专利名称：一种小叶丁素的提纯方法
技术领域：
本发明属于植物提取技术领域，涉及一种从小叶香茶菜干燥叶中提取纯化小叶丁素的方法。
背景技术：
小叶香茶菜J1SotZo/ parvifolia (Batalin) Hara系唇形科香茶菜属植物,主要分布于我国四川省。1990年郭跃伟等首次从小叶香茶菜的叶中分离得到小叶丁素，并经过初步药理研究表明，小叶丁素对人肝癌细胞株QGY-7703有一定抑制作用。郭跃伟等采用的方法是用95%乙醇提取，用生药量2%的活性炭脱色，常法处理得醇浸膏，乙酸乙酯萃取多次，回收，硅胶柱分离，氯仿-丙酮梯度洗脱分离得到小叶丁素。该方法样品损失较大、得率低、成本高。 小叶丁素(Parvifolinoic acid),分子式为C42H76O3,分子量为629. 07，为白色粉末状，mp. 90-91. 50C ο
发明内容
本发明的目的是提供一种小叶丁素的提纯方法，该方法提率高、成本低，适合规模
化生产。本发明的目的是通过以下技术方案实现的
一种小叶丁素的提纯方法，其特征在于包括以下步骤
(O酶解取原料小叶香茶菜干燥叶，经粉碎处理，用酶溶液浸泡，水浴酶解2-5小时，并充分搅拌；
(2)提取将上述酶解液过滤，取滤渣用5-6倍药材重量的乙醇水溶液提取2-3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏；
(3)富集将浸膏过大孔吸附树脂柱，醇水洗脱，收集洗脱液；
(4)纯化将上述洗脱液减压回收乙醇，用氯仿萃取，萃取液浓缩后上硅胶柱(硅胶粒度为100-200目)，乙酸乙酯-乙醇梯度洗脱，TLC跟踪监测，收集小叶丁素流分，减压浓缩，冷冻干燥得产品。步骤(I)中所述酶选自纤维素酶、蜗牛酶、葡聚糖酶或果胶酶中的一种，酶用量为
I.8-3. 5%。，pH 为 3. 8-4. 6，酶解温度为 40-50°C。步骤(2)中所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比浓度为80-90%。步骤(3)中所述大孔树脂选自AB-8、XAD-16、XDA-8或HZ806型中的一种。步骤(3)中所述醇水洗脱为3-4BV10%-20%乙醇水溶液一4_6BV70%-90%乙醇水溶液，乙醇溶液浓度均为体积百分比浓度。步骤(4)中所述梯度洗脱为乙酸乙酯-乙醇按体积比由高到低，依次为10:1、5:1、3:1。本发明采用酶解提取，有效成分更容易溶出，提高了提取率；采用大孔树脂分离，不同浓度乙醇洗脱，除去杂质；使用硅胶柱，乙酸乙酯-乙醇梯度柱层析，可得到较纯净的小叶丁素，产品纯度较高。
具体实施例方式 实施例I:
取小叶香茶菜干燥叶粉碎过60目筛，称取5kg，加15LpH4. 2的纤维素酶水溶液(每公斤生药加入2. 2g纤维素酶)进行浸泡半小时，然后在42°C下水浴酶解3小时，并充分搅拌，过滤，取滤渣用5倍药材重量的80%乙醇加热回流提取I小时，提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏，将浸膏加热水分散，加入XAD-16大孔吸附树脂柱，先取3BV10%乙 醇洗脱杂质，再取4BV70%乙醇洗脱有效成分，减压回收乙醇得粗提物，用等倍体积量的氯仿萃取，连续萃取4次，合并萃取液，萃取液浓缩后上硅胶柱层析(硅胶粒度为100-200目)，用乙酸乙酯-乙醇按10:1、5:1、3:1梯度洗脱，TLC跟踪监测，收集小叶丁素流分，减压浓缩，冷冻干燥得O. 67g小叶丁素，含量92. 6%。实施例2:
取小叶香茶菜干燥叶粉碎过60目筛，称取5kg，加15LpH4. 2的纤维素酶水溶液(每公斤生药加入3. Ig纤维素酶)进行浸泡半小时，然后在44°C下水浴酶解2小时，并充分搅拌，过滤，取滤渣用6倍药材重量的90%乙醇加热回流提取I小时，提取2次，合并提取液，减压浓缩得浸膏，将浸膏加热水分散，加入AB-8大孔吸附树脂柱，先取4BV20%乙醇洗脱杂质，再取4BV90%乙醇洗脱有效成分，减压回收乙醇得粗提物，用等倍体积量的氯仿萃取，连续萃取4次，合并萃取液，萃取液浓缩后上硅胶柱层析(硅胶粒度为100-200目)，用乙酸乙酯-乙醇按10: 1、5: 1、3:1梯度洗脱，TLC跟踪监测，收集小叶丁素流分，减压浓缩，冷冻干燥得O. 63g小叶丁素，含量94. 8%。实施例3
取小叶香茶菜干燥叶粉碎过60目筛，称取5kg，加15LpH4. 2的纤维素酶水溶液(每公斤生药加入I. Sg纤维素酶和果胶酶混合复合酶，纤维素酶和果胶酶的质量比为1:1)进行浸泡半小时，然后在50°C下水浴酶解5小时，并充分搅拌，过滤，取滤渣用5倍药材重量的90%乙醇加热回流提取I小时，提取2次，合并提取液，减压浓缩得浸膏，将浸膏加热水分散，力口入XDA-8大孔吸附树脂柱，先取3BV10%乙醇洗脱杂质，再取6BV90%乙醇洗脱有效成分，减压回收乙醇得粗提物，用等倍体积量的氯仿萃取，连续萃取4次，合并萃取液，萃取液浓缩后上硅胶柱层析(硅胶粒度为100-200目)，用乙酸乙酯-乙醇按10:1、5:1、3:1梯度洗脱，TLC跟踪监测，收集小叶丁素流分，减压浓缩，冷冻干燥得O. 58g小叶丁素，含量95. 6%。实施例4:
取小叶香茶菜干燥叶粉碎过60目筛，称取5kg，加15LpH4. 2的纤维素酶水溶液(每公斤生药加入3. 5g果胶酶)进行浸泡半小时，然后在45°C下水浴酶解4小时，并充分搅拌，过滤，取滤渣用6倍药材重量的80%乙醇加热回流提取I小时，提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏，将浸膏加热水分散，加入HZ806大孔吸附树脂柱，先取4BV10%乙醇洗脱杂质，再取6BV80%乙醇洗脱有效成分，减压回收乙醇得粗提物，用等倍体积量的氯仿萃取，连续萃取4次，合并萃取液，萃取液浓缩后上硅胶柱层析(硅胶粒度为100-200目)，用乙酸乙酯-乙醇按10:1、5:1、3:1梯度洗脱，TLC跟踪监测，收集小叶丁素流分，减压浓缩，冷冻干燥得O. 64g小叶丁素，含量94. 4%。
实施例5:
取小叶香茶菜干燥叶粉碎过60目筛，称取5kg，加15LpH4. 2的纤维素酶水溶液(每公斤生药加入2. 6g葡聚糖酶和果胶酶的混合复合酶，葡聚糖酶和果胶酶的质量比为1:3)进行浸泡半小时，然后在48°C下水浴酶解2小时，并充分搅拌，过滤，取滤渣用5倍药材重量的85%乙醇加热回流提取I小时，提取2次，合并提取液，减压浓缩得浸膏，将浸膏加热水分散，加入AB-8大孔吸附树脂柱，先取3BV20%乙醇洗脱杂质，再取5BV80%乙醇洗脱有效成分，减压回收乙醇得粗提物，用等倍体积量的氯仿萃取，连续萃取4次，合并萃取液，萃取液浓缩后上硅胶柱层析(硅胶粒度为100-200目)，用乙酸乙酯-乙醇按10:1、5:1、3:1梯度洗脱，TLC跟踪监测，收集小叶丁素流分，减压浓缩，冷冻干燥得O. 69g小叶丁素，含量93. 5%。实施例6:
取小叶香茶菜干燥叶粉碎过60目筛，称取5kg，加15LpH4. 2的纤维素酶水溶液(每公斤生药加入3. 3g蜗牛酶)进行浸泡半小时，然后在40°C下水浴酶解5小时，并充分搅拌，过滤， 取滤渣用6倍药材重量的85%乙醇加热回流提取I小时，提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏，将浸膏加热水分散，加入HZ806大孔吸附树脂柱，先取4BV20%乙醇洗脱杂质，再取5BV70%乙醇洗脱有效成分，减压回收乙醇得粗提物，用等倍体积量的氯仿萃取，连续萃取4次，合并萃取液，萃取液浓缩后上硅胶柱层析(硅胶粒度为100-200目)，用乙酸乙酯-乙醇按10:1、5:1、3:1梯度洗脱，TLC跟踪监测，收集小叶丁素流分，减压浓缩，冷冻干燥得O. 61g小叶丁素，含量94. 2%。
权利要求
1.一种小叶丁素的提纯方法，其特征在于包括以下步骤 (1)酶解取原料小叶香茶菜干燥叶，经粉碎处理，用酶溶液浸泡，水浴酶解2-5小时，并充分搅拌； (2)提取将上述酶解液过滤，取滤渣用5-6倍药材重量的乙醇水溶液提取2-3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏； (3)富集将浸膏过大孔吸附树脂柱，醇水洗脱，收集洗脱液； (4)纯化将上述洗脱液减压回收乙醇，用氯仿萃取，萃取液浓缩后上硅胶柱(硅胶粒度为100-200目)，乙酸乙酯-乙醇梯度洗脱，TLC跟踪监测，收集小叶丁素流分，减压浓缩，冷冻干燥得产品。
2.根据权利要求I所述的提纯方法，其特征在于步骤(I)中所述酶选自纤维素酶、蜗牛酶、葡聚糖酶或果胶酶中的一种，酶用量为1.8-3. 5%。，pH为3. 8-4. 6，酶解温度为40-50。。。
3.根据权利要求I所述的提纯方法，其特征在于步骤(2)中所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比浓度为80-90%。
4.根据权利要求I所述的提纯方法，其特征在于步骤(3)中所述大孔树脂选自AB-8、XAD-16、XDA-8 或 HZ806 型中的一种。
5.根据权利要求I所述的提纯方法，其特征在于步骤(3)中所述醇水洗脱为3-4BV10%-20%乙醇水溶液一4-6BV70%-90%乙醇水溶液，乙醇溶液浓度均为体积百分比浓度。
6.根据权利要求I所述的提纯方法，其特征在于步骤(4)中所述梯度洗脱为乙酸乙酯-乙醇按体积比由高到低，依次为10:1、5:1、3:1。
全文摘要
本发明公开了一种小叶丁素的提纯方法，方法包括(1)取原料小叶香茶菜干燥叶，经粉碎处理，用酶溶液浸泡，水浴酶解并充分搅拌；(2)将酶解液过滤，取滤渣用5-10倍量的乙醇水溶液提取2-3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏；(3)将浸膏过大孔吸附树脂柱，醇水混合溶液洗脱，收集洗脱液；(4)将洗脱液减压回收乙醇，氯仿萃取，萃取液浓缩后上硅胶柱，乙酸乙酯-乙醇梯度洗脱，TLC跟踪监测，收集小叶丁素流分，减压浓缩，冷冻干燥即得产品。本发明操作简单、所得产品收率高、成本低，适合规模化生产。
文档编号C07C59/68GK102863329SQ201210363130
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者苏刘花 申请人:南京泽朗农业发展有限公司