一种核酸适配体及其筛选方法、在检测前列腺癌细胞株中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种核酸适配体，其序列包含序列1、序列2、序列3中任意一条序列所示的DNA片段。本发明的核酸适配体还可以是各种同源性较高的类似序列或由本发明序列得到的衍生物。本发明还公开了该核酸适配体的筛选方法，先合成随机单链DNA文库和引物，再SELEX筛选，PCR扩增文库，制备DNA单链文库，最后经重复筛选、阴性筛选和多轮筛选得到核酸适配体。本发明的核酸适配体及其衍生物可在识别前列腺癌细胞株PC-3或者制备检测前列腺癌的试剂盒、分子探针、靶向介质中应用，以及在设计和制备治疗前列腺癌药物中应用。本发明的核酸适配体具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记等优点。
【专利说明】一种核酸适配体及其筛选方法、在检测前列腺癌细胞株中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种核酸适配体及其筛选和应用，尤其涉及一种可用于检测前列腺癌细胞的核酸适配体及其筛选方法和应用。
【背景技术】[0002]前列腺癌(prostate cancer, PCa)是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤之一,死亡率仅次于肺癌。近年来，随着人口老龄化比例的上升和饮食结构的改变，我国PCa的发病率呈现明显的上升趋势，国内研究报告显示上海地区PCa发病率已跃居男性泌尿系肿瘤首位。由于前列腺癌起病隐匿，大多数前列腺癌得到确诊时，已经是进展期或晚期，目前在临床上对发展到此阶段的前列腺癌采取内分泌治疗，尽管内分泌治疗起初对大部分病人有效，但无法完全抑制癌细胞，病人会最终进展为激素非依赖型前列腺癌(hormone-refractory prostate cancer,HRPC),并且癌细胞发生转移。但是临床发现早期局限性前列腺癌手术根治效果好，国外文献报道5年生存率为99 %，10年生存率为95 %。因此，如果可以早期准确评估前列腺癌是否发生转移及侵袭，转移的部位和大小，侵袭的范围和程度，对于临床医生合理选择手术及治疗方案有着重大的意义。转移性HRPC治疗非常棘手，成为前列腺癌的主要死因。目前就前列腺癌晚期患者而言，治疗手段有限，效果较差，其原因在于药物用量高，毒副作用大，而解决办法除了开发新的药物外，靶向治疗成为了最主要的方法。此外，对于前列腺癌根治术后生化复发的病人，目前缺乏有效的靶向诊断措施，难以判断肿瘤复发的部位和位置，使临床医生选择合理的治疗方案非常困难。目前，缺乏高度特异性的靶向介质，是制约前列腺癌的靶向诊断和治疗发展的瓶颈。
[0003]核酸适配体，是与抗体功能类似的单链寡核苷酸分子。可特异性识别包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞等多种靶标，其亲和力与抗体相当甚至高于抗体。而且。适配体分子小，不携带遗传信息，无免疫原型，化学性质稳定，合成方便且批次差异小等优点是抗体无法取代的。因此核酸适配体在生物检测、疾病的诊断和靶向治疗方面具有广阔的前景。
【发明内容】
[0004]为了克服现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种具有高度特异性、无免疫原性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的可用于检测前列腺癌细胞株PC-3的核酸适配体及其衍生物，还相应提供所述核酸适配体的筛选方法和应用。
[0005]为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种核酸适配体，该核酸适配体的核苷酸序列包含以下序列1、序列2、序列3中任意一条序列所示的DNA片段:
[0006]序列1:
[0007]5，-ACGCTCGGATGCCACTACAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGCTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；[0008]序列2:
[0009]5’ -TGCCACTACAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGC-3’ ；
[0010]序列3:
[0011 ] 5 ’ -TGCCACTAAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGC-3，。 [0012]作为对上述技术方案的改进，可选择地，上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
[0013]作为对上述技术方案的改进，可选择地，前述核酸适配体的核苷酸序列上连接有荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶标记。
[0014]以上不论是经部分取代或者经过修饰后的核苷酸序列，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可用于检测前列腺癌。
[0015]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种:
[0016](I)与前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60%以上(例如可将前述核酸适配体序列删除或增加部分互补的核苷酸);
[0017](2)与前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；
[0018](3)与前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。
[0019]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种核酸适配体衍生物，所述衍生物是前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是前述所有技术方案中所述核酸适配体改造成的相应肽核酸。
[0020]以上不论是衍生出的核酸适配体还是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构性质和功能，即都可用于检测前列腺癌。
[0021]另一方面，本发明还提供了一种如前述核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤:
[0022]( I)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物:
[0023]随机核酸文库:
[0024]5-ACGCTCGGATGCCACTACAG- (45N)-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3，
[0025]5，引物:5，-Fam-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，；
[0026]3，引物:5，-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，；
[0027](2)核酸适配体筛选:将上述随机核酸文库与PC-3细胞株细胞孵育；孵育完成后，收集PC-3细胞株细胞；加热变性分离结合在PC-3细胞株细胞的适配体，即为筛选所得的核酸适配体一级文库；
[0028](3)阴性筛选:将步骤(2)所得到的一级文库与非靶细胞孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清，即排除掉非特异性结合的核酸序列，得到富集的与靶细胞特异性结合的适配体组文库；
[0029](4)分别鉴定步骤(3)所得到的适配体组各条序列的选择性、亲和力，最终得到核酸适配体。
[0030]作为对上述技术方案的改进，可选择地，本发明还提供了一种如前述核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤:
[0031](I)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物:
[0032]随机核酸文库:[0033]5’-ACGCTCGGATGCCACTACAG- (45N)-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；
[0034]5，引物:5，-Fam-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，；
[0035]3，引物:5，-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，；
[0036](2)核酸适配体初级筛选:将上述随机核酸文库与PC-3细胞株细胞孵育；孵育完成后，收集PC-3细胞株细胞并洗涤；加热变性分离结合在PC-3细胞株细胞的适配体，即为筛选所得的核酸适配体一级文库；
[0037](3)PCR扩增一级文库:将步骤(2)中筛选得到的一级文库进行常规PCR扩增，得到扩增产物；
[0038](4)制备DNA单链文库:用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记步骤(3)所得到的扩增产物；然后利用洗脱液使双链DNA变性解链，收集标记的DNA单链文库；
[0039](5)反筛:将步骤(4)所得到的DNA单链文库与非靶细胞孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清，即排除掉非特异性结合的核酸序列，得到与靶细胞特异性结合的适配体组文库；
[0040](6)正筛:将步骤(5)所得到含有特异性适体组文库的上清与靶细胞孵育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲 和力适配体组，PCR扩增后得到富集的与靶细胞特异性结合的适配体组文库；
[0041 ] (7)核酸适配体循环筛选:以所述步骤(6)所得的富集适配体组文库取代步骤(3)所得到的扩增产物，并重复步骤(4)~(6)的筛选过程，直到得到的适配体组文库的亲和力选择性不再上升；
[0042](8)克隆测序步骤(7)所得到的适配体组文库，分别鉴定各条序列的选择性、亲和力，最终得到核酸适配体。
[0043]作为对上述技术方案的进一步改进，可选择地，本发明还提供了一种核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤:
[0044](I)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物:
[0045]随机核酸文库:
[0046]5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG- (45N)-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3，；
[0047]5’ 引物:5’ -Fam-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’ ；
[0048]3，引物:5，-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，；
[0049](2)核酸适配体初级筛选:将上述随机核酸文库与PC-3细胞株细胞孵育；孵育完成后，收集PC-3细胞株细胞并洗涤；加热变性分离结合在PC-3细胞株细胞的适配体，即为筛选所得的核酸适配体一级文库；
[0050](3)PCR扩增一级文库:将步骤(2)中筛选得到的一级文库进行常规PCR扩增，得到扩增产物；
[0051](4)制备DNA单链文库:用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记步骤(3)所得到的扩增产物；然后利用洗脱液使双链DNA变性解链，收集标记的DNA单链文库；
[0052](5)反筛:将步骤(4)所得到的DNA单链文库与非靶细胞孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清，即排除掉非特异性结合的核酸序列，得到与靶细胞特异性结合的适配体组文库；
[0053](6)正筛:将步骤(5)所得到含有特异性适体组的上清与靶细胞孵育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲和力适体组；
[0054](7) PCR扩增适配体组文库:将步骤(6)中筛选得到的适配体组文库进行常规PCR扩增，得到扩增产物；
[0055](8)制备适配体组单链文库:用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记步骤(7)所得到的扩增产物；然后利用洗脱液使双链DNA变性解链，收集标记的适配体组单链文库；
[0056](9)核酸适配体循环筛选:用所述步骤(8 )所得的适配体组单链文库替代步骤(4 )所得到的DNA单链文库，并重复步骤(5)~(8)的筛选过程，直到得到的适配体组文库的亲和力选择性不再上升；
[0057](10)克隆测序步骤(9)所得到的适配体组文库，分别鉴定各条序列的选择性、亲和力，最终得到核酸适配体。
[0058]第三方面，本发明还提供了一种前述核酸适配体或者如核酸适配体衍生物在制备检测前列腺癌试剂盒、分子探针或靶向介质中的应用。
[0059]第四方面，本发明还提供了一种前述核酸适配体或者核酸适配体衍生物在设计和制备治疗前列腺癌药物中的用途。
[0060]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明通过筛选得到的核酸适配体具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且序列稳定，易于保存；便于标记(不需要标记的二抗)等。采用本发明的核酸适配体进行前列腺癌细胞的检测时，操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适配体的合成成本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好。
[0061]本发明的可识别前列腺癌细胞株PC-3的核酸适配体均能特异性且高亲和力的识别前列腺癌细胞株PC-3，且结合能力强。利用本发明的核酸适配体可从分子角度对肿瘤的危险性进行分层；其对肿瘤转移灶的特异性识别、结合，对靶标的鉴定，可为转移灶的诊断和治疗提供很好的手段，这对于前列腺癌的早期检测具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0062]图1为本发明实施例筛选过程中适配体文库的富集过程:峰形代表PC-3细胞与异硫氰酸荧光素(FITC)标记文库和第I轮、5轮、10轮、15轮筛选产物结合的情况。
[0063]图2为本发明实施例中序列2载阿霉素适配体对不同细胞系的抑制作用结果。
[0064]图3为本发明实施例中序列2适配体与靶细胞及非靶细胞结合能力的流式检测结
果O
[0065]图4为本发明实施例中序列2适配体与靶细胞及部分非靶细胞结合能力的Confocal 图像。
[0066]图5为本发明实施例中序列2和序列3适配体与靶细胞结合的拟合曲线及解离常数(Kd)。
[0067]图6为本发明实施例中序列2适配体与前列腺增生组织(BPH)、前列腺癌染色荧光强度差异比较。
【具体实施方式】
[0068]以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定于本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买所得到的。
[0069]细胞来源:本实验所用所有细胞均来自中科院上海细胞库和协和医学院细胞库。
[0070]本发明利用核酸适配体的体外筛选技术SELEX技术，以前列腺癌细胞株PC-3为正筛靶标，以多种正常细胞株或其他癌细胞株为反筛靶标，从体外合成的随机寡聚DNA文库中筛选出与所述前列腺癌细胞株PC-3特异结合的核酸适配体。
[0071]本发明中，所述的核酸适配体序列可选自天然存在或人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。
[0072]本发明中，所述的核酸适配体序列含有与所述特征序列的核苷酸的全部都相同的序列。[0073]本发明中，可以对核酸适配体进行修饰或改造，得到所述核酸适配体的衍生物，所述核酸适配体的衍生物可为:
[0074]a)将所述核酸适配体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物。
[0075]b)将所述核酸适配体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物。
[0076]c)将所述核酸适配体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物。
[0077]d)将核酸适配体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物。
[0078]e)将上述核酸适配体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、酶标记等物质后，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物。
[0079]本发明所述序列的靶标在与正常前列腺组织不表达，而在癌组织中有较高表达。本发明实施例中的靶标是前列腺癌细胞株PC-3。
[0080]实施例1:前列腺癌细胞特异性核酸适配体的筛选
[0081]1.随机核酸文库的设计与合成
[0082]设计合成两端包含20个核苷酸(引物)，中间包括45个核苷酸随机序列的核酸序列文库如下:
[0083]5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG- (45N)-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3，。
[0084]2.Cell-SELEX筛选获得核酸适配体
[0085]2.1孵育:用结合缓冲溶液(PBS，含0.45%的葡萄糖，5mM MgCl2,0.lmg/mL鲱鱼精DNA)溶解上述的随机核酸文库，95°C恒温振荡5min，迅速放入冰中；然后与已经培养和预处理好的前列腺癌细胞株PC-3在冰上孵育I小时。
[0086]2.2解离:孵育完成后倒出孵育培养瓶内的液体，用洗涤缓冲液(PBS，含0.45%的葡萄糖，5mM MgCl2)洗涤孵育培养瓶中的细胞；用ImL无菌水刮取孵育培养瓶内细胞，置于EP管中沸水浴加热lOmin，加热变性分离结合在PC-3细胞表面的适配体；12000rmp离心取上清，即为筛选所得PC-3细胞的特异核酸适配体文库。
[0087]3.进行PCR扩增文库
[0088]取100 μ L筛选所得的PC-3细胞特异核酸适配体文库进行常规PCR扩增，扩增引物为 5 ' Fam-ACGCTCGGATGCCACTACAG3 '，5 ' Bi0-GTCACCAGCACGTCCATGAG3 ';扩增条件为:94°C 3min,94°C 30sec,58.5°C 30sec，72°C 30sec，经合适循环轮数，72°C 3min ;第一轮筛选后需将全部所得的PC-3细胞特异核酸适体文库预扩增10个循环，再进行本步骤的扩增，得到扩增产物，用生物素标记扩增产物。
[0089]4.制备DNA单链文库
[0090]将链霉亲和素葡聚糖微球60 μ L输入带有滤膜的200 μ L枪头，制成微量洗脱柱，150 μ L PBS洗涤两次，将步骤3中PCR扩增所得的双链DNA完全加压过柱，通过双链DNA上的生物素与琼脂糖微球上的链霉亲和素的亲和作用将双链DNA充分捕获到琼脂糖微球表面；PBS洗涤两次，然后加入200mM NaOH溶液100 μ L解离双链DNA，使标记FITC的单链随洗脱液流出并收集完全；除盐柱用IOmL无菌水洗涤后，加入碱变性后收集得到的洗脱液，自然滴完。加入ImL无菌水，收集滴下的溶液，此即为DNA单链文库。
[0091]5.反筛
[0092]将步骤4筛选得到的DNA单链文库溶解、恒温振荡后与经预处理后的非靶细胞(如人肝癌细胞SMMC-7721)在冰上孵育I小时，孵育完成后收集细胞孵育后的上清，弃去与非靶细胞结合的核酸序列。
[0093]6.正筛
[0094]用步骤5所得到的上清液替代步骤2中的随机核酸文库，并重复步骤2、3、4的操作，得到PC-3细胞的特异 核酸适配体单链文库。
[0095]7.多轮筛选
[0096]将步骤6所得到的特异核酸适配体单链文库替代步骤4筛选得到的DNA单链文库，继续重复进行上述步骤5~6的操作过程，每次操作均以前一次操作中得到的与靶细胞特异结合的核酸序列为起始核酸文库，直到得到的适配体组文库的亲和力选择性不再上升。
[0097]所述筛选方法中，可每一轮筛选逐步增加筛选压力，以增进筛选核酸适配体的富集程度。所述增加筛选压力可以线性减少核酸序列文库和靶细胞的孵育时间和相应的线性增加核酸序列文库与非靶细胞的孵育时间。
[0098]8.分析和鉴定多次筛选后得到的核酸适配体
[0099]将所得产物经克隆测序分析，对测序结果整理分析后，最终可得到富集度高的三条序列，这三条序列即为上述本实施例的可用于检测前列腺癌细胞株PC-3的核酸适配体。
[0100]序列1:
[0101]5， -ACGCTCGGATGCCACTACAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGCTCATGGACGTGCTGGTGAC-3，
[0102]序列2:
[0103]5’ -TGCCACTACAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGC-3’
[0104]序列3:
[0105]5’ -TGCCACTAAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGC-3’
[0106]将得到的核酸适配体在5’端标记荧光分子制成分子探针，分别取0nM、lnM、2nM、4nM、8nM、16nM、32nM、64nM、128nM、256nM的分子探针溶液，与5X IO5个PC-3细胞进行冰上孵育20min，然后用洗涤缓冲液洗涤两次，用流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度。如细胞能结合荧光标记的核酸适配体，则以荧光强度对探针浓度作图，用公式Y = BfflaxX/ (Kd+X)计算核酸适配体的平衡解离常数Kd。结果表明，核酸适配体的平衡解离常数均在纳摩尔范围内。
[0107]实施例2:检测细胞特异性
[0108]共选择了 12种细胞株进行特异性分析:其中前列腺癌细胞亚系三种，分别为PC-3、LNCap、DU-145、22RV-l ;永生化正常前列腺上皮细胞RWPE-1 ;肝癌细胞SMMC-7721 ;宫颈癌细胞HeLa，肺癌细胞A549、MCF-7 ;结肠癌亚细胞系LoVo ;白血病细胞Jurkat、K562。
[0109]每一种细胞株均进行以下步骤(1)和步骤(2)处理，重复三次。
[0110]1.通过细胞计数，分别取5X105个细胞分散于结合缓冲液中，然后加入标记的核酸适配体，终浓度0.25 μ Mo [0111]2.将细胞和核酸适配体的混合液在冰上孵育20分钟，离心洗涤两次后，利用流式细胞仪检测核酸适配体和上述不同细胞株细胞的结合情况。将细胞与FITC标记的随机文库孵育后做流式细胞仪检测，设定一荧光强度值大于95%的细胞荧光强度作为流式细胞仪背景荧光。以细胞与核酸适配体结合后荧光强度超过这一阈值的细胞百分数作为衡量核酸适配体与细胞结合能力的强弱(O:< 15%；+:15-30%；++:< 30-65%；+++:65-85%；++++:> 85%)。
[0112]不同细胞株细胞与核酸适配体结合的流式细胞仪测定结果如图3所示。不同细胞株细胞与核酸适配体结合结果见表1。
[0113]表1:序列2适配体对不同肿瘤细胞的亲和力
[0114]
【权利要求】
1.一种核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包含以下序列1、序列2、序列3中任意一条序列所示的DNA片段: 序列1:
5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGCTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ； 序列2:
5，-TGCCACTACAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGC-3，； 序列3:
5，-TGCCACTAAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGC-3，。
2.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于:所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
3.如权利要求1或2所述的核酸适配体，其特征在于:所述核酸适配体的核苷酸序列上连接有荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶标记。
4.一种核酸适配体，其特征在于:所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种: (O与权利要求1或2或3中所 述核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60%以上； (2)与权利要求1或2或3中所述核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列； (3)权利要求1或2或3中所述核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。
5.一种核酸适配体衍生物，其特征在于:所述衍生物是权利要求1或2或3中所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是权利要求1或2或3中所述核酸适配体改造成的相应肽核酸。
6.一种如权利要求1所述的核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤: (1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物: 随机核酸文库:
5-ACGCTCGGATGCCACTACAG- (45N)-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；
5’ 引物:5’ -Fam-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’ ； 3，引物:5，-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，； (2)核酸适配体筛选:将上述随机核酸文库与PC-3细胞株细胞孵育；孵育完成后，收集PC-3细胞株细胞；加热变性分离结合在PC-3细胞株细胞的适配体，即为筛选所得的核酸适配体一级文库； (3)阴性筛选:将步骤(2)所得到的一级文库与非靶细胞孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清，即排除掉非特异性结合的核酸序列，得到富集的与靶细胞特异性结合的适配体组文库； (4)分别鉴定步骤(3)所得到的适配体组文库各条序列的选择性、亲和力，最终得到核酸适配体。
7.—种如权利要求1所述的核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤: (I)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物: 随机核酸文库:
5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG- (45N)-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；5’ 引物:5’ -Fam-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’ ； 3，引物:5，-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，； (2)核酸适配体初级筛选:将上述随机核酸文库与PC-3细胞株细胞孵育；孵育完成后，收集PC-3细胞株细胞并洗涤；加热变性分离结合在PC-3细胞株细胞的适配体，即为筛选所得的核酸适配体一级文库； (3)PCR扩增一级文库:将步骤(2)中筛选得到的一级文库进行常规PCR扩增，得到扩增产物； (4)制备DNA单链文库:用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记步骤(3)所得到的扩增产物；然后利用洗脱液使双链DNA变性解链，收集标记的DNA单链文库； (5)反筛:将步骤(4)所得到的DNA单链文库与非靶细胞孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清，即排除掉非特异性结合的核酸序列，得到与靶细胞特异性结合的适配体组文库； (6)正筛:将步骤(5)所得到含有特异性适体组文库的上清与靶细胞孵育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲和力适配体组，PCR扩增后得到富集的与靶细胞特异性结合的适配体组文库； (7)核酸适配体循环筛选:以所述步骤(6)所得的富集适配体组文库取代步骤(3)所得到的扩增产物，并重复步骤(4)~(6)的筛选过程，直到得到的适配体组文库的亲和力选择性不再上升； (8)克隆测序步骤(7)所得到的适配体组文库，分别鉴定各条序列的选择性、亲和力，最终得到核酸适配体。
8.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于: (1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物: 随机核酸文库:
5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG- (45N)-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；
5’ 引物:5’ -Fam-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’ ； 3，引物:5，-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，； (2)核酸适配体初级筛选:将上述随机核酸文库与PC-3细胞株细胞孵育；孵育完成后，收集PC-3细胞株细胞并洗涤；加热变性分离结合在PC-3细胞株细胞的适配体，即为筛选所得的核酸适配体一级文库； (3)PCR扩增一级文库:将步骤(2)中筛选得到的一级文库进行常规PCR扩增，得到扩增产物； (4)制备DNA单链文库:用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记步骤(3)所得到的扩增产物；然后利用洗脱液使双链DNA变性解链，收集标记的DNA单链文库； (5)反筛:将步骤(4)所得到的DNA单链文库与非靶细胞孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清，即排除掉非特异性结合的核酸序列，得到与靶细胞特异性结合的适配体组文库； (6)正筛:将步骤(5)所得到含有特异性适体组的上清与靶细胞孵育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲和力适体组； (7)PCR扩增适配体 组文库:将步骤(6)中筛选得到的适配体组文库进行常规PCR扩增，得到扩增产物； (8)制备适配体组单链文库:用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记步骤(7)所得到的扩增产物；然后利用洗脱液使双链DNA变性解链，收集标记的适配体组单链文库； (9)核酸适配体循环筛选:用所述步骤(8)所得的适配体组单链文库替代步骤(4)所得到的DNA单链文库，并重复步骤(5)~(8)的筛选过程，直到得到的适配体组文库的亲和力选择性不再上升； (10)克隆测序步骤(9)所得到的适配体组文库，分别鉴定各条序列的选择性、亲和力，最终得到核酸适配体。
9.一种如权利要求1~4中任一项所述的核酸适配体或者如权利要求5所述的核酸适配体衍生物在制备检测前列腺癌的试剂盒、分子探针或靶向介质中的应用。
10.一种如权利要求1~4中任一项所述的核酸适配体或者如权利要求5所述的核酸适配体衍生物在设计和制备治疗前列腺癌药物中的用途。
【文档编号】C12N15/10GK103642810SQ201310590626
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】高新, 上官棣华, 罗云, 邴涛, 王元元 申请人:中山大学附属第三医院, 中国科学院化学研究所