进行通过激光显微切割法(LMD)采集具有在同一细胞株的各区域的进展过程中特征性地观察到的组织结构的组织块，研究其mRNA表达，由此来研究依赖于过程、组织结构或其生物学特性而变化的基因。上述发现的基因或其所编码的蛋白有助于该癌症进展过程，因此，可认为该抑制物质可成为抑制该癌症进展过程的新的抗癌药靶分子。另一方面，关于新的药物评价筛选方法，可以考虑着眼于观察该模型的随时间变化而看到的癌症进展过程，将现有抗癌药(例如氟尿嘧啶、伊立替康等)给予该模型显示抑制特定的癌症进展过程、或者对癌症干细胞进行特有的生物学特性的调节的事件的方法。将该例子应用于新的抗癌药筛选，则可以了解特定抗癌药发挥作用的癌症进展过程、或特定的生物学特性，因此可认为可以进行临床预测性更高的筛选。
S卩，本发明人成功地制备了保有与人的癌症疾病更为类似的病态的非人动物模型或显示与人类癌症疾病更为类似的细胞形态的、体外条件下的NOG确立癌细胞株培养体系，由此完成了本发明。更具体来说，本发明提供以下的[1]_[18]。[I]非人动物模型，该非人动物模型通过将把人肿瘤组织移植到严重免疫缺陷N0D/SCID/ Y (c)(裸)(NOG)小鼠中确立的NOG确立癌细胞株移植到属于相同或不同种的非人动物中而得到。[2] [I]的非人动物模型，其特征在于该非人动物模型再现人类癌症组织的等级结构和癌症进展过程。[3] [I]的非人动物模型，其特征在于该非人动物模型可以发现具备再现人类癌症组织的等级结构和癌症进展过程的性质的特有的癌症干细胞，研究其生物学特性。[4] [I]的非人动物模型，其特征在于该非人动物模型可在人类癌症组织的等级结构的再现过程中发现癌细胞通过完全上皮间充质转化(完全EMT)转化为形成肿瘤间充质的成纤维细胞的过程。[5]非人动物模型，该非人动物模型可通过对[1]_[4]中任一项的非人动物模型给予抗癌药，以癌细胞的等级结构、其癌症进展过程、其生物学特性、或其显示的完全上皮间充质转化(完全EMT)的变化作为指标进行评价，来研究抗癌药抗性的成因。[6] [1]-[4]中任一项的非人动物模型，其特征在于上述人肿瘤组织是来自结肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌或胰腺癌的肿瘤组织。[7]抗癌药靶的探索方法，其特征在于在移植了 NOG确立癌细胞株的非人动物模型或NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系中，以癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性为指标进行评价。[8] [7]的抗癌药靶的探索方法，其特征在于该方法包含下述(1)-(4)的步骤
(1)将NOG确立癌细胞株移植到非人动物中，由此制备非人动物模型的步骤；
(2)采集显示NOG确立癌细胞株的同一细胞株各区域的癌症进展过程中特征性地观察到的组织结构、或其生物学特性的组织块的步骤；
(3)对于(2)中采集的组织块研究DNA、RNA和蛋白质表达的步骤；以及(4)对依赖于组织块中的癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性变化的基因·蛋白质进行鉴定的步骤。[9] [7]的抗癌药靶的探索方法，其特征在于该方法包含下述(1)-(3)的步骤
(1)在体外条件下培养NOG确立癌细胞株，再现各癌症进展过程的特征结构、或其生物学特性的步骤；
(2)对再现了特征结构的培养细胞的DNA、RNA和蛋白质表达进行研究的步骤；以及
(3)对依赖于培养细胞中的癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性变化的基因·蛋白质进行鉴定的步骤。[10]抗癌药的筛选方法，其特征在于在移植了 NOG确立癌细胞株的非人动物模型或NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系中，以癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性作为指标进行评价。 [11] [10]的抗癌药的筛选方法，其特征在于该筛选方法包含下述(1)-(5)的步骤
(1)将NOG确立癌细胞株移植到非人动物中，由此制备非人动物模型的步骤；
(2)将受检物质给予(I)的非人动物模型的步骤；
(3)采集显示NOG确立癌细胞株的同一细胞株各区域的癌症进展过程中特征性地观察到的组织结构、或其生物学特性的组织块的步骤；
(4)观察组织块中癌细胞等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及
(5)对被受检物质抑制的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程及其生物学特性进行鉴定的步骤。[12] [10]的抗癌药的筛选方法，其特征在于该筛选方法包含下述(1)-(4)的步骤
(1)在体外条件下培养NOG确立癌细胞株，再现各癌症进展过程的特征结构、或其生物学特性的步骤；
(2)用受检物质对(I)的培养细胞进行处理的步骤；
(3)观察培养细胞中的癌细胞的等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及
(4)对被受检物质抑制的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程、或其生物学特性进行鉴定的步骤。[13] [10]的抗癌药的筛选方法，其特征在于该筛选方法包含下述(1)-(5)的步骤
(1)将NOG确立癌细胞株移植到非人动物中，由此制备非人动物模型的步骤；
(2)将受检物质给予(I)的非人动物模型的步骤；
(3)采集显示NOG确立癌细胞株的同一细胞株各区域的癌症进展过程中特征性地观察到的组织结构、或其生物学特性的组织块的步骤；
(4)观察组织块中癌细胞等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及
(5)对抑制特定的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程、或其生物学特性的受检物质进行鉴定的步骤。[14] [10]的抗癌药的筛选方法，其特征在于该筛选方法包含下述(1)-(4)的步骤
(1)在体外条件下培养NOG确立癌细胞株，再现各癌症进展过程的特征结构、或其生物学特性的步骤；
(2)用受检物质对(I)的培养细胞进行处理的步骤；
(3)观察培养细胞中的癌细胞的等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及
(4)对抑制特定的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程、或其生物学特性的受检物质进行鉴定的步骤。
[15]用于治疗或预防人类癌症疾病的药物的评价方法，其特征在于在移植了NOG确立癌细胞株的非人动物模型或NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系中，以癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性为指标进行评价。[16] [15]的药物的评价方法，其特征在于该评价方法包含下述(1)-(5)的步骤
(1)将NOG确立癌细胞株移植到非人动物中，由此制备非人动物模型的步骤；
(2)将受检物质给予(I)的非人动物模型的步骤；
(3)采集显示NOG确立癌细胞株的同一细胞株各区域的癌症进展过程中特征性地观察到的组织结构、或其生物学特性的组织块的步骤；
(4)观察组织块中癌细胞等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及
(5)对被受检物质抑制的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程、或其生物学特性进行鉴定的步骤。[17] [15]的用于治疗或预防人类癌症疾病的药物的评价方法，其特征在于该评价方法包含下述(1)-(4)的步骤
(1)在体外条件下培养NOG确立癌细胞株，再现各癌症进展过程的特征结构、或其生物学特性的步骤；
(2)用受检物质对(I)的培养细胞进行处理的步骤；
(3)观察培养细胞中的癌细胞的等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及
(4)对被受检物质抑制的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程、或其生物学特性进行鉴定的步骤。[18]使用移植了 NOG确立癌细胞株的非人动物或NOG确立癌细胞株作为再现癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性的癌症模型动物或细胞株的方法。根据本发明，提供保有与人类癌症疾病更为类似的病态的非人动物模型、以及在体外体系中呈现与人的癌症疾病病态更为类似的细胞形态的细胞培养体系。通过使用可更良好地反映人的癌症疾病的癌症病态动物模型或癌细胞培养体系，进行抗癌药的筛选或评价受检物质的药理效果，有望获得与人临床数据接近的结果。附图简述图I是表示上皮样生长区域的照片。可见腺腔结构，在细胞全周表达钙粘着蛋白E (E-cadherin)。图2是表示在体外培养条件下的上皮样生长的照片。左侧照片立体悬浮培养。右侧照片在基质胶(Matrigel)中的立体培养。基质胶中的立体培养可见上皮样腺腔结构的形成。图3是表示浸润区域的照片。在各浸润区域的与肿瘤间充质的接触面，钙粘着蛋白E的表达消失。图4是表示其它癌症种类的上皮性区域和浸润区域的照片。可见细胞全周被钙粘 着蛋白E包围的上皮样区域(*)，和钙粘着蛋白E部分消失、可见对纤连蛋白显示阳性的细胞的浸润区域(用箭头表示的部分)。图5是表示移植源癌症组织与NOG确立癌细胞株(继代3代以上确立)的组织构建的再现性的照片。如照片所示，NOG确立癌细胞株重复地再现与移植源癌组织类似的组织结构。图6是表示上皮样生长部的癌症干细胞的照片。在上皮样生长区域，在上皮细胞间可见未被BrdU连续标记标记的低生长细胞(慢周期细胞黑三角)，存在于该BrdU阴性细胞区域的细胞呈现癌症干细胞标志物(Lgr5)阳性。图7是表示浸润生长部的癌症干细胞的照片。在浸润生长区域，在未被BrdU连续标记标记的上皮腺腔结构部可见低生长细胞(黑三角)。同时，在浸润区域也可见低生长细胞(黑箭头)。在显示被认为是该细胞的浸润过程的聚簇的细胞中也观察到低生长细胞(黑箭头)，以上的细胞显示为癌症干细胞标志物(Lgr5)阳性细胞(空心箭头)。图8是表示癌症干细胞与肿瘤等级结构的关系的图。图9是由使用IdU和BrdU的2代连续标记移植试验得到的标本。除了跨2代停止生长的细胞(空心箭头)、在第I代为低生长但在第2代停止生长的细胞(空心三角)之夕卜，还观察到在第I代进行了分化生长、但在第2代停止生长而干细胞化的细胞(箭头)。图10是使用P53以及BrdU抗体的免疫染色标本。可见P53和BrdU弱阳性或阴性细胞(空心箭头)。图11是表示来自人的成纤维细胞的照片。图12是表示来自人的成纤维细胞体外生长的照片和图。在悬浮条件下培养，则只可见上皮样细胞(黑三角)，未见成纤维细胞，如果将该细胞贴壁，则成纤维细胞样细胞生长(黑色箭头)。另外，通过人HMC抗体可以确认该细胞的90%左右是来自人的细胞。图13是表示对移植了 NOG确立结肠癌细胞株的NOG小鼠给予抗癌药(5_氟尿嘧啶)之后可见的抗癌药抗性的癌细胞病理组织的照片。可见低分化腺管(黑色箭头)的增加以及出芽图像(虚线部)减少。实施发明的方案
本发明涉及可有效用于人类癌症疾病的治疗或预防的药物开发的癌症疾病病态非人动物模型，以及在体外系统中呈现与癌症疾病病态更为类似的细胞形态的细胞培养体系。具体来说，涉及将对严重免疫缺陷NOD/SCID/γ (c)(裸)(NOG)小鼠移植人类癌症组织并确立的NOG确立癌细胞株移植到相同或不同种的非人动物中，由此获得的非人动物模型以及NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系。
本发明的非人动物模型可以再现人类癌症疾病的病态中特有地观察到的癌症组织的等级结构、癌症进展过程、及其生物学特性。本发明中，对象癌症疾病的种类没有特别限定，但是可优选例举结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌或胰腺癌。本发明中，“在人类癌症疾病的病态中特有地观察到的癌症组织的等级结构”可举出形成腺腔结构的结构和浸润区域的二级结构，其中，所述腺腔结构由分化为上皮样结构的细胞形成，浸润区域显示分化为间充质系细胞的倾向。在上述上皮样腺腔区域，在细胞全周表达钙粘着蛋白E，钙粘着蛋白E的表达可以使用抗钙粘着蛋白E抗体来确认。在上述浸润区域中，显示出芽、肿瘤细胞的聚簇、解离的单个的肿瘤细胞以及小管重建这样的特征形态图像。位于这些浸润区域的细胞发生部分丧失上皮性的部分-EMT，在与间充质系细胞的接触面，钙粘着蛋白E的表达消失，通常有在上皮样 细胞中未见表达的纤连蛋白表达。在上述上皮样腺腔区域和上述浸润区域，可以发现为低生长细胞的癌症干细胞。对于在这些区域是否存在癌症干细胞，可使用细胞生长标志物(例如BrdU连续标记和Ki67染色)或癌症干细胞标志物(例如Lgr5染色)等确认。并且，可以将再现上述癌症组织的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性，以及可确认癌症干细胞的存在组合，在不同时间对该两者同时进行观察。由此可以了解等级结构和癌症进展过程是如何以癌症干细胞为起点，构建癌症组织特有的组织的。更具体地说，在移植初期的高应激的环境下，主要是癌症干细胞及其祖细胞存活。转移到生长期，则由上述上皮样腺腔区域出现形成腺腔的癌细胞，另一方面仍保有总是具备低生长性的癌症干细胞及其祖细胞，其担负着上皮样腺腔区域进一步扩大的作用。另一方面，在上述浸润区域中，由耐受了移植初期的高应激环境的细胞出现肿瘤细胞的聚簇、解离的单个的肿瘤细胞这样的部分EMT细胞。为了引发部分EMT，这些低生长的癌症干细胞是迁移性的，因此担负着癌症的浸润 传播等性质，同时扩大其区域。并且若一部分的部分EMT细胞到达一定的环境中，那么发生所谓的间充质上皮转化(MET)。由此，一度丧失上皮性的部分EMT细胞再次获得上皮细胞的性质，由其形成新的上皮样腺腔结构。 本发明中，“在人类癌症疾病的病态中特有地观察到的癌症进展过程”可以是对每种癌细胞的分化能力例举的以下的过程。为高分化癌时，是以上皮样生长过程(上皮管形成模式Epithelialduct-forming pattern))为主体的过程。为中分化癌时，是含有上皮样生长过程(上皮管形成模式(epithelial duct-forming pattern))、同时以浸润生长过程(浸润EMT模式(invasive EMT pattern))为主体的过程。为低分化癌时，是以浸润生长过程(浸润EMT模式(invasive EMT pattern))为主体的过程。本发明中，作为“可探讨癌症干细胞的生物学特性”的例子，可以举出以下几点。各细胞株重复地经过了特有的变化的进展过程，因此，其中所含的癌症干细胞显示了相同细胞株具有特有的最终分化终点这样的生物学特性。并且，如果跨两代进行癌症干细胞变迁的追踪，则在第I代中失去癌症干细胞性并分化的细胞在第2代中重新获得干细胞性，S卩，显示所谓的干细胞的可塑性这样的生物学特性。
已知干细胞的分化多能的获得、即所谓重编程的生物学特性与P53蛋白质表达的减少有关，这在同一模型中发现的癌症干细胞中也有再现。本发明的动物模型中再现了癌细胞通过完全上皮间充质转化(完全-EMT)转化为形成肿瘤间充质的成纤维细胞的过程。对于转化为成纤维细胞，可通过进行IHC染色来确认。对于是否进行了向人特异性成纤维细胞的转化，这可通过对人特异性β2微球蛋白进行IHC染色来确认。本发明的动物模型中，可以观察到在上述对象癌症疾病的种类、或者癌症疾病的进展状况中特有的过程。本发明的动物模型中，可发现特有的癌症干细胞，该特有的癌症干细胞具备再现上述人类癌症组织的等级结构和癌症进展过程的性质。可用于该动物模型制备的动物可举出除人类以外的小鼠、裸小鼠、大鼠、裸大鼠、 豚鼠、仓鼠、兔、狗或猴等通常试验中常用的哺乳动物。可优选例举小鼠、裸小鼠、大鼠、裸大鼠、豚鼠、仓鼠或兔等啮齿类动物。从饲养或操作的简便性考虑，可更优选例举小鼠、裸小鼠(例如N0D/SCID/ Y (c)(裸)(NOG)小鼠)、大鼠、裸大鼠。确立NOG确立癌细胞株的严重免疫缺陷N0D/SCID/ Y (c)(裸)(NOG)小鼠(供体动物)和移植了 NOG确立癌细胞株的动物(受体动物)可以是同一种动物，也可以是不同种动物。从免疫学观点考虑，优选同一种动物，在使用如裸小鼠或裸大鼠等免疫缺陷动物时，可以使用互相不同种的动物。以下对本发明的动物模型的制备方法进行说明。对于本发明的动物模型，可通过将对供体动物一严重免疫缺陷N0D/SCID/ Y (c)(裸)(NOG)小鼠移植人肿瘤组织并确立的NOG确立癌细胞株移植到受体动物的皮下、各体腔或各器官来制备。对于移植到受体动物中的NOG确立癌细胞株，可以从该NOG小鼠中摘出、确立。所述NOG小鼠的周龄可根据所移植的确立癌细胞株的种类或受体动物的种类来选择。对于受体动物的周龄，在例如为小鼠、裸小鼠、SCID小鼠、NOD-SCID小鼠、NOG小鼠、大鼠、裸大鼠时，优选使用4-100周龄的受体动物。本发明的动物模型具体可按照下述方法制备。首先将来自人的癌细胞移植到NOG小鼠中并继代，将确立的NOG确立癌细胞株(Fujii E等人.，Pathol Int. 2008;58:559-567)移植到受体动物中。从移植技术简便的观点考虑，皮下移植是优选的移植部位，但移植部位并没有特别限定，优选根据所使用的动物选择适当的移植部位。NOG确立癌细胞株的移植操作没有特别限定，可按照常用的移植操作进行。在上述移植后，本发明的动物模型可以进一步根据需要在常规或无菌条件下饲养。饲养条件没有限定，具体来说，可例举温度条件20-26°C、湿度条件30-70%、喂食 喂水条件自由摄取、照明周期12小时明暗周期。饲养时间没有特别限定，优选地，对于小鼠、裸小鼠、大鼠或裸大鼠均可以是自移植起饲养3天以上，优选28天以上。通过将移植动物饲养规定的时间，移植的NOG确立癌细胞株在该移植部位分化生长为具有人肿瘤组织的组织学特征的组织。这样，本发明的动物模型具有具备人肿瘤组织的特征的组织，可作为人类癌症疾病的病态动物模型提供。
该细胞的培养方法是在适当的培养基(D-MEM、MEM、RPMI1640, BME、D-MEM/F12、G-MEM等)中加入适当的添加物(灭活胎牛血清、青霉素、链霉素、葡萄糖、碳酸氢钠、HEPES、L-葡糖胺、肝素、BSA、FGF、EGF、运铁蛋白、胰岛素、腐胺、亚硒酸盐、孕酮等)，将其在适合哺乳类动物细胞培养的条件(例如37°C、5%C02存在下)实施。通过以在这些动物或细胞株中表达的癌细胞的等级结构、癌症进展过程或其生物学特性为指标进行评价，本发明的模型动物或NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系可用于抗癌药靶的探索、抗癌药的筛选、或用于治疗或预防人类癌症疾病的药物的评价筛选。本发明涉及抗癌药靶的探索方法，其特征在于在移植了 NOG确立癌细胞株的非人动物模型或NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系中，以癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性为指标进行评价。本方法中，在使用移植了 NOG确立癌细胞株的非人动物模型时，可通过以下
(1)-(4)的步骤进行抗癌药靶的探索
(1)将NOG确立癌细胞株移植到非人动物中，由此制备非人动物模型的步骤；
(2)采集显示NOG确立癌细胞株的同一细胞株各区域的癌症进展过程中特征性地观察到的组织结构、或其生物学特性的组织块的步骤；
(3)对于(2)中采集的组织块研究其DNA、RNA和蛋白质表达的步骤；以及
(4)对依赖于组织块中的癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性变化的基因·蛋白质进行鉴定的步骤。本方法中，在使用NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系时，可按照以下
(1)-(3)的步骤进行抗癌药靶的探索。(I)在体外条件下培养NOG确立癌细胞株，再现各癌症进展过程的特征结构、或其生物学特性的步骤；
(2)对再现了特征结构的培养细胞的DNA、RNA和蛋白质表达进行研究的步骤；以及
(3)对依赖于培养细胞中的癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性变化的基因·蛋白质进行鉴定的步骤。本发明中，对于癌症进展过程中特征性地观察到的组织或细胞株的结构观察，可如下进行通过AMeX法等制备薄切片组织标本，再对其实施HE染色和免疫组织化学染色(IHC)。在受检组织中，在上述人肿瘤组织中确认特异性的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性时，作为癌症的关联组织，要确认DNA、RNA和蛋白质表达。本发明中，RNA可举出mRNA或微小RNA，但并不限于它们。对于DNA、RNA和蛋白质表达的确认没有特别限定，可按照常用的表达确认方法进行。例如，可按照常规方法提取各基因的mRNA，通过实施以该mRNA为模板的RNA杂交法、或RT-PCR法来进行各基因转录水平的测定。也可以进一步使用DNA阵列技术，测定各基因的表达水平。还可以按照常规方法回收含有由各基因编码的蛋白质的部分，通过SDS-PAGE等电泳法检测各蛋白质的表达，由此进行基因翻译水平的测定。还可以使用各蛋白质的抗体，实施蛋白质印迹法，检测各蛋白质的表达，由此进行基因翻译水平的测定。本发明涉及抗癌药的筛选方法，其特征在于在移植了 NOG确立癌细胞株的非人动物模型或NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系中，以癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性为指标进行评价。本方法中，使用移植了 NOG确立癌细胞株的非人动物模型时，可按照以下(1)-(5)的步骤进行抗癌药的筛选
(1)将NOG确立癌细胞株移植到非人动物中，由此制备非人动物模型的步骤；
(2)将受检物质给予(I)的非人动物模型的步骤；
(3)采集显示NOG确立癌细胞株的同一细胞株各区域的癌症进展过程中特征性地观察到的组织结构、或其生物学特性的组织块的步骤；
(4)观察组织块中癌细胞等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及
(5)对被受检物质抑制的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程及其生物学特性进行 鉴定的步骤。作为使用移植了 NOG确立癌细胞株的非人动物模型时的又一方案，可按照以下(1)-(5)的步骤进行抗癌药的筛选
(1)将NOG确立癌细胞株移植到非人动物中，由此制备非人动物模型的步骤；
(2)将受检物质给予(I)的非人动物模型的步骤；
(3)采集显示NOG确立癌细胞株的同一细胞株各区域的癌症进展过程中特征性地观察到的组织结构、或其生物学特性的组织块的步骤；
(4)观察组织块中癌细胞等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及
(5)对抑制特定的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程、或其生物学特性的受检物质进行鉴定的步骤。本方法中，使用NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系时，可按照以下(1)-(4)的步骤进行抗癌药的筛选
(1)在体外条件下培养NOG确立癌细胞株，再现各癌症进展过程的特征结构、或其生物学特性的步骤；
(2)用受检物质对(I)的培养细胞进行处理的步骤；
(3)观察培养细胞中的癌细胞的等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及
(4)对被受检物质抑制的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程、或其生物学特性进行鉴定的步骤。作为使用NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系时的又一方案，可按照以下
(1)-(4)的步骤进行抗癌药的筛选
(1)在体外条件下培养NOG确立癌细胞株，再现各癌症进展过程的特征结构、或其生物学特性的步骤；
(2)用受检物质对(I)的培养细胞进行处理的步骤；
(3)观察培养细胞中的癌细胞的等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及
(4)对抑制特定的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程、或其生物学特性的受检物质进行鉴定的步骤。
本发明的方法中的“受检物质”没有特别限定，例如可举出天然化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、肽、氨基酸等单一化合物，以及化合物文库、基因文库的表达产物、细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物、原核细胞提取物、真核单细胞提取物或动物细胞提取物等。它们可以是纯化物，还可以是植物、动物或微生物等的提取物等的粗纯化物。受检物质的制造方法也没有特别限定，可以是由天然产物分离的物质，也可以是化学或生物化学合成的物质，还可以是基因工程制备的物质。上述受检试样可根据需要适当标记后使用。标记物例如可举出放射标记物、荧光标记物等。除上述受检试样之外，也包含将多种这些受检试样混合得到的混合物。本方法中，对于对非人动物模型给予受检物质的方法也没有特别限定。根据所给予的受检物质的种类，可适当选择口服给予，或皮下、静脉、局部、透皮或经肠(直肠)等的非口服给予。本方法中，对于用受检物质对NOG确立癌细胞株的培养细胞进行处理的方法也没有特别限定。该处理可通过在细胞的培养液或该细胞提取液中添加受检试样来进行。受检试样为蛋白质时，例如可以通过将含有编码该蛋白质的DNA的载体导入NOG确立癌细胞株， 或者将该载体添加到NOG确立癌细胞株的细胞提取液中来进行。例如还可以利用使用酵母或动物细胞等的双杂交法。受检物质的评价可如下进行然后，对该模型动物摘出移植组织(移植了 NOG确立癌细胞株的组织)，观察该移植组织的组织学特征，或者在细胞培养体系中测定组织学特征。具体来说，受检物质的评价可如下进行在非人动物模型或NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系中，观察移植组织或培养体系的癌细胞的等级结构，确认是否形成人类癌细胞特有的等级结构，或者确认对人类癌症疾病的特征性的癌症进展过程的影响。对癌症进展过程中特征性地观察到的组织或细胞株的结构观察可如下进行通过AMeX法等制备薄切片组织标本，再实施HE染色和免疫组织化学染色(IHC)。更具体地说，上述受检物质的评价可如下进行对于未给予受检物质的对照非人动物模型或NOG确立癌细胞株同样地观察移植组织或培养体系的癌细胞的等级结构，确认是否形成人类癌细胞特有的等级结构，对比给予了受检物质的非人动物模型或NOG确立癌细胞株和上述对照动物的癌细胞的等级结构。这种情况下，与对照动物的情况相比，如果在给予了受检物质的移植组织或培养体系中未见人类癌细胞特有的等级结构，或者其比例降低时，则可以选择这些受检物质作为具有人类癌症疾病的治疗或预防效果的有效物质。更具体地说，上述受检物质的评价可如下进行对于未给予受检物质的对照非人动物模型或NOG确立癌细胞株同样地观察移植组织或培养体系的癌症进展过程，确认是否可见人类癌细胞特有的癌症进展过程，对比给予了受检物质的非人动物模型或NOG确立癌细胞株和上述对照动物的癌症干细胞的癌症进展过程。这种情况下，与对照动物的情况相t匕，如果在给予了受检物质的移植组织或培养体系中未见人类癌细胞特有的癌症进展过程，则可以选择这些受检物质作为具有人类癌症疾病的治疗或预防效果的有效物质。并且更具体地说，上述受检物质的评价可如下进行对于未给予受检物质的对照非人动物模型或NOG确立癌细胞株同样地观察移植组织或培养体系的癌症干细胞的生物学特性，确认是否可见人类癌细胞特有的该特性，对比给予了受检物质的非人动物模型或NOG确立癌细胞株和上述对照动物的癌症干细胞的该特性。这种情况下，与对照动物的情况相比，如果在给予了受检物质的移植组织或培养体系中未见人类癌细胞特有的该特性，则可以选择这些受检物质作为具有人类癌症疾病的治疗或预防效果的有效物质。对于用上述本发明的筛选方法选择的人类癌症疾病的预防有效物质或治疗有效物质，可根据需要进一步进行其它的药效试验或安全性试验等，或者进一步对人类癌症疾病患者进行临床试验，由此可以选择作为效果更高、实用性高的预防有效物质或治疗有效物质。上述选择的预防有效物质或治疗有效物质还可进一步根据其结构分析结果，通过化学合成、生物化学合成(发酵)或基因学操作来工业化制造。本发明涉及用于治疗或预防人类癌症疾病的药物的评价筛选方法，其特征在于在移植了 NOG确立癌细胞株的非人动物模型中，以癌细胞等级结构或癌症进展过程为指标进行评价
本方法中，在使用移植了 NOG确立癌细胞株的非人动物模型时，可通过以下的(1)-(5) 的步骤进行药物的评价。(I)将NOG确立癌细胞株移植到非人动物中，由此制备非人动物模型的步骤；
(2)将受检物质给予(I)的非人动物模型的步骤；
(3)采集显示NOG确立癌细胞株的同一细胞株各区域的癌症进展过程中特征性地观察到的组织结构、或其生物学特性的组织块的步骤；
(4)观察组织块中癌细胞等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及
(5)对被受检物质抑制的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程及其生物学特性进行鉴定的步骤。本方法中，在使用NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系时，可通过以下(1)-(4)的步骤进行药物的评价
(1)在体外条件下培养NOG确立癌细胞株，再现各癌症进展过程的特征结构、或其生物学特性的步骤；
(2)用受检物质对(I)的培养细胞进行处理的步骤；
(3)观察培养细胞中的癌细胞的等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及
(4)对被受检物质抑制的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程、或其生物学特性进行鉴定的步骤。本发明的药物的评价可如下进行对上述非人动物模型给予对象受检物质，或者将NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系用受检物质进行处理，检验该受检物质的给予对于移植组织(移植了 NOG确立癌细胞株的组织)或培养体系的预防或改善效果。这里，具体来说，受检物质的给予对上述移植组织或培养体系的预防或改善的效果可通过对给予受检物质所引起的癌细胞的等级结构的形态、癌症进展过程或其生物学特性进行鉴定 观察来评价。在非人动物模型或NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系中，通过观察移植组织或培养体系的癌细胞的等级结构，确认是否形成人类癌细胞特有的等级结构，或者确认对于人类癌症疾病中的特征性的癌症进展过程的影响来进行。
更具体地说，上述受检物质的评价可如下进行对于未给予受检物质的对照非人动物模型或NOG确立癌细胞株同样地观察移植组织或培养体系的癌细胞的等级结构，确认是否形成人类癌细胞特有的等级结构，对比给予了受检物质非人动物模型或NOG确立癌细胞株和上述对照动物的癌细胞的等级结构。这种情况下，与对照动物的情形相比，如果在给予了受检物质的移植组织或培养体系中未见到人类癌细胞特有的等级结构，或者其比例降低时，则对于给予了该受检动物或对该培养体系进行了处理的受检物质，可以认定其对于人类癌症疾病的预防效果或治疗效果，还可以由其降低的程度来评价预防效果或治疗效果的程度。更具体地说，上述受检物质的评价可如下进行对于未给予受检物质的对照非人动物模型或NOG确立癌细胞株同样地观察移植组织或培养体系的癌症进展过程，确认是否可见人类癌细胞特有的癌症进展过程，对比给予了受检物质的非人动物模型或NOG确立癌细胞株和上述对照动物的癌症干细胞的癌症进展过程。这种情况下，与对照动物的情况相t匕，如果在给予了受检物质的移植组织或培养体系中未见人类癌细胞特有的癌症进展过程，则对于给予了该受检动物或对该培养体系进行了处理的受检物质，可以认定其对于人类癌症疾病的预防效果或治疗效果，还可以由癌症进展过程的表现率程度来评价预防效果 或治疗效果的程度。并且更具体地说，上述受检物质的评价可如下进行对于未给予受检物质的对照非人动物模型或NOG确立癌细胞株同样地观察移植组织或培养体系的癌症干细胞的生物学特性，确认是否可见人类癌细胞特有的该特性，对比给予受检物质的非人动物模型或NOG确立癌细胞株和上述对照动物的癌症干细胞的该特性。这种情况下，与对照动物的情况相t匕，如果在给予了受检物质的移植组织或培养体系中未见人类癌细胞特有的该特性，则对于给予了该受检动物或对该培养体系进行了处理的受检物质，可以认定其对于人类癌症疾病的预防效果或治疗效果，还可以由该特性的表现率程度来评价预防效果或治疗效果的程度。本发明涉及使用移植了 NOG确立癌细胞株的非人动物或NOG确立癌细胞株作为再现癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性的癌症模型动物或细胞株的方法。通过将NOG确立癌细胞株移植到非人动物中，可以人工或人为地在体内再现癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性。因此，对于移植了 NOG确立癌细胞株的非人动物，在利用癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性进行例如药物等的评价、药物或诊断药的靶候选分子的探索、作用于该候选分子的化合物或生物制剂等的评价时，这样的非人动物成为非常有用的癌症模型动物。仅凭NOG确立癌细胞株即可以人工或人为地在体内或体外再现癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性。因此，在利用癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性进行例如药物等的评价、药物或诊断药的靶候选分子的探索、作用于该候选分子的化合物或生物制剂等的评价时，NOG确立癌细胞株成为非常有用的癌症模型动物。再现是指根据该模型的使用目的以能够达到规定的目的的程度实现即可，并不一定需要在生物体内发生的事件完全按原样实现。本说明书中引用的所有的现有技术文献均作为参照结合到本说明书中。实施例以下通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不限定为这些实施例。[实施例I]NOG确立癌细胞株再现人类癌症组织的等级结构 (I)NOG确立癌细胞株和染色法
在NOG小鼠中使用以可以将人结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌移植·继代3代以上作为确立条件制备的NOG确立癌细胞株(Fujii E等人.，Pathol Int. 2008;58:559-567)。本实施例中，将NOG确立癌细胞株皮下移植到NOG小鼠中，28天后解剖检查，摘出移植物，用4%低聚甲醛、在4°C下、以16-24小时的条件进行固定，然后通过AMeX法包埋，制备薄切片组织标本(Fujii E.等人.，Pathol Int. 2008; 58: 559-567)。对组织实施HE染色和免疫组织化学染色(IHC)，一级抗体使用抗钙粘着蛋白E抗体(DakoCytomation制造)以及抗纤连蛋白抗体(DakoCytomation制造),使用LSAB法、通过DAB 显色(DAB Map 试剂盒，Roche Diagnostics 制造)。 为了进行体外培养，将由小鼠回收的细胞团块用剪刀物理绞碎。接着加入胶原酶 / 分散酶(Roche,目录号 10 269 638 001)和 DNA 酶 I (Roche,目录号 11 284 932001)，在37°C下搅拌30分钟。进一步反复移液，调节磨碎的细胞。将调节后的细胞用CellBanker-1 (JUJI FIELD,目录号 BLC-1)悬浮，在 _80°C 以下保存。使用将培养基中的胎牛血清通过在56°C下进行保温30分钟以上的处理而灭活的胎牛血清，将上述调节后的细胞在培养基I (RPMI1640、10%胎牛血清、青霉素、链霉素)中培养。球状体的制备是将细胞在培养基I中悬浮，使其浓度为4X105个细胞/mL，将5 mL细胞接种于Hydrocell 6cm皿(NUNC，目录号174912)。培养3_6天后用显微镜确认球状体的形成。形成球状体后，将所有细胞过40 μπι细胞筛(BD,目录号352340)，只回收该球状体细胞，在培养基I中培养。作为再现腺腔结构的培养体系，是将基质胶基底膜基质(Matrigel BasementMembrane Matrix) (BD,目录号354234)原液以50 μ L/孔加入到96孔板中。将其在37°C下放置5分钟，进行96孔板的包被。接着，以50 UL /孔加入球状体细胞。进一步以50μ L/孔加入用培养基I稀释为20%的基质胶基底膜基质，在37°C下放置5分钟。最后以100 μ L/孔加入培养基I，培养至可见腺腔结构。(2)结果和结论
据认为人结肠癌组织的上皮样腺腔区域的特征是在细胞全周表达钙粘着蛋白E的表达(Kirchner T 等人·，Am J Pathol. 2000; 157:1113-1121)，该特征在 NOG 确立癌细胞株中可见(图I)。显示在上述体外条件下，形成球状体的细胞再现了腺腔结构(图2)。与此相对，已知在具有更未分化的间充质系细胞的性质的浸润区域，显示出芽、肿瘤细胞的聚簇、解离的单个的肿瘤细胞以及小管重建这样的特征形态图像。还已知位于这些区域的细胞被认为发生部分丧失上皮性的部分-EMT，在与间充质的接触面，钙粘着蛋白E的表达消失,表达通常上皮细胞不表达的纤连蛋白(Kirchner T.等人.，Am J Pathol.2000; 157: 1113-1121)。这次，在NOG确立结肠癌细胞株的移植肿瘤中再现了这些特征(图 3)。同样的上皮样区域和浸润区域在胃癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌中也得到确认(图4)。由以上结果表明，NOG确立癌细胞株再现了人类癌症组织的等级结构。[实施例2]NOG确立癌细胞株再现形成移植源人类癌症组织的特征性等级结构的过程
(I) NOG确立癌细胞株和染色法
将移植源人结肠癌组织的组织形态为(I)高分化型腺癌、(2)中分化型腺癌、(3)低分化型腺癌的NOG确立癌细胞株皮下移植至NOG小鼠中，在3、7、14、17或21天后解剖检查，与上述同样地实施HE染色和IHC，形态学求出上皮样区域和浸润部分区域的比例。在胃癌、结肠癌、肺癌中，为了确认该组织构建的重复再现性，进行移植源癌症组织和NOG确立癌细胞株的HE染色标本的观察。 (2)结果和结论
了解到，达到呈现移植源人结肠癌组织的等级结构分别经历特有的癌症进展过程，在高分化腺癌的情况下，是以上皮样生长过程(上皮管形成模式(Epithelial duct formingpattern))为主体，在中分化腺癌的情况下，是以含有上皮样生长，同时以浸润生长过程(浸润EMT模式(Invasive EMT pattern))为主体,在低分化腺癌的情况下,主要是浸润生长过程。该各细胞株特有的等级分化也可通过多次的移植继代重复再现(图5)。[表I]达到各NOG确立株的等级结构的随时间的变化
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a :接种后的天数
b:IHC切片中检测出β_联蛋白的核积累。[实施例3]在NOG确立癌细胞株中发现具备形成各等级结构的性质的特有的癌症干细胞
(I)NOG确立癌细胞株和染色法
已知癌症干细胞通常是细胞周转非常慢的低生长细胞(Li L, Neaves WB. Cancerres. 2006; 66:4553-4557)。着眼于该性质，在将NOG确立癌细胞株皮下移植至NOG小鼠中时，同时开始进行在细胞分裂期掺入的BrdU的连续标记，标记14天后解剖检查，进行组织处理。通过将该组织与上述同样地进行HE染色，进行形态观察，并且通过IHC染色进行掺入了 BrdU的细胞的检测(抗体Beckton Dickinson制造)以及进行使用Ki67抗体作为细胞分裂期标志物的IHC染色，鉴定生长细胞和低生长细胞。进一步对于与其相邻接的标本，使用针对已知作为癌症干细胞标志物的Lgr5的抗体(MBL制造)，实施IHC染色(McDonaldSAC,等人·，Virchows Arch. 2009; 455: 1-13) (2)结果和结论
在实施了 BrdU连续标记的组织中，可在上皮样生长和浸润生长两个区域看见一部分未被标记的细胞，该细胞为Ki67阴性。由此可以认为在两个区域存在作为癌症干细胞的特征而已知的、细胞周转非常慢的低生长细胞，将与该标本相邻接的标本用癌症干细胞标志物Lgr5染色，则得到了与低生长细胞的存在部位一致的染色图像(图6)。这些低生长细胞分别在上皮样生长部和浸润生长部被发现(图7)。结合以上和取得实施例2的等级结构的过程考虑，显示癌症干细胞的存在部的变迁及其等级结构的形成如图8所示。过去通过观察人结肠癌，假定了在上皮样生长部可见的静止干细胞(stationarystem cell)和在转移目标地等同样有助于形成等级结构的迁移干细胞(migrating stemcell)的存在。然而，通过本次研究，如图8所示，显示了上述干细胞的实际存在，并且显示，它们不是不同的两种癌症干细胞，而可以相互转变，以及其变迁参与了肿瘤等级结构的形 成。如实施例2所示，NOG确立癌细胞株忠实地再现了各移植源人类癌症组织的最终分化终点，这通过多次继代，总是会再现，由此可以明确，其中所含的癌症干细胞规定了各自的最终分化终点。由以上显示，在研究癌症干细胞所特有的生物学特性方面，本模型是适合的。[实施例4]通过使用IdU和BrdU跨两代追踪癌症干细胞，发现癌症干细胞的可塑性
(I)NOG确立癌细胞株和染色法
将NOG确立癌细胞株皮下移植至NOG小鼠中时，同时开始IdU连续标记，标记28天后解剖，制备用于次代的IdU标记的移植细胞株。移植至次代的同时，开始该细胞株的BrdU连续标记，在移植3天后将其解剖，进行组织处理。将以上得到的连续组织标本用检出IdU和BrdU的抗体(Beckton Dickinson制造)和只检出BrdU的抗体(Serotec制造)、通过IHC染色检出，检出生长细胞和低生长细胞的跨世代的变动。(2)结果和结论
如图9所示，将第二代、移植3天后的标本用检出IdU和BrdU的抗体进行IHC染色时，得到阳性染色，在用只检出BrdU的抗体染色时，发现了阴性的细胞。由以上的染色结果显示，这些细胞在第一代中掺入了 IdU，但在第二代中未掺入BrdU，这可以认为在第一代中进行了细胞分裂的分化细胞在第二代中停止生长而低·非生长细胞化(干细胞化)。如上所述，分化生长的细胞干细胞化的现象被称为可塑性，一度被认为是癌症干细胞的生物学特征之一(Gupta PB.等人·，Nature med. (2009) 15: 1010-12)。由以上表明，本模型适合癌症干细胞的生物学特性可塑性的研究。[实施例5]发现参与干细胞的重编程的低P53蛋白表达细胞与癌症干细胞一致 (I)NOG确立癌细胞株和染色法
近年来，在制备所谓的诱导多能干(induced pluripotent stem, iPS)细胞时,如果使P53蛋白的表达减弱，则其制备效率飞跃性提高，由此显示，该蛋白参与了体细胞通过重编程进行的干细胞化，有人还指出了该机制在癌症干细胞中的重要性(Krizhanovsky V和Lowe Sff, Nature 2009; 460: 1085-6)。
因此，为了观察在NOG确立癌细胞株中发现的癌症干细胞与P53低表达细胞的一致，对实施了 BrdU连续标记处置的NOG小鼠皮下移植确立细胞株后，第28天解剖，进行组织处理。将由此得到的连续组织标本用抗P53抗体(DakoCytomation制造)和抗BrdU抗体(Beckton Dickinson制造)、通过IHC染色使其可观察,观察到其一致状况。(2)结果和结论
在很多癌症中均报道了 P53的过量表达(Toledo F和Wahl GM. , Nature rev cancer2006; 6: 909-923)，但这次在很多的NOG确立癌细胞中也观察到该蛋白的过量表达。另一方面，与BrdU弱阳性和阴性细胞一致地，P53的表达减弱或消失(图10)。近年来，已经了解到在使体细胞获得分化多能的所谓的重编程中，P53蛋白表达的减少在包括癌症干细胞在内的干细胞生物学特性方面担负着重要的作用。因此，在本模型的癌症干细胞中也见到了 P53蛋白表达的减少，这显示该细胞中，干细胞的重编程机制发挥了作用，明确了该模型适合研究其生物学特性。 [实施例6]NOG确立癌细胞株中，发现了癌细胞通过完全EMT转化为形成肿瘤间充质的成纤维细胞的过程
(I)NOG确立癌细胞株和染色法
将NOG确立癌细胞株皮下移植至NOG小鼠中后14天，将各动物解剖检查，对于所得的肿瘤团块、实施人特异性的β 2微球蛋白的IHC染色，研究种的来源。在体外培养之前，使用人特异性抗人HLA-ABC抗原/RPE (DAK0,目录号R7000)抗体、和小鼠特异性抗小鼠(Anti-mMuse) MHC I类(Abeam,目录号abl5680_50)抗体,通过流式细胞术确认所接种的细胞的种的来源，然后将其在培养基I中培养，追踪成纤维细胞样细胞的出现。(2)结果和结论
在肿瘤间充质中观察到来自人的成纤维细胞(图11)。将培养前已确认90%左右为人细胞的细胞用实施例I中使用的培养基I培养，确认成纤维细胞的出现。(图12)。[实施例7]可以发现对抗癌药显示抗性的形态学特征结构
(I)来自NOG确立癌细胞株的抗癌药抗性细胞的检出
将高分化型腺癌和中分化型腺癌移植至各3例NOG小鼠中后7天、10天、14天，共三次腹腔内给予100 mg/kg 5-氟尿卩密唳(5-FU,Mayne Pharma),在最后给予的第二天(移植后15天)采集肿瘤团块。按照与上述同样的方法将其制备HE染色标本，与由给予了溶剂的对象组(3例)制备的标本进行病理组织学比较。(2)结果和结论
如表2和图13所示，与对象组比较，在高分化型腺癌中，高度分化的管腔结构部减少，可显著观察到管腔结构不明确的低分化腺管。在中分化腺癌中，出芽图像减少，呈现以低分化腺管为主体的组织图像。由以上结果显示，在高分化型腺癌中，通过生长活跃的上皮样生长过程形成的管腔结构部、以及中分化型腺癌的浸润生长过程中可见的出芽部对抗癌药为感受性，低分化的腺管对抗癌药为抗性。如上所述，可见到显示抗癌药抗性的特征性的细胞群·组织结构，由此，可以认为显示可以通过本模型研究它们被选择的过程、长时间药物处置中获得抗性的过程、以及抗癌药治疗后的复发过程等。因此显示，使用本模型，则可以进行参与这些过程的因素的探索、或者以其为靶的药物的探索和筛选。[表2]给予5-FU后在各株中观察到的特征结构
权利要求
1.非人动物模型，该非人动物模型通过将把人肿瘤组织移植到严重免疫缺陷NOD/SCID/ Y (c)(裸)(NOG)小鼠中确立的NOG确立癌细胞株移植到属于相同或不同种的非人动物中而得到。
2.权利要求I的非人动物模型，其特征在于该非人动物模型再现人类癌症组织的等级结构和癌症进展过程。
3.权利要求I的非人动物模型，其特征在于该非人动物模型可以发现具备再现人类癌症组织的等级结构和癌症进展过程的性质的特有的癌症干细胞，研究其生物学特性。
4.权利要求I的非人动物模型，其特征在于该非人动物模型可在人类癌症组织的等级结构的再现过程中发现癌细胞通过完全上皮间充质转化(完全EMT)转化为形成肿瘤间充质的成纤维细胞的过程。
5.非人动物模型，该非人动物模型可通过对权利要求1-4中任一项的非人动物模型给予抗癌药，以癌细胞的等级结构、其癌症进展过程、其生物学特性、或其显示的完全上皮间充质转化(完全EMT)的变化作为指标进行评价，来研究抗癌药抗性的成因。
6.权利要求1-4中任一项的非人动物模型，其特征在于上述人肿瘤组织是来自结肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌或胰腺癌的肿瘤组织。
7.抗癌药靶的探索方法，其特征在于在移植了NOG确立癌细胞株的非人动物模型或NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系中，以癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性为指标进行评价。
8.权利要求7的抗癌药靶的探索方法，其特征在于该方法包含下述(1)-(4)的步骤 (1)将NOG确立癌细胞株移植到非人动物中，由此制备非人动物模型的步骤； (2)采集显示NOG确立癌细胞株的同一细胞株各区域的癌症进展过程中特征性地观察到的组织结构、或其生物学特性的组织块的步骤； (3)对于(2)中采集的组织块研究DNA、RNA和蛋白质表达的步骤；以及 (4)对依赖于组织块中的癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性变化的基因·蛋白质进行鉴定的步骤。
9.权利要求7的抗癌药靶的探索方法，其特征在于该方法包含下述(1)-(3)的步骤 (1)在体外条件下培养NOG确立癌细胞株，再现各癌症进展过程的特征结构、或其生物学特性的步骤； (2)对再现了特征结构的培养细胞的DNA、RNA和蛋白质表达进行研究的步骤；以及 (3)对依赖于培养细胞中的癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性变化的基因·蛋白质进行鉴定的步骤。
10.抗癌药的筛选方法，其特征在于在移植了NOG确立癌细胞株的非人动物模型或NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系中，以癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性作为指标进行评价。
11.权利要求10的抗癌药的筛选方法，其特征在于该筛选方法包含下述(1)-(5)的步骤 (I)将NOG确立癌细胞株移植到非人动物中，由此制备非人动物模型的步骤；(2)将受检物质给予(I)的非人动物模型的步骤； (3)采集显示NOG确立癌细胞株的同一细胞株各区域的癌症进展过程中特征性地观察到的组织结构、或其生物学特性的组织块的步骤； (4)观察组织块中癌细胞等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及 (5)对被受检物质抑制的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程或其生物学特性进行鉴定的步骤。
12.权利要求10的抗癌药的筛选方法，其特征在于该筛选方法包含下述(1)-(4)的步骤 (1)在体外条件下培养NOG确立癌细胞株，再现各癌症进展过程的特征结构、或其生物学特性的步骤； (2)用受检物质对(I)的培养细胞进行处理的步骤； (3)观察培养细胞中的癌细胞的等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及 (4)对被受检物质抑制的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程、或其生物学特性进行鉴定的步骤。
13.权利要求10的抗癌药的筛选方法，其特征在于该筛选方法包含下述(1)-(5)的步骤 (1)将NOG确立癌细胞株移植到非人动物中，由此制备非人动物模型的步骤； (2)将受检物质给予(I)的非人动物模型的步骤； (3)采集显示NOG确立癌细胞株的同一细胞株各区域的癌症进展过程中特征性地观察到的组织结构、或其生物学特性的组织块的步骤； (4)观察组织块中癌细胞等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及 (5)对抑制特定的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程、或其生物学特性的受检物质进行鉴定的步骤。
14.权利要求10的抗癌药的筛选方法，其特征在于该筛选方法包含下述(1)-(4)的步骤 (1)在体外条件下培养NOG确立癌细胞株，再现各癌症进展过程的特征结构、或其生物学特性的步骤； (2)用受检物质对(I)的培养细胞进行处理的步骤； (3)观察培养细胞中的癌细胞的等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及 (4)对抑制特定的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程、或其生物学特性的受检物质进行鉴定的步骤。
15.用于治疗或预防人类癌症疾病的药物的评价方法，其特征在于在移植了NOG确立癌细胞株的非人动物模型或NOG确立癌细胞株的体外条件下的培养体系中，以癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性为指标进行评价。
16.权利要求15的药物的评价方法，其特征在于该评价方法包含下述(1)-(4)的步骤 (1)将NOG确立癌细胞株移植到非人动物中，由此制备非人动物模型的步骤； (2)将受检物质给予(I)的非人动物模型的步骤； (3)采集显示NOG确立癌细胞株的同一细胞株各区域的癌症进展过程中特征性地观察到的组织结构、或其生物学特性的组织块的步骤； (4)观察组织块中癌细胞等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及 (5)对被受检物质抑制的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程、或其生物学特性进行鉴定的步骤。
17.权利要求15的用于治疗或预防人类癌症疾病的药物的评价方法，其特征在于该评价方法包含下述(1)-(4)的步骤 (1)在体外条件下培养NOG确立癌细胞株，再现各癌症进展过程的特征结构、或其生物学特性的步骤； (2)用受检物质对(I)的培养细胞进行处理的步骤； (3)观察培养细胞中的癌细胞的等级结构随时间的变化、癌症进展过程、或其生物学特性的步骤；以及 (4)对被受检物质抑制的癌细胞的等级结构形成、癌症进展过程、或其生物学特性进行鉴定的步骤。
18.使用移植了NOG确立癌细胞株的非人动物或NOG确立癌细胞株作为再现癌细胞的等级结构、癌症进展过程、或其生物学特性的癌症模型动物或细胞株的方法。
全文摘要
本发明的课题在于提供癌症病态非人动物模型及其利用方法，其特征在于可以再现人类癌症组织的等级结构、癌症进展过程或其生物学特性。本发明人为了解决上述课题，首先将NOG确立癌细胞株移植至NOG小鼠中，形态学观察其组织构建。结果证实，该非人动物模型保有与人类癌症疾病类似的病态(癌细胞的等级结构、癌症进展过程或其生物学特性)。即，本发明人成功地制备了保有与人类癌症疾病更为类似的病态的非人动物模型、或显示与人类癌症疾病更为类似的细胞形态的体外条件下的NOG确立癌细胞株培养体系。
文档编号C12N5/10GK102821600SQ20108006476
公开日2012年12月12日 申请日期2010年12月24日 优先权日2009年12月25日
发明者铃木雅实, 松原亨一, 加藤淳彦, 加藤千惠, 小林慎太, 陈玉昭, 山崎雅辉 申请人:药物研究私人有限公司, 中外制药株式会社, 株式会社实验动物中央研究所