专利名称：一种制备高纯度硬毛红砂素b的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备高纯度硬毛红砂素B的方法，尤其涉及一种应用高速逆流色谱法从旌节花植物中分离制备硬毛红砂素B的方法。
背景技术：
硬毛红砂素B (Hirtellin B)是ー种鞣质类化合物，主要从柽柳科植物硬毛红砂Reaumuria hirtella Jaub. et Sp.的叶中分离得到，CAS登录号为135404-48-7,其分子式为C82H56O52，分子量为1873. 30，呈类白色无定形粉末状。药理研究表明，硬毛红砂素B具有抗肿瘤作用，10mg/kg时对荷S-180小鼠的延命率为114. 2%。目前对硬毛红砂素B的研究较少，尚无提取分离纯化硬毛红砂素B方法的专利或文献报道。高速逆流色谱技术(HSCCC)是ー种不需任何载体的液液分配分离技术，利用单向 流体动力学平衡原理，基于样品在旋转螺旋管内的相对移动而互不混溶的两相中分配系数的不同而实现分离，其分离效率和速度可以与HPLC相媲美。HSCCC分离效率高，产品纯度高，不存在载体对样品的吸附和污染，制备量大和溶剂消耗少，操作简单，能从极复杂的混合物中分离出特定的组分。它与一般色谱的分离方式不同，特别适用于制备级的分离，已被广泛应用于中药与天然产物的分离纯化过程中。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种制备高纯度硬毛红砂素B的方法。本发明是通过以下技术方案实现的
(1)取硬毛红砂叶粉碎，用体积百分比为50-80%的こ醇水溶液超声提取2-3次，提取液合并、减压回收こ醇得到浓缩液；
(2)浓缩液加入明胶溶液，离心，沉淀物用丙酮水溶液溶解，滤除明胶，得到初步纯化
液；
(3)初步纯化液采用硅胶柱层析，用氯仿-甲醇洗脱，收集流分浓缩干燥得到粗品；
(4)上述粗品采用高速逆流色谱法进行分离，甲基叔丁基醚-正丁醇-三氟こ酸-水为溶剂系统，根据检测器紫外光谱图进行收集，合并相同成分，得到硬毛红砂素B固体。步骤(I)中所述こ醇水溶液用量为5-10倍量(V/W)，超声频率为20-50KHZ，每次提取 O. 5-2h。步骤(2)中所述明胶溶液浓度为3-5%，丙酮水溶液浓度为55-80%。步骤(3)中所述氯仿-甲醇的体积比为5:1-1:2。步骤(4)中所述溶剂系统甲基叔丁基醚-正丁醇-三氟こ酸-水的体积比为(1-2) : (1-2) :0. 01:1，上相为固定相，下相为流动相。本发明的有益效果是
1、本发明方法生产周期短，提取率高，条件温和、安全；
2、本发明采用高速逆流色谱法，没有可逆吸附，样品无损失；3、本发明制备得到的硬毛红砂素B纯度高，可作为对照品使用。
具体实施例方式 下面将结合具体实施方式
进ー步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。实施例I :
取硬毛红砂叶10kg，粉碎，加100L的70%こ醇水溶液超声提取2次，每次提取I. 5h，超声频率为33KHz，过滤，合并提取液，减压回收こ醇得到浓缩液，加入浓度为3%明胶溶液，搅拌至不再产生沉淀，离心，沉淀物用60%丙酮水溶液溶解，滤除明胶，得到初步纯化液，浓缩后采用硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(3:1)洗脱，收集流分浓缩干燥得到粗品。将甲基叔丁基醚-正丁醇-三氟こ酸-水(1.5:1:0.01:1)组成的溶剂系统在分液漏斗中充分振荡后静置，分层，上相为固定相，下相为流动相，使进样阀处于进样状态，将固定相以10ml/min的 流速灌满逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使螺旋管柱顺时针方向旋转，当色谱仪转速为750r/min时，以流速为3. Oml/min泵入流动相,将粗提物用下相溶解,并通过进样阀进样，根据检测器紫外光谱图进行收集，合并相同成分，得到硬毛红砂素B単体4. 7mg，含量为98. 7%。实施例2:
取硬毛红砂叶10kg，粉碎，加75L的60%こ醇水溶液超声提取3次，每次提取I. Oh,超声频率为20KHz，过滤，合并提取液，减压回收こ醇得到浓缩液，加入浓度为3. 5%明胶溶液，搅拌至不再产生沉淀，离心，沉淀物用7%丙酮水溶液溶解，滤除明胶，得到初步纯化液，浓缩后采用硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(1:1)洗脱，收集流分浓缩干燥得到粗品。将甲基叔丁基醚-正丁醇-三氟こ酸-水(1:1:0.01:1)组成的溶剂系统在分液漏斗中充分振荡后静置，分层，上相为固定相，下相为流动相，使进样阀处于进样状态，将固定相以10ml/min的流速灌满逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使螺旋管柱顺时针方向旋转，当色谱仪转速为750r/min吋，以流速为3. Oml/min泵入流动相，将粗提物用下相溶解，并通过进样阀进样，根据检测器紫外光谱图进行收集，合并相同成分，得到硬毛红砂素B単体4. 4mg，含量为
98.3%。实施例3
取硬毛红砂叶10kg，粉碎，加80L的50%こ醇水溶液超声提取3次，每次提取2h，超声频率为25KHz，过滤，合并提取液，减压回收こ醇得到浓缩液，加入浓度为4%明胶溶液，搅拌至不再产生沉淀，离心，沉淀物用55%丙酮水溶液溶解，滤除明胶，得到初步纯化液，浓缩后采用硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(1:2)洗脱，收集流分浓缩干燥得到粗品。将甲基叔丁基醚-正丁醇-三氟こ酸-水(1:2:0.01:1)组成的溶剂系统在分液漏斗中充分振荡后静置，分层，上相为固定相，下相为流动相，使进样阀处于进样状态，将固定相以10ml/min的流速灌满逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使螺旋管柱顺时针方向旋转，当色谱仪转速为750r/min吋，以流速为3. Oml/min泵入流动相，将粗提物用下相溶解，并通过进样阀进样，根据检测器紫外光谱图进行收集，合并相同成分，得到硬毛红砂素B単体4. 2mg，含量为
99.1%。实施例4:
取硬毛红砂叶10kg，粉碎，加50L的80%こ醇水溶液超声提取2次，每次提取I. 5h，超声频率为38KHz，过滤，合并提取液，减压回收こ醇得到浓缩液，加入浓度为5%明胶溶液，搅拌至不再产生沉淀，离心，沉淀物用65%丙酮水溶液溶解，滤除明胶，得到初步纯化液，浓缩后采用硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(5:1)洗脱，收集流分浓缩干燥得到粗品。将甲基叔丁基醚-正丁醇-三氟こ酸-水(2:1:0.01:1)组成的溶剂系统在分液漏斗中充分振荡后静置，分层，上相为固定相，下相为流动相，使进样阀处于进样状态，将固定相以10ml/min的流速灌满逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使螺旋管柱顺时针方向旋转，当色谱仪转速为750r/min吋，以流速为3. Oml/min泵入流动相，将粗提物用下相溶解，并通过进样阀进样，根据检测器紫外光谱图进行收集，合并相同成分，得到硬毛红砂素B単体4. 5mg，含量为98. 4%。实施例5:
取硬毛红砂叶10kg，粉碎，加70L的75%こ醇水溶液超声提取2次，每次提取I. Oh,超声频率为50KHz，过滤，合并提取液，减压回收こ醇得到浓缩液，加入浓度为4. 5%明胶溶液，搅拌至不再产生沉淀，离心，沉淀物用80%丙酮水溶液溶解，滤除明胶，得到初步纯化液，浓 缩后采用硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(4:1)洗脱，收集流分浓缩干燥得到粗品。将甲基叔丁基醚-正丁醇-三氟こ酸-水(1:1.5:0.01:1)组成的溶剂系统在分液漏斗中充分振荡后静置，分层，上相为固定相，下相为流动相，使进样阀处于进样状态，将固定相以10ml/min的流速灌满逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使螺旋管柱顺时针方向旋转，当色谱仪转速为750r/min时，以流速为3. Oml/min泵入流动相,将粗提物用下相溶解,并通过进样阀进样，根据检测器紫外光谱图进行收集，合并相同成分，得到硬毛红砂素B単体4. Img,含量为98. 2%。实施例6:
取硬毛红砂叶10kg，粉碎，加60L的65%こ醇水溶液超声提取3次，每次提取O. 5h，超声频率为45KHz，过滤，合并提取液，减压回收こ醇得到浓缩液，加入浓度为3. 8%明胶溶液，搅拌至不再产生沉淀，离心，沉淀物用70%丙酮水溶液溶解，滤除明胶，得到初步纯化液，浓缩后采用硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(2:1)洗脱，收集流分浓缩干燥得到粗品。将甲基叔丁基醚-正丁醇-三氟こ酸-水(1:1.2:0.01:1)组成的溶剂系统在分液漏斗中充分振荡后静置，分层，上相为固定相，下相为流动相，使进样阀处于进样状态，将固定相以10ml/min的流速灌满逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使螺旋管柱顺时针方向旋转，当色谱仪转速为750r/min时，以流速为3. Oml/min泵入流动相,将粗提物用下相溶解,并通过进样阀进样，根据检测器紫外光谱图进行收集，合并相同成分，得到硬毛红砂素B単体4. 3mg,含量为98. 7%。
权利要求
1.一种制备高纯度硬毛红砂素B的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)取硬毛红砂叶粉碎，用体积百分比为50-80%的乙醇水溶液超声提取2-3次，提取液合并、减压回收乙醇得到浓缩液； (2)浓缩液加入明胶溶液，离心，沉淀物用丙酮水溶液溶解，滤除明胶，得到初步纯化液； (3)初步纯化液采用硅胶柱层析，用氯仿-甲醇洗脱，收集流分浓缩干燥得到粗品； (4)上述粗品采用高速逆流色谱法进行分离，甲基叔丁基醚-正丁醇-三氟乙酸-水为溶剂系统，根据检测器紫外光谱图进行收集，合并相同成分，得到硬毛红砂素B固体。
2.根据权利要求I中所述的一种制备高纯度硬毛红砂素B的方法，其特征在于步骤Cl)中所述乙醇水溶液用量为5-10倍量(V/W)，超声频率为20-50KHZ，每次提取O. 5_2h。
3.根据权利要求I中所述的一种制备高纯度硬毛红砂素B的方法，其特征在于步骤(2)中所述明胶溶液浓度为3-5%，丙酮水溶液浓度为55-80%。
4.根据权利要求I中所述的一种制备高纯度硬毛红砂素B的方法，其特征在于步骤(3)中所述氯仿-甲醇的体积比为5:1-1:2。
5.根据权利要求I中所述的一种制备高纯度硬毛红砂素B的方法，其特征在于步骤(4 )中所述溶剂系统甲基叔丁基醚-正丁醇-三氟乙酸-水的体积比为(I - 2 ):(1-2) : O. 01:1，上相为固定相，下相为流动相。
全文摘要
本发明涉及一种制备高纯度硬毛红砂素B的方法将硬毛红砂叶用醇溶液超声提取，提取液浓缩，加入明胶溶液，离心，沉淀物用丙酮水溶液溶解，滤除明胶，得到的初步纯化液采用硅胶柱层析，氯仿-甲醇洗脱，收集流分浓缩干燥得到粗品，高速逆流色谱分离纯化，得到硬毛红砂素B单体。本发明所得产品纯度高于98%。
文档编号C07H1/08GK102863481SQ201210363028
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者苏刘花 申请人:南京泽朗农业发展有限公司