脊柱高转移人肺腺癌细胞株及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种脊柱高转移人肺腺癌细胞株A549L6，该细胞株已于2013年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC?No：C201346。本发明还公开了所述脊柱高转移人肺腺癌细胞株的制备方法及应用。本发明脊柱高转移人肺腺癌细胞株的脊柱转移率高，可广泛应用于肺腺癌骨转移研究模型、以及在研究肺腺癌转移机制和筛选及制备抗转移药物中的应用。
【专利说明】脊柱高转移人肺腺癌细胞株及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤生物学【技术领域】和微生物动物细胞系【技术领域】，具体涉及一种脊柱高转移人肺腺癌细胞株及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002]癌症是当前威胁人类健康的头号杀手，据世界卫生组织不完全统计，全世界每年死于癌症的患者达七百余万人。肺癌是目前全世界发病率和死亡率最高的癌症之一。美国每年大约有170000人死于肺癌，占整个癌症死亡总数的30% [I]。随着近年来经济的高速增长，我国肺癌的发病率开始成倍增加，每年约有40万人被确诊患有肺癌，发病率高达61.4 / 10万,成为世界上肺癌患者最多的国家。预计到2025年,我国每年仅死于肺癌的人数将接近100万人。
[0003]与其他恶性肿瘤一样，肺癌的转移是造成治疗失败和患者死亡的首要原因[2]。由于肺癌早期症状不明显且病情进展速度很快，至就诊时约有40%的患者已出现远处转移
[3]。骨是肺癌最为常见的转移部位之一，约30-40%的进展期肺癌出现骨转移[3]。
[0004]脊柱是肺癌最为常见的骨转移部位之一，约占骨转移的50% [4]。肺癌脊柱转移常导致骨痛、高钙血症、病理性骨折、脊髓压迫甚至瘫痪等并发症，严重影响患者的生存质量及生存期，加速患者的死亡进程，给患者及其家庭和社会带来沉重负担[5、6]。尽管临床上采用规范的外科切除、放化疗、双磷酸盐、免疫治疗等综合治疗，但肺癌脊柱转移的中位生存期仍徘徊于半年左右，成为医学界亟待解决的一大难题。
[0005]近年来，生物医学领域取得了突飞猛进的发展，但对肺癌脊柱转移发生、发展机制仍然了解甚少，缺乏相关研究。其主要原因在于缺乏可靠的肺癌脊柱转移动物模型。因此，有必要建立一种符合临床特征、可复制、可实时追踪监测、稳定可靠的肺癌脊柱转移动物模型。对癌症脊柱转移的分子机制、临床诊断及治疗必将会有极大的促进作用，为进一步找到新的药物靶标和开发出相应的治疗药物提供研究工具，将给肺癌及骨转移的治疗带来更广阔的前景。
[0006]A549细胞株（ATCC号CCL-185)，1972年由Giard等采用一位58岁的男性白人的肺癌组织经体外培养而建立，是使用最为广泛的肺腺癌细胞株之一 [7]，本发明采用ATCC来源的A549细胞株作为源细胞构建肺癌脊柱转移模型。
[0007]与本发明有关的【背景技术】包括以下参考文献。
[0008][ I ] D e I a Cruz CS, Tanoue LT, Matthay RA. Lung cancer ：epidemiology, etiology, and prevention. Clin Chest Med. 2011Dec ；32 (4) :605-44.
[0009][2]Pantel K, Alix-Panabieres C. Circulating tumour cells in cancerpatients !challenges and perspectives. Trends Mol Med. 2010Sep ； 16(9) :398-406.Epub2010Jul29。
[0010][3] McErlean A, Ginsberg MS. Epidemiology of lung cancer. SeminRoentgenol[J], 2011Jul ；46(3) :173-7.[0011 ] [4]Tsuya A,Kurata T,Tamura K,Fukuoka Μ. Skeletal metastases in non-smallcell lung cancer ：a retrospective study. Lung Cancer. 2007Aug ；57 (2) :229-32
[0012][5]Coleman RE. Skeletal complications of malignancy. Cancer1997 ；80 ：1588-94.
[0013][6]肖建如.对脊柱转移癌外科治疗策略再认识[J].中国脊柱脊髓杂志，2011，21 (7) :531-532.
[0014][7]Giard DJ,Aaronson SA,Todaro GJ,et al ：In vitro cultivation of humantumors ：establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. J NatlCancer Inst51 :1417-1423，1973
[0015][8]Kang Y, Siegel PM, Shu ff, etal. A multigenic program mediating breastcancer metastasis to bone.Cancer Cell. 2003Jun ；3(6) :537-49.
【发明内容】
[0016]本发明公开了一种脊柱高转移人肺腺癌细胞株及其构建方法和应用。
[0017]本发明的目的之一是提供一种脊柱高转移人肺腺癌细胞株，该细胞株已于2013年4月25日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC)，保藏号为CCTCCNo ：C201346o
[0018]本发明以人肺腺癌细胞株A549细胞株（ATCC号CCL-185)作为源细胞，通过裸鼠活体筛选的方法，构建一株具有脊柱、脑等器官高转移能力的人肺腺癌细胞株，命名为A549L6。
[0019]检测脊柱高转移细胞株A549L6生物学特性所采用的检测方法同下述步骤B。裸鼠左心室注射A549L6细胞，并使用IVIS活体检测系统及X线、micro-CT, MRI等影像检测设备监测其转移性能，并使用HE病理切片确认,采用wound healing、transwell等体外实验检测其迁移特性，采用细胞增殖实验检测其在体外的增殖特性。
[0020]与源细胞株A549L0相比，本发明脊柱高转移人肺腺癌细胞株A549L6细胞株具有以下生物学特性：
[0021](1)经 wound healing 和 transwell 检测 AM9L6 细胞株，观测 36 小时,AM9L6 细胞的迁徙能力分别是源细胞A549L0的11. 5倍和22. 4倍；动物实验显示其脊柱转移率高达80% (8 / 10)，较源细胞A549L0的脊柱转移率（7.7%，I / 13)大幅提高。
[0022](2)A549L6细胞株裸鼠左心室注射后的远处器官转移率为100%，70%为多器官同时转移。骨转移率为90% (9 / 10)，脊柱转移率为80% (8 / 10)，四肢转移率为30%(3 / 10);脑转移率为60% (6 / 10)，其中，脊柱转移的中位时间为50天（40-106)。
[0023](3)本发明脊柱高转移人肺腺癌细胞株A549L6细胞株经荧光素酶标记，可通过活体成像仪设备例如IVIS活体实时监测肿瘤在体内的生长、转移情况，并早于X线检测设备
6.00 ±0.63天检测到脊柱转移信号。
[0024](4)Micro_CT、MRI均可成功检测A549L6脊柱转移病灶。所述细胞株转移后可经X线、micr0-CT、MRI检测脊柱转移灶，可经HE病理切片检测脊柱及脑转移灶。
[0025](5)A549L6转移至脊柱后，具有与人癌症脊柱转移后发生脊髓压迫相似的症状。按照病程的发展可将其依次分为五个明显的可观测的节点：尾巴拖地、脚背着地步态、扫地行走步态、瘫痪、死亡。其分别发生于活体成像系统发现脊柱转移灶后的1.43±1.72天、
3.71±2· 06 天、8. 29±2· 06 天、11. 57±3· 69 天、14. 29±3· 59 天。
[0026](6)A549L6转移至脊柱后，其体重显著下降，与左心室注射A549L6细胞时、尾巴拖地、脚背着地步态、扫地行走步态、瘫痪、死亡相对应的体重分别为17. 84±0. 83g、26. 20±1· 85g、24. 96±1· 52g、22. 78±1· 44g、21. 02±1· 72g、18. 76±1· 73g。
[0027]本发明所述细胞株的培养液、传代、冻存、复苏条件均与Α549相同，体外增殖能力与A549相似；A549L6的细胞形态与A549L0存在明显差异，A549L0与A549形态相似，大部分为透光性差的细胞克隆，只含有部分透光性强的细胞克隆，而A549L6(图13下）几乎均为透光性强的细胞克隆。
[0028]本发明的另一方面是提供所述脊柱高转移人肺腺癌细胞株A549L6的构建方法，包括如下步骤：
[0029](A)将人肺腺癌细胞株A549细胞接种于培养板，进行PGL4质粒转染，对转染后经G418筛选获得的细胞克隆进行荧光素酶活性检测，得到荧光素酶表达阳性的细胞克隆A549L0 ；
[0030](B)A549表达荧光素酶阳性细胞克隆A549L0悬液注射于裸鼠左心室；
[0031](C)筛选脊柱转移细胞株，选择脊柱转移灶骨质破坏最强且荧光最强的转移肿瘤细胞进行体外扩增培养；将培养得到的细胞按步骤（B)方法注射于裸鼠左心室，再按步骤
(C)进行体外扩增培养；重复三轮筛选；
[0032](D)将步骤（C)得到的荧光标记阳性的A549细胞进行单克隆挑选，体外扩增培养，得到本发明脊柱高转移人肺腺癌细胞细胞株A549L6。
[0033]具体步骤包括如下：
[0034]步骤A、突光素酶（Luciferase)标记人肺腺癌细胞株A549
[0035]将人肺腺癌细胞株A549 (ATCC号CCL-185)细胞根据1.0 X IO5/孔接种于24孔培养板，次日进行PGL4质粒（Promega Biotech Co. Ltd)转染；转染步骤及方法根据Lipofectamin2000试剂说明书进行;转染24h后换液,加入600ug / ml G418 (购自Merck公司)筛选三周，获得阳性细胞克隆；并对获得的克隆进行荧光素酶（Luciferase)荧光活性测定。
[0036]步骤B、左心室注射方法建立人肺腺癌裸鼠转移模型
[0037]参照Kang等构建肺癌骨转移模型建立的方法[8],将突光素酶（Luciferase)突光标记阳性的A549细胞（命名为A549L0)，调整为1.0X105 / IOOul的细胞悬液，取IOOul注射于裸鼠左心室，并使用IVIS活体成像系统及X线成像系统等监测肺腺癌脊柱转移情况。
[0038]步骤C、筛选脊柱转移细胞株
[0039]取脊柱转移灶骨质破坏最强且荧光最强的转移肿瘤细胞经体外培养、扩增，培养条件为DMEM加10% (V / V)胎牛血清，37°C，5% C02/95%空气，饱和湿度培养；将培养所得的细胞根据步骤B接种于裸鼠的循环系统，根据步骤C体外扩增，同法重复三轮筛选。
[0040]步骤D、单克隆挑选
[0041]将步骤C取出的荧光标记阳性的A549细胞进行单克隆挑选，体外扩增，建立细胞株，命名为A549L6，隔天换培养液，每三天传代一次，常规冻存、复苏，得到脊柱高转移人肺腺癌细胞株A549L6。[0042]本发明的另一方面是提供所述脊柱高转移人肺腺癌细胞株A549L6在制备人肺腺癌的脊柱转移动物模型的应用。前述脊柱高转移人肺腺癌细胞株A549L6的制备过程即为本发明在人肺腺癌的脊柱转移动物模型构建中的应用。本发明还提供了所述脊柱高转移人肺腺癌细胞株A549L6在肺癌骨转移机制研究中的应用、以及其在制备抗人肺腺癌药物的应用、以及其在筛选和评估抗人肺腺癌药物中的应用。
[0043]本发明脊柱高转移人肺腺癌细胞株A549L6具有脊柱转移率高的特点，是一种更为理想的肺腺癌骨转移研究模型，其在揭示肺腺癌的转移机制和抗转移药物筛选的应用中将有着广阔的前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]本发明脊柱高转移人肺腺癌细胞系A549L6，已于2013年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，中国，武汉，武汉大学），保藏号为CCTCC No :C201346。
[0045]图I表示A549L0和A549L6的荧光表达。经IVIS活体成像系统检测，A549L0和A549L6均稳定表达荧光，经多轮筛选后，A549L6的荧光表达值显著高于A549L0。
[0046]图2表示肺癌脊柱转移的活体检测结果。活体检测结果显示100%小鼠发生远处器官转移，且多为多处器官同时转移，80%的小鼠发生脊柱转移，60%发生脑转移。
[0047]图3表示X线成像系统检测A549L6发生脊柱转移的X线片图像。
[0048]图4表示micro-CT检测A549L6发生脊柱转移的CT成像表现及三维重建图像。
[0049]图5表示A549L6发生 脊柱转移的MRI图像。
[0050]图6表示A549L6脊柱转移灶组织学纵切面切片HE病理切片染色图。
[0051]图7表示A549L6脊柱转移灶组织学横切面切片HE病理切片染色图。
[0052]图8表示A549L6脊柱转移发生脊髓压迫症状示意图，随着病情发展依次发生尾巴拖地、脚背着地步态、扫地行走步态、瘫痪、死亡等可易于观察的节点事件。
[0053]图9表示A549L6脊柱转移发生脊髓压迫症状示意图，随着病情发展依次发生尾巴拖地、脚背着地步态、扫地行走步态、瘫痪、死亡等可易于观察的节点事件，随着病情发展，其体重也随之发生显著变化。
[0054]图10表示wound healing实验比较A549L6与A549L0的细胞迁移能力。左为示意图，右为统计图。
[0055]图11表示Transwell实验比较A549L6与A549L0的细胞迁移能力。左为示意图，右为统计图。
[0056]图12表示A549L6与A549L0及A549在体外的增殖能力相似。
[0057]图13表示A549L6与A549L0、A549的细胞形态上有着明显差异，A549L6几乎均为透光性强的细胞克隆，而A549L0、A549均只含有部分透光性强的细胞克隆。
【具体实施方式】
[0058]结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书及其等同物为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及说明之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。以下结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。
[0059]实施例I :脊柱高转移人肺腺癌细胞株A549L6的构建
[0060]将人肺腺癌细胞株A549细胞株（ATCC号CCL-185)细胞根据1.0X IO5 /孔接种于24孔培养板,次日进行P6L4质粒（Promega Biotech Co. Ltd)转染；转染步骤及方法根据Lipofectamin2000试剂说明书进行；转染24h后换液，加入600ug / ml G418(购自德国merck公司)筛选三周，获得阳性细胞克隆；并对获得的克隆进行荧光素酶（Luciferase)荧光活性测定。
[0061]将人肺腺癌细胞株A549细胞悬液O. Iml (含IxlO5个细胞）注射于裸鼠左心室，并使用IVIS活体成像系统及X线成像系统监测肺腺癌脊柱转移情况。裸鼠购自（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），品系为nu / nu裸鼠，雄性，4-6周龄，饲养于SPF级环境中。
[0062]细胞通过左心室注射的方法接种于裸鼠血液循环后，解剖实验动物，取脊柱转移灶骨质破坏最强且荧光最强的转移肿瘤细胞经体外培养、扩增，培养液为DMEM(gibico)加10% (V / V)胎牛血清(Hyclone,Utah,USA),37°C,5% CO2 / 95%空气，饱和湿度培养。
[0063]将培养所得的细胞根据上述步骤接种于裸鼠的循环系统，根据本步骤体外扩增，同法重复三轮筛选。
[0064]将上述步骤取出的荧光标记阳性的A549细胞进行单克隆挑选，体外扩增，建立细胞株，命名为A549L6，隔天换培养液，每三天传代一次，常规冻存、复苏，得到脊柱高转移人肺腺癌细胞株A549L6。
`[0065]实施例2 :本发明脊柱高转移人肺腺癌细胞株A549L6的特性检测
[0066]按常规系列实验对实施例I构建得到的本发明细胞株A549L6进行检测：
[0067]I、将细胞常规胰酶消化离心后，密度调整为IxlO6 / ml，取IOOul /孔加入黑色96孔板，依次进行倍比稀释，每个梯度设2个复孔。每孔加入300 μ g / ml的荧光素酶底物IOOul, 10 分钟后置于 IVIS 活体成像系统拍摄（Caliper Life Sciences IVIS Lumina II，型号：DS934N-BV-286)，曝光时间为5分钟，经检测显示A549L0及A549L6均稳定表达荧光素酶。如图I左所示，经过多轮活体筛选后，当细胞数为IxlO6时，A549L6荧光表达值大约为A549L0的5. 512倍；当细胞数稀释为5xl04时A549L0几乎无肉眼可见的荧光，而A549L6直到低于I. 25xl04时才无肉眼可见的荧光。图I右所示为A549L6在各细胞密度条件下的荧光表达值曲线。由图I可见，经IVIS活体成像系统检测，A549L0和A549L6均稳定表达荧光，经多轮筛选后，A549L6的荧光表达值显著高于A549L0。
[0068]2、取IxlO5细胞（O. Iml)注射于裸鼠左心室，于注射后25天开始进行肺癌脊柱转移的活体检测。方法为：腹腔注射注射荧光素酶底物200ul /只（D-luciferin，potassiumsalt, 15mg / ml, sigma), 10 分钟后置于 IVIS 活体成像系统拍摄(Caliper Life SciencesIVIS Luminall，型号：DS934N-BV-286)，曝光时间为5分钟。如图2所示，本发明细胞株A549L6的远处转移能力较A549L0 (远处器官转移率为7.7%)大幅提高，总体远处转移率为100%，多为骨（骨转移率为90%)和脑（脑转移率为60%)同时转移，且多为多处器官同时转移。其中，脊柱转移率为80%，四肢转移率为30%，发生脊柱转移的中位天数为50天(40-106 天)ο[0069]3、经小动物 X 线检测设备（Kodak DXS4000Pro System,型号：Micro Focus X-RayImaging Source, 35KVP,仪器使用的参数为 Bringing ：4XBringing, f-stop :2. 51, Fov ：59. 4mm, Resolution ：220ppi, CCD temperature :-29°C,曝光时间为 I 分钟)监测，于 IVIS检测到本发明细胞株A549L6脊柱转移灶信号后的6. 00±0. 63天，可利用X线检测设备检测到小鼠脊柱的转移灶。如图3所示，图3上为IVIS活体成像图，图3下位相对应的X线成像图。
[0070]4、使用小动物 CT (Skyscanl076,40Kv, 250uA, Bruker microCT NV, Antwerp,Belgium)和 3. OT MRI (Magnetom Verio, Siemens, Germany)可有效检测 A549L6 脊柱转移灶的破坏情况。如图4所示，图4左上表示小鼠的椎体被肿瘤明显破坏，右上为正常对照；图4下为相对应的三维重建图。图5右分别为脊柱转移灶的冠状面、矢状面、横断面T2加权MRI成像，左侧分别为相应的正常对照。
[0071]5、经HE病理切片发现A549L6脊柱转移特征与肺癌脊柱转移的临床现象相似，如图6所示，图6下表示肿瘤细胞浸润整个椎体，但不侵犯椎间盘，图6上为正常对照。如图7所示，图7下表示整个椎体均为肿瘤细胞浸润，图7上为正常对照。
[0072]6、通过每天观察小鼠的脊髓压迫症状发现：随着病程的发展也可出现与临床相似的脊髓压迫症状，随着病情发展依次发生尾巴拖地、脚背着地步态、扫地行走步态、瘫痪、死亡等可易于观察的节点事件（图8所示），分别发生于活体成像系统发现脊柱转移灶后的
I.43±1· 72 天、3. 71±2· 06 天、8. 29±2· 06 天、11. 57±3· 69 天、14. 29±3· 59 天。 [0073]7、经过对小鼠体重的监测发现：A549L6转移至脊柱后，其体重显著下降，与左心室注射A549L6细胞时、尾巴拖地、脚背着地步态、扫地行走步态、瘫痪、死亡相对应的体重分别为 17. 84±0· 83g、26. 20±1· 85g、24. 96±1· 52g、22. 78±1· 44g、21. 02±1· 72g、18.76±1.73g。（如图 9 所示）。
[0074]8、经wound healing(将肿瘤细胞接种于12孔板,待肿瘤细胞90%聚合时,饥饿12小时，使用无菌的移液器枪头沿着培养板中心划痕，然后在不同的时间节点观察细胞的迁移情况），27小时和36小时后A549L6细胞的迁徙能力分别是源细胞的5. 5倍和11. 5倍，如图10所不,其中，左图为不意图,右图为统计图。
[0075]9、经transwell (将肿瘤细胞重悬于无血清的DMEM，浓度调节为5万/ 200ul，取200ul接种于穿梭小室的上层，在下面的小室中填入含10%胎牛血清的DMEM培养基600ul。在不同的时间点使用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，并在显微镜下拍照统计迁移的肿瘤细胞）检测，36小时后A549L6细胞的迁徙能力是源细胞的22. 4倍，如图11所示，其中，左图为不意图，右图为统计图。
[0076]10、A549L6的培养液、传代、冻存、复苏条件均与A549相同，体外增殖实验（将细胞以IxlO4 /孔的密度接种于6孔板，分别在接种后的第2、4、6、8、10天将细胞消化、计数）显示其增殖能力与A549L0及A549相似，如图12所示，表明A549L6与A549L0及A549在体外的增殖能力相似。A549L6的细胞形态与A549L0存在明显差异，图13表明A549L6与A549L0、A549的细胞形态上有着明显差异，A549L6几乎均为透光性强的细胞克隆，而A549L0、A549均只含有部分透光性强的细胞克隆。如图13上和图13中表示A549L0与A549相似均只含部分透光性强的细胞克隆和透光性差的细胞克隆，而A549L6(图13下）几乎均为透光性强的细胞克隆。
【权利要求】
1.一种脊柱高转移人肺腺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No :C201346，保藏时间为2013年4月25日。
2.如权利要求1所述的脊柱高转移人肺腺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株带有荧光素酶标记，可通过IVIS活体成像系统活体实时监测肿瘤的全身转移情况，并早于小动物X线设备6. 00±0. 63天检测到脊柱转移信号。
3.如权利要求1所述的脊柱高转移人肺腺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株的骨转移率为90 %，脊柱转移率为80 %，脑转移率为60 %，脊柱发生脊柱转移的中位天数为50天。
4.如权利要求1所述的脊柱高转移人肺腺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株转移后可经X线、micix)-CT、MRI检测脊柱转移灶，可经HE病理切片检测脊柱及脑转移灶。
5.如权利要求1所述的脊柱高转移人肺腺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株经woundhealing和transwell检测，36小时后A549L6细胞的迁徙能力分别是源细胞的11. 5倍和22. 4 倍。
6.如权利要求1所述的脊柱高转移人肺腺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株转移至脊柱后，具有与人肺癌脊柱转移后发生脊髓压迫相似的症状；按照病程的发展可将其依次分为五个明显可观测的节点：尾巴拖地、脚背着地步态、扫地行走步态、瘫痪、死亡；其分别发生于IVIS活体成像系统发现脊柱转移灶后的I. 43±1. 72天、3. 71 ±2. 06天、8. 29±2. 06天、11. 57±3· 69 天、14. 29±3· 59 天。
7.如权利要求1所述的脊柱高转移人肺腺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株A549L6转移至脊柱后，其体重显著下降，与左心室注射A549L6细胞时、尾巴拖地、脚背着地步态、扫地行走步态、瘫痪、死亡相对应的体重分别为17. 84±0. 83g、26. 20±1.85g、24. 96±1· 52g、22. 78±1· 44g、21. 02±1· 72g、18. 76±1· 73g。
8.如权利要求1所述的脊柱高转移人肺腺癌细胞株的制备方法，其特征在于， (A)将人肺腺癌细胞株A549细胞接种于培养板，进行PGL4质粒转染，对转染后经G418筛选获得的细胞克隆进行荧光素酶活性检测，得到荧光素酶表达阳性的细胞克隆A549L0 ； (B)A549阳性细胞克隆A549L0悬液注射于裸鼠左心室； (C)筛选脊柱转移细胞株，选择脊柱转移灶骨质破坏最强且荧光最强的转移肿瘤细胞进行体外扩增培养；将培养得到的细胞按步骤（B)方法注射于裸鼠左心室，再按步骤（C)进行体外扩增培养；重复三轮筛选； (D)将步骤（C)得到的荧光标记阳性A549细胞进行单克隆挑选，体外扩增培养，得到所述脊柱高转移人肺腺癌细胞细胞株A549L6。
9.如权利要求1所述的脊柱高转移人肺腺癌细胞株的应用，其特征在于，所述细胞株在制备人肺腺癌的脊柱转移动物模型中的应用。
10.如权利要求1所述的脊柱高转移人肺腺癌细胞株的应用，其特征在于，所述细胞株在肺癌骨转移机制中以及在制备抗人肺腺癌药物中的应用。
【文档编号】C12N15/85GK103756968SQ201310590483
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】罗剑, 肖建如, 刘明耀, 蔡小攀 申请人:华东师范大学, 中国人民解放军第二军医大学