专利名称：一种强化厌氧发酵制氢的方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵制氢领域，具体的说是一种强化厌氧发酵制氢的方法。
背景技术：
不断增加的能源需求和化石燃料储量枯竭之间的矛盾正在加剧，氢气作为一种清洁、高效、可再生的能源载体，是一个非常有前景的替代能源。在众多制取氢气的方法中厌氧发酵制氢因其应条件温和、设备简单而且可利用的原料来源广泛而被认为是一种具有广泛前景的制氢方法。然而，厌氧发酵产氢由于原料转化率低，产氢速率低，目前在制氢的成本上还不能与化学法制氢相抗衡。提高原料转化率和产氢速率以降低制氢成本是厌氧发酵制氣亟待关破的问题。厌氧发酵制氢中的产氢反应是可逆的氧化还原反应Η2^=±2ΙΓ+2ε , H2生
产速率同时受产氢速率和吸氢速率的影响。较低的胞内氢气分压有利于产氢反应向产氢方向进行。另外，胞内产生的H2要经过细胞膜释放到液体培养基，然后再扩散到上方的气相。因而减小氢气释放的阻力有利于降低胞内的氢气分压从而强化产氢。Mandal通过降低发酵体系中培养基上方的氢气分压的方式成功强化产氢。考虑到细胞膜的双磷脂层的流动所引起的孔径(不超过0. 5-1. Onm)与氢气分子的直径(近O. 3nm)相当，推测胞内产生的氢气经由细胞膜向胞外液体培养基释放的速度可能受到细胞膜孔径的影响。因此，我们推断改善细胞膜通透性可降低氢气由胞内向胞外释放的阻力，从而降低细胞内H2的压力，并最终提高产氢速率。
发明内容
本发明的目的在于筛选一种能有效改善细胞膜的通透性又不影响产氢微生物生长和代谢的一种试剂，探索该试剂的作为厌氧发酵制氢添加剂的浓度条件，最终实现累计
产氢量和产氢速率的强化。本发明为解决上述技术问题采用的技术方案为一种强化厌氧发酵制氢的方法，包含以下步骤按照体积比，在发酵容器中加入100份的培养基，并按照每升培养基中加入Img刃天青的比例加入刃天青,再加入5份质量浓度为O. 2"O. 6g/L的十六烧基三甲基溴化铵溶液，混合均匀后，在121°C的条件下灭菌15min，然后接种5份取自牛粪发酵后的液体，再向发酵容器和与之相连的碱洗瓶中通入无菌氮气直至发酵体系的颜色由粉色变为无色，然后密封无菌氮气通入口，在37°C恒温、155r/min的条件下震荡培养，发酵产生的气体通过通气管道进入装有浓度为2 4mol/L氢氧化钠溶液的碱洗瓶中，然后收集从碱洗瓶中溢出的气体即为发酵产生的氢气；
所述的培养基的组成为每升培养基中含有IOg的木糖、5g的蛋白胨、14g的磷酸氢二钾、2g的硫酸铵、6 g的磷酸二氢钾和O. 2 g的MgSO4 · 7H20，其余为蒸馏水，配制好的培养基在使用前在121°C的条件下灭菌15min。
本发明中，所述的加入刃天青的作用是用于观察培养基中的厌氧指标。本发明中，所述的牛粪发酵后的液体实际上为一种混和菌液。在培养基中添加一定浓度的十六烷基三甲基溴化铵，即CTAB，混合菌的生长代谢没有受到明显抑制作用，混合菌的细胞膜的通透性得到明显改善，CTAB对微生物的影响实验如下
一、CTAB对细胞膜通透性的影响
混合菌取自牛粪发酵的沼气罐，其细菌细胞密度为1.8^2. 2 ；
培养基配制每升培养基中含有1Og木糖、5g蛋白胨、14g磷酸氢二钾、2 g (NH4)2S04、6 g磷酸二氢钾和O. 2 g MgSO4 ·7Η20，其余为蒸馏水，配制好的培养基在使用前在121°C的条件下灭菌15min ；
细胞悬浮液制备混合菌群在培养基中厌氧培养24 h，离心取沉淀，然后用pH为7、100毫摩尔的磷酸钾缓冲液洗净，加入适量的缓冲液(600 nm下光密度值0D_等于3. 31)保存。CTAB对细胞膜通透性的影响:分别配制0，0. 1，O. 2，O. 3，O. 4，O. 6，O. 8，1. 2 g/L的CTAB溶液；取4mL细胞悬浮液和O. 2 mL CTAB溶液加入7mL的血清瓶中，在37°C条件下保持15min，然后离心取上清，在280nm下测定其吸光度值(A28tl)以估算蛋白质渗出量和细胞膜的通透性。为分析CTAB的作用时间对蛋白渗出量的影响，将细胞悬浮液和CTAB溶液在血清瓶中的作用时间延长为90min和135min重复上述实验。为排除CTAB在280nm的波长条件下有吸收而对检测造成影响，做不含细胞悬浮液的对照实验取一个血清瓶加入4mL的缓冲液和O. 2mL浓度分别为0，0. 1,0. 2,0. 3,0. 4，O. 6,0. 8，1. 2 g/L的CTAB溶液保持135 min检测其吸光度。实验结果如附图1所示CTAB在280nm条件下无吸收，实验检测到A28tl即为胞内渗出蛋白的吸光度；CTAB和细胞的作用时间为15min时随着CTAB浓度增加A28tl增加，表明CTAB可促进细胞内蛋白类物质的渗出；延长CTAB和细胞的作用时间对细胞渗出量的影响不大；从而，得出CTAB可促进混合菌细胞通透性的增加。二、CTAB对微生物生长的影响
发酵终端的生物量用终端发酵液在600nm的光密度值(0D_)表征。CTAB对微生物生长的影响如附图2所示，如下表所示CTAB的存在使得微生物在发酵的前12h生长缓慢，但12h之后微生物生长快速，在发酵终端时生物量与未加CTAB的生物量相当。有益效果本发明为生物发酵制氢领域开创一个崭新的思路，从降低细胞胞内氢气分压的原理出发，筛选出一种既能有效增加细胞膜的通透性又对微生物生长无明显抑制的表面活性剂CTAB作为添加剂，克服了目前生物厌氧发酵制氢的成本居高不下，产氢效率低下的问题，成功实现累计产氢量提高38%，最大产氢速率提高44%的效果。本发明操作简单，成本低廉，易于实现。
图1为不同浓度的CTAB对细胞膜通透性的影响；
图2为不同浓度的CTAB对微生物生长的影响；图3为实施例所用的实验装置；
图4为实施例I的实验结果对比 图5为实施例2的实验结果对比 图6为实施例3的实验结果对比图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。实施例I
500mL锥形瓶中作为批式反应器，在其中加入IOOmL的培养基、O. Img的刃天青，再加入5mL质量浓度为O. 2g/L的十六烷基三甲基溴化铵溶液，混合均匀后，在121°C的条件下灭菌15min，然后接种5mL取自牛粪发酵后的液体，再向锥形瓶和与之相连的碱洗瓶中通入无菌氮气直至发酵体系的颜色由粉色变为无色(通气时间约为lOmin)，然后密封无菌氮气通入口，在37°C恒温、155r/min的条件下摇瓶震荡培养，发酵产生的气体通过通气管道进入装有浓度为2mol/L氢氧化钠溶液的碱洗瓶中，然后收集从碱洗瓶中溢出的气体即为发酵产生的氢气；
所述的培养基的组成为每升培养基中含有IOg的木糖、5g的蛋白胨、14g的磷酸氢二钾、2g的硫酸铵、6 g的磷酸二氢钾和O. 2 g的MgSO4 · 7H20，其余为蒸馏水，配制好的培养基在使用前在121°C的条件下灭菌15min ；
所述的取自牛粪发酵后的液体，其细菌细胞密度为I. 8^2. 2。实验装置如附图3所示。采用气相色谱检测氢气含量，具体条件为Porapak Q不锈钢填充柱，柱温80°C，载气为氮气，流速为30 mL/min，进样室温度为80°C，检测室热导检测器(TCD)，检测室温度120 °C，桥电流 150 mA。产氢速率的计算方法修正的Gompertz方程能较好地描述间歇实验中微生物生长随时间的变化规律，其表达式为
权利要求
1.一种强化厌氧发酵制氢的方法，其特征在于，包含以下步骤按照体积比，在发酵容器中加入100份的培养基，并按照每升培养基中加入Img刃天青的比例加入刃天青，再加入5份质量浓度为O. 2^0. 6g/L的十六烷基三甲基溴化铵溶液，混合均匀后，在121°C的条件下灭菌15min，然后接种5份取自牛粪发酵后的液体，再向发酵容器和与之相连的碱洗瓶中通入无菌氮气直至发酵体系的颜色由粉色变为无色，然后密封无菌氮气通入口，在37°C恒温、155r/min的条件下震荡培养，发酵产生的气体通过通气管道进入装有浓度为2 4mol/L氢氧化钠溶液的碱洗瓶中，然后收集从碱洗瓶中溢出的气体即为发酵产生的氢气； 所述的培养基的组成为每升培养基中含有IOg的木糖、5g的蛋白胨、14g的磷酸氢二钾、2g的硫酸铵、6 g的磷酸二氢钾和O. 2 g的MgSO4 · 7H20，其余为蒸馏水，配制好的培养基在使用前在121°C的条件下灭菌15min。
全文摘要
一种强化厌氧发酵制氢的方法，在发酵容器中加入培养基刃天青和十六烷基三甲基溴化铵溶液，混合均匀后，灭菌然后接种取自牛粪发酵后的液体，再向发酵容器和与之相连的碱洗瓶中通入无菌氮气以置换空气，然后密封无菌氮气通入口恒温震荡培养，发酵产生的气体经过碱洗后收集起来得到氢气。本发明通过在发酵基质中添加十六烷基三甲基溴化铵，克服了目前生物厌氧发酵制氢的成本居高不下，产氢效率低下的问题，成功实现累计产氢量提高38%，最大产氢速率提高44%的效果。本发明操作简单，成本低廉，易于实现。
文档编号C12P3/00GK102876723SQ20111043119
公开日2013年1月16日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者任云利, 赵爽, 刘振, 王键吉, 尹卫平 申请人:河南科技大学