专利名称：一种制备蜜茱萸宁的方法
技术领域：
本发明属于天然植物提取技术领域，涉及一种制备蜜茱萸宁的方法。
背景技术：
蜜茱萸宁(Meliternin)，又名蜜特宁、三出蜜茱萸宁，分子式为C2tlH18O8，分子量为386. 36，呈无色棱晶状，mp. 185. 5-186°C，不溶于水，略溶于醇和丙酮，溶于氯仿、苯和二氧六环。主要分布于芸香科(Rutaceae)植物三出蜜茱萸ieraaie树皮和三叶蜜茱展Melicope triphylla (Lam.)Merr.叶中。药理研究表明，蜜茱萸宁对子胶原诱导的血小板聚集有中等程度的抑制作用，其体外抑制浓度为100 μ g/mL，另外还具有杀鱼活性，其最小致死浓度MLC为10 μ g/mL。目前国内外尚未见提取分离纯化蜜茱萸宁的方法方面的专利或文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备蜜茱萸宁的方法，该方法操作简单、得率高、环境污染小、产品纯度高。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案
一种制备蜜茱萸宁的方法，其特征在于包括以下步骤
取三叶蜜茱萸叶组织破碎，采用乙醇溶液加热回流提取，提取液浓缩得浸膏，再按比例加入乙醇和硫酸铵双水相系统加热混匀，分为上下两相，取出富含黄酮的乙醇相，加乙酸乙酯、水和氯化钠，混合均匀，取上相减压浓缩，通过聚酰胺树脂，氯仿-乙醇混合溶液洗脱，洗脱液减压浓缩干燥，注入高速逆流色谱分离纯化，得到蜜茱萸宁。所述乙醇溶液回流提取中，乙醇体积百分比浓度为55-75%。所述双水相系统中，乙醇体积占浸膏和乙醇体积之和的为13_28%(V/V)，硫酸铵的加入量为15-20% (W/V)，分相温度为40-50°C，静置2-6小时。所述乙酸乙酯反萃取中，分相温度为25_33°C，静置时间为1-3小时。所述聚酰胺树脂柱层析，洗脱剂为氯仿-乙醇混合溶液，体积比为3:1。所述高速逆流色谱溶剂系统选用正己烷-氯仿-丙酮-水，体积比为(8-12)(10-15):(10-15)(6-10)o 所述高速逆流色谱溶剂系统选用正己烷-氯仿-丙酮-水，体积比为10:11:11:8。本发明的优点在于本发明利用双水相萃取富集有效成分，继而采用聚酰胺树脂和高速逆流色谱分离纯化，环境污染小、产品纯度高，既适合小型试验，也可放大产业化生产。
具体实施例方式 下面将结合具体实施方式
进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。实施例I :取三叶蜜茱萸叶组织破碎成粗粉，称取IOkg用60%乙醇加热回流提取2小时，过滤，将滤渣再用60%乙醇提取I次，提取I. 5小时，合并两次滤液，减压浓缩得浸膏，加入硫酸铵和乙醇双水相系统，加入的乙醇体积占浸膏和乙醇体积之和的为15%，加入的硫酸铵质量分数为15%，加热混合均匀，在45°C条件下放置4h，静置，分为上、下两相，取上相加乙酸乙酯、水和氯化钠，其中乙酸乙酯的质量分数为21%，氯化钠的质量分数为12%，余量为水，混合均匀，系统在28°C下静置lh，分相，取上相，减压浓缩得浸膏，将浓缩浸膏加入聚酰胺树脂柱，氯仿-乙醇(3:1)混合溶液进行洗脱，收集含有蜜茱萸宁的流分，减压回收试剂浓缩、干燥得粗品。取正己烷、氯仿、丙酮、水，按比例8:10:10:6混合，倒入分液漏斗分层后，取下相为固定相注入高速螺旋管，开启高速逆流色谱仪，调节转速至820r/min，取上相为流动相泵入，流速2ml/min，当流动相流出时，用上相溶解粗品，通过进样阀进样，通过检测器定时收集流分，低温结晶，滤出得白色结晶，经高效液相检测含量98. 3%。实施例2:
取三叶蜜茱萸叶组织破碎成粗粉，称取IOkg用55%乙醇加热回流提取2小时，过滤，将 滤渣再用55%乙醇提取2次，提取I小时，合并三次滤液，减压浓缩得浸膏，加入硫酸铵和乙醇双水相系统，加入的乙醇体积占浸膏和乙醇体积之和的为21%，加入的硫酸铵质量分数为20%，加热混合均匀，在42°C条件下放置3h，静置，分为上、下两相，取上相加乙酸乙酯、水和氯化钠，其中乙酸乙酯的质量分数为23%，氯化钠的质量分数为11%，余量为水，混合均匀，系统在25°C下静置2. 0h，分相，取上相，减压浓缩得浸膏，将浓缩浸膏加入聚酰胺树脂柱，氯仿-乙醇(3:1)混合溶液进行洗脱，收集含有蜜茱萸宁的流分，减压回收试剂浓缩、干燥得粗品。取正己烷、氯仿、丙酮、水，按比例10:11:11:8混合，倒入分液漏斗分层后，取下相为固定相注入高速螺旋管，开启高速逆流色谱仪，调节转速至820r/min，取上相为流动相泵入，流速2ml/min,当流动相流出时，用上相溶解粗品，通过进样阀进样，通过检测器定时收集流分，低温结晶，滤出得白色结晶，经高效液相检测含量99. 2%。实施例3:
取三叶蜜茱萸叶组织破碎成粗粉，称取IOkg用70%乙醇加热回流提取2小时，过滤，将滤渣再用70%乙醇提取I次，提取2小时，合并两次滤液，减压浓缩得浸膏，加入硫酸铵和乙醇双水相系统,加入的乙醇体积占浸膏和乙醇体积之和的为13%，加入的硫酸铵质量分数为18%，加热混合均匀，在40°C条件下放置5h，静置，分为上、下两相，取上相加乙酸乙酯、水和氯化钠，其中乙酸乙酯的质量分数为20%，氯化钠的质量分数为13%，余量为水，混合均匀，系统在33°C下静置3h，分相，取上相，减压浓缩得浸膏，将浓缩浸膏加入聚酰胺树脂柱，氯仿-乙醇(3:1)混合溶液进行洗脱，收集含有蜜茱萸宁的流分，减压回收试剂浓缩、干燥得粗品。取正己烷、氯仿、丙酮、水，按比例12:15:15:10混合，倒入分液漏斗分层后，取下相为固定相注入高速螺旋管，开启高速逆流色谱仪，调节转速至850r/min，取上相为流动相泵入，流速4ml/min,当流动相流出时,用上相溶解粗品，通过进样阀进样,通过检测器定时收集流分，低温结晶，滤出得白色结晶，经高效液相检测含量98. 6%。实施例4:
取三叶蜜茱萸叶组织破碎成粗粉，称取IOkg用75%乙醇加热回流提取I. 5小时，过滤，将滤渣再用75%乙醇提取2次，每次提取I. 5小时，合并三次滤液，减压浓缩得浸膏，加入硫酸铵和乙醇双水相系统，加入的乙醇体积占浸膏和乙醇体积之和的为28%，加入的硫酸铵质量分数为20%，加热混合均匀，在50°C条件下放置3h，静置，分为上、下两相，取上相加乙酸乙酯、水和氯化钠，其中乙酸乙酯的质量分数为25%，氯化钠的质量分数为10%，余量为水，混合均匀，系统在31°C下静置2. 5h，分相，取上相，减压浓缩得浸膏，将浓缩浸膏加入聚酰胺树脂柱，氯仿-乙醇(3:1)混合溶液进行洗脱，收集含有蜜茱萸宁的流分，减压回收试剂浓缩、干燥得粗品。取正己烷、氯仿、丙酮、水，按比例9:12:12:10混合，倒入分液漏斗分层后，取下相为固定相注入高速螺旋管，开启高速逆流色谱仪，调节转速至820r/min，取上相为流动相泵入，流速2. 5ml/min,当流动相流出时，用上相溶解粗品，通过进样阀进样，通过检测器定时收集流分，低温结晶，滤出得白色结晶，经高效液相检测含量98 . 2%。
权利要求
1.一种制备蜜茱萸宁的方法，其特征在于包括以下步骤取三叶蜜茱萸叶组织破碎，采用乙醇溶液加热回流提取，提取液浓缩得浸膏，再按比例加入乙醇和硫酸铵双水相系统加热混匀，分为上下两相，取出富含黄酮的乙醇相，加乙酸乙酯、水和氯化钠，混合均匀，取上相减压浓缩，通过聚酰胺树脂柱层析，氯仿-乙醇混合溶液洗脱，洗脱液减压浓缩干燥，注入高速逆流色谱分离纯化，得到蜜茱萸宁。
2.根据权利要求I所述的一种制备蜜茱萸宁的方法，其特征在于所述乙醇溶液回流提取中，乙醇体积百分比浓度为55-75%。
3.根据权利要求I所述的一种制备蜜茱萸宁的方法，其特征在于所述双水相系统中，乙醇体积占浸膏和乙醇体积之和的为13-28% (V/V)，硫酸铵的加入量为15-20% (W/V)，分相温度为40-50°C，静置2-6小时。
4.根据权利要求I所述的一种制备蜜茱萸宁的方法，其特征在于所述乙酸乙酯反萃取中 分相温度为25-33°C，静置时间为1-3小时。
5.根据权利要求I所述的一种制备蜜茱萸宁的方法，其特征在于所述聚酰胺树脂柱层析，洗脱剂为氯仿-乙醇混合溶液，体积比为3:1。
6.根据权利要求I所述的一种制备蜜茱萸宁的方法，其特征在于所述高速逆流色谱溶剂系统选用正己烷-氯仿-丙酮-水，体积比为(8-12) :(10-15) :(10-15) :(6_10)。
7.根据权利要求I所述的一种制备蜜茱萸宁的方法，其特征在于所述高速逆流色谱溶剂系统选用正己烧-氯仿_丙酮_水，体积比为10:11:11:8。
全文摘要
本发明公开了一种制备蜜茱萸宁的方法，方法是以三叶蜜茱萸叶为原料，采用热回流提取、双水相萃取、聚酰胺树脂柱层析及高速逆流色谱分离等步骤得到蜜茱萸宁。该方法操作简单、得率高、产品纯度高。
文档编号C07D407/04GK102875539SQ20121036308
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者苏刘花 申请人:南京泽朗农业发展有限公司