制备核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑条的方法

专利名称：制备核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑条的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑条(strip)的方法。更具体而言，本发明涉及一种制备核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑试纸条的方法，该方法包括将核苷酸探针与载体连接以制备结合物并通过真空转移将该结合物固定到多孔固体支撑上。
背景技术：
在确定疾病的遗传因素、治疗的恰当性、生物鉴定等中利用核苷酸诊断。通常，用于分析从细菌或细胞分离的核苷酸样品或者通过核苷酸聚合扩增该样品而获得的产物中的特定核苷酸序列的技术被用于证实核苷酸的存在，该技术采用具有与要被分析的部分核苷酸特异性连接的互补碱基序列的核苷酸片段(即，核苷酸探针)，这基于它们之间的确存在连接。目前使用的用于分析特定核苷酸序列的方法的实例包括通过将探针粘附到微孔板表面的特定核苷酸探针与要被分析的核苷酸的杂交，包括在膜上固定探针并向其加入扩增的核苷酸的特定核苷酸探针与核苷酸的杂交(逆向点/线印迹杂交)，以及包括在由如玻璃的材料制成的板上固定多种探针并向其加入扩增的核苷酸的核苷酸杂交(DNA芯片)等寸。为了制备用于核苷酸杂交的诊断条，需要一种用于在固体支撑上固定核苷酸探针的方法。具体地，物理吸附、紫外线(UV)照射和包括共价连接的化学连接是将核苷酸粘附到固体支撑上的最常用的方法(参考R Lutgarde等人，Applied EnvironmentalMicrobiology,62，300-303，1996)。物理吸附是在固体表面物理吸附生物分子的方法，其在体外诊断中引起了极大的关注。生物分子被吸附到固体相的机制并不清楚。实际上，可能涉及到生物分子与表面之间的相互作用。这种相互作用可能通过5个步骤发生，S卩，1)分子向表面移动，2)其吸附在表面，3)吸附分子的重排，4)吸附分子的潜在解吸附作用(latent desporption)，以及5)吸附分子离开表面的运动(参考W Norde，Advances in Colloid and InterfaceScience,25，267-340，1986)。该概要提示解吸附作用是潜在地固有的，但是，实际上，当分子足够大时，结合不可逆地发生(参考AW Adamson, “ The Solid-liquid Interface =Adsorption FromSolution " , in Physical chemistry of surfaces,5th ed. (Chichester, UK :ffiley,1990),421-459)。该行为的原因是，由于结合位点的数量随着分子量的增加而增加，因此尽管一个结合位点从表面解离，但其余的多个位点仍然保持结合状态。就此而言，有报道称核苷酸表现出与蛋白质相同的作用。尽管核苷酸的结合力比蛋白质的低，但大的核苷酸与膜结合良好。
但是，物理吸附存在的严重问题是固定在表面的核苷酸被重排并因此可能具有不适于与任何引入的碱基序列相互作用的构造。具有长的碱基序列的核苷酸不会遇到问题，但当核苷酸的碱基序列变短时，潜在活性的降低会成为严重的问题。当碱基没有保持能与溶液相互作用的游离形式并被固定在表面上时，由于变形的结构，杂交不能正常发生。此外，核苷酸探针具有的分子大小对于直接施用真空转移来说是小的，并且核苷酸探针具有的物理力(静电力、疏水性相互作用等)对于将探针吸附到多孔固体支撑上来说也是相对弱的，因此，将核苷酸探针固定到多孔固体支撑上时相当困难的。因为这个原因，除非进行另外的固定，否则核苷酸探针可能未被均勻地涂覆，并且在检验过程中会容易地解吸附，因此核苷酸探针在应用于需要优良的再现性和高敏感性的分子诊断的杂交检验中是不利地无效的。考虑到这些问题，广泛地应用采用UV的方法。UV交联是将核苷酸探针与尼龙膜共价结合的最简单的方法之一。连接主要通过胸腺嘧啶残基(其他核苷出现得不是这么频繁)来进行。当胸腺嘧啶残基被激活时，它们与存在于尼龙膜上的胺反应(GM Church and W Gilbert,PNAS,81,1991-1995,1984 ；I Saito等人，Tetrahedron Letters, 22, 3265-3268，1981)。这些碱基中的一部分与膜表面共价连接，因此在杂交过程中不参与反应。当膜过度暴露于UV时，UV连接必然会干扰杂交。因此，重要的是正确地确定UV的照射量。换言之，当将膜暴露于少量的UV时，未进行有效的交联，而当将膜暴露于过量的UV时，杂交的效率下降。同时，与膜的UV照射相关的一个重要方面是膜水含量。水吸收UV，并且干燥步骤中的偏差造成交联发生的水平高于或低于预期。就此而言，膜的UV照射存在的问题是，通过胸腺嘧啶碱基控制交联水平具有相当的难度。同时，将可光敏化的化合物用于膜或探针的技术是改良的交联方法(参考JKVeilleux and Lff Duran, IVD Technology 2，no. 2，洸_31，1996)。当可光敏化的化合物(例如，光生物素)用于探针时，它们使探针具有正确的取向(方向性)和自由度，但很少应用它们，因为在将其暴露于UV照射时常常会发生不可控的反应。共价连接作为采用常规化学方法将核苷酸探针固定到固体支撑表面的方法获得了关注。胺、羰基、羧基和巯基是多种化学连接方法中最常使用的。共价连接能够控制探针取向，受控的化学连接在通过末端残基控制核苷酸的同时使核苷酸发生粘附，并且通过引入具有合适大小的间隔可以进行使固定的核苷酸与任何加入的探针的自由杂交(free hybridization)。探针和固体支撑等之间的共价连接通常应用于微点阵系统，S卩，如玻璃片、小球等的形式，并且也可以应用于如膜的多孔固体支撑。但是，采用探针和膜之间的直接共价连接的常规技术通常限于胺标记的探针与被羧基活化(采用碳化二亚胺(如1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐(EDC或EDAC)试剂))的膜之间的共价连接。此外，以在膜上控制的连接的形式将核苷酸探针固定到膜上的方法本质上是分批过程，其难以用于大规模生产和自动化处理。此外，这些方法需要长时间周期和高成本。如上所述，由于与用于核苷酸杂交检验的核苷酸探针涂覆的膜条的生产相关的物理和化学优点和缺点，能以简单且快速的方式进行正常杂交膜条的大规模生产受到限制。因此，为了在诊断领域实现基于膜的核苷酸测试的广泛应用，对开发解决常规问题并因此确保可制造性的膜条的需要日益增加。

发明内容
技术问题因此，考虑到上述问题而完成了本发明，并且本发明的一个目的为提供一种制备核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑条的方法，该方法通过使核苷酸探针与载体结合而能够确保核苷酸探针的取向，避免固定到固体支撑表面上的核苷酸的重排，并且，由于要与靶碱基序列互补连接的探针的杂交碱基序列的一部分未被固定，从而防止了因降低的活性而发生的异常杂交。本发明的另一个目的为提供一种制备核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑条的方法，该方法有效地避免了在常规方法中遇到的控制UV最佳照射量的不便之处，并且由于该方法不采用常规方法(其中通过化学连接固定核苷酸探针)本身所需要的分批过程，因此实现了大规模生产和自动化处理。本发明的又一个目的为提供一种制备核苷酸探针检验系统的方法，该方法采用低成本通过大规模生产以简单的方式来快速实现，该方法具有再现性，防止膜表面干扰相互作用从而有利于靶碱基序列与核苷酸探针之间的杂交，并且表现出优良的稳定性和敏感性。技术方案因此，根据本发明的一个方面，提供了一种制备核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑条的方法，该方法包括将核苷酸探针与载体连接以制备结合物以及通过真空转移将该结合物固定到多孔固体支撑上。对于应用于体外诊断核苷酸实验的杂交，有多种方法用于将核苷酸探针固定到如膜的多孔固体支撑上，并且应该在考虑多种因素的情况下识别这些方法。因此，就与检验的性能和制备方法的方便性有关的结合效率而言，必然存在优点和缺点。以最低的成本用最容易的方式实现大规模生产是最重要的方面。就此而言，根据本发明的制备核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑条的方法通过将核苷酸探针与载体结合而有效地确保核苷酸探针的取向，避免固定在固体支撑上的核苷酸的重排，并且，由于要与靶碱基序列互补连接的探针的杂交碱基序列的一部分未被固定，从而防止了因降低的活性而发生的异常杂交。此外，所述方法有效地避免了在常规方法中遇到的控制UV最佳照射量的不便之处，并且由于该方法不采用化学连接本身所需的分批过程，因此实现了大规模生产和自动化处理。所述核苷酸探针包括正义(正向)和反义(反向)核苷酸，其中包括DNA、RNA、 PNA(肽核苷酸)等正义靶基因序列。包括大片段0嫩、短DNA(包括cDNA) ,RNA和肽核苷酸(PNA)的四种类型的核苷酸探针可被固定到固体相上用于快速检验的目的。这些用于固定不同分子的方法具有相同的性质，但实际上由于分子结构和大小的不同而彼此不同。用于在固体上固定大片段DNA的方法从不用于诊断试验，通常是用在固体上固定较短DNA序列的方法来代替。在此使用的核苷酸探针与载体之间的连接优选化学结合，并且化合物学结合包括共价结合以及如离子相互作用和氢键的非共价结合。其中，优选共价结合。可以使用通过亲和结合的连接，尽管其不是共价连接，但表现出与共价连接相当的强结合力。最常使用的是与亲和结合相关的生物素-抗生物素蛋白/抗生物素蛋白链菌素固定技术，其能够以 10-1 的结合常数形成强键。此外，在探针和固体支撑之间可以使用具有强亲和结合力的谷胱甘肽-GST (谷胱甘肽S-转移酶)、组氨酸-金属离子(Co、Ni、Cu)、 麦芽糖-MBP (麦芽糖结合蛋白)、凝集素(例如，伴刀豆蛋白)-甘露糖/葡萄糖结合蛋白的偶联。因此，为了使所有核苷酸探针的全部碱基序列参与杂交，优选可以向核苷酸探针引入官能团从而将探针与载体共价结合并且可以引入配体以实现核苷酸探针与载体之间的亲和结合。使用如下所述的多种官能团能够完成实现核苷酸探针与固体支撑之间的共价连接的表面修饰羧基(-C00H)、磷酸酯基、氨基(-RNH2, -ArNH2 ；其中R表示H或C1-C6烷基)、 氯代甲基(-ArCH2Cl)、酰胺基(-CONH2)、醛(-CH0)、羟基(-0H)、环氧基、巯基等(参考2005 & 2010 Integrated DNATechnologies,Strategies for Attaching Oligonucleotides to Solid Supports) 0这些官能团可以单独或者以两种以上类型的组合使用。同时，用于实现核苷酸探针与固体支撑之间亲和偶联的技术可以通过如生物素-抗生物素蛋白/抗生物素蛋白链菌素、谷胱甘肽-GST、组氨酸-金属离子、凝集素-糖蛋白、抗体-抗原等的多种系统来进行。在优选的实施方式中，在氨基修饰的核苷酸探针的情况下，氨基直接连接到核苷酸探针上，或者通过带有短碳链的氨基C6接头(linker)或氨基C12接头来连接。此外，在核苷酸探针的固定技术中，通过末端基团的反应最有效并且连接基团优选引入到核苷酸的5’或3’ -活性末端基团。因此，核苷酸探针的5’ -端或3’ -端可以用能与载体共价结合的官能团来修饰。 核苷酸探针的修饰可以在核苷酸探针的制备过程中或者在将其用于膜之前在溶液状态中进行。此外，核苷酸探针可以为，例如包括16至22个核苷酸的合成的低聚核苷酸。具体地，在能够检测结核分枝杆菌(TB)并识别对利福平和异烟胼的耐药性的核苷酸探针的情况下，可以使用靶向对结核分枝杆菌菌种具有特异性的转录间间隔区(ITS， intertranscriptional spacer)基因位点的核苷酸探针用于识别结核分枝杆菌。为了确定对如利福平的抗结核药物的敏感性和耐药性，可以使用包含编码RNA聚合酶β亚单位的基因的野生型-或突变型碱基序列的核苷酸探针。此外，为了确定对异烟胼的敏感性和耐药性，也可以使用含有编码katG(过氧化氢酶过氧化物酶)的基因位点以及inhA(烯酰基载体蛋白(ACP)还原酶)和ahpC(烷基过氧化物还原酶)的启动子位点的野生型或突变型碱基序列的核苷酸探针。同时，当使用核苷酸探针来区分非结核分枝杆菌(NTM)和结核分枝杆菌(TB)的菌种时，也可以使用靶向分枝杆菌属特异性的转录间间隔区(ITS)基因位点的核苷酸探针。此外，所述核苷酸探针优选含有能被分光镜、光化学、生物化学、免疫学或化学方式直接或间接检测的标记，并且在内部区域可以进一步含有间隔区以提高杂交位点内碱基序列(其能够与靶碱基序列互补地结合)与载体之间的杂交效率。标记的实例包括酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)、放射性同位素(例如，32P)、荧光分子和化学基团(例如，生物素)等。所述间隔区优选为非特异性的聚T尾，其可以加在氨基修饰位点之后。作为间隔区使用的聚T尾的长度可为5至30个胸腺嘧啶碱基。例如，可将核苷酸探针设计成在5’ -端标记氨基C6接头，将作为间隔区的包括 10个胸腺嘧啶碱基的聚T尾与其连接，以及能与靶基因的核苷酸序列互补连接的杂交位点的碱基序列包括16至22个核苷酸。在本发明中，所述载体可为，例如多糖、蛋白质、合成聚合物等。其中，优选多糖，并且特备优选与核苷酸探针共价连接或亲和结合的葡聚糖或其衍生物。在亲和结合的情况下，例如，抗生物素/抗生物素蛋白链菌素、麦芽糖结合蛋白、 糖蛋白或金属离子(Co、Ni、Cu等)等与载体连接，并且将能与其亲和结合的作为配体的生物素、麦芽糖、凝集素、组氨酸或其衍生物标记在核苷酸探针上。其中，更优选生物素-抗生物素/抗生物素蛋白链菌素连接技术。由于葡聚糖具有多种活性基团，所以每个葡聚糖分子能够固定多个DNA探针，因此能够固定多种配体，例如天门冬氨酸和低聚核苷酸(参考GoSS，Τ. Α.等人， J.Chromatogr. 508,279-287,1990 ；Schacht Ε. H ^ A, Modification of Dextran and application in prodrug design. In Industrial polysaccharide Engineering Genetic Engineering, Structure/Property Relations and Applications Yalpani, Μ. , Ed.； Elsevier Amsterdam, 1987)。此外，葡聚糖是长的且柔性的聚合物，因此相当有利于促进固定的DNA分子的杂交，消除因固体支撑的表面引起的空间位阻(参考=Goris J.等人，Can J Microbiol, 44,1148-1153,1998 ；Shepinov Μ· S等人，Nucleic Acids Res.，25，1155-1161， 1999 ；Gingeras Τ. R等人，15，p. 13，1987 ；Penzol G等人，Biotechnol Bioeng. 60，518-523， 1998)。最为一个代表性的实例，醛基-天门冬氨酸-葡聚糖是具有相当大分子量的物质， 其具有阴离子和醛基，因此能够与氨化的DNA探针形成非常强的共价连接，其中，该连接非常稳定从而能够表现出对杂交混合物的极端PH、高温或高浓度盐、溶剂以及亲核试剂的耐药性(参考Fuentes Μ.等人，Biomacromolecules，5，883-888，2004)。在优选的实施方式中，所述载体可为通过氧化葡聚糖能够形成醛官能团的多糖。例如，聚醛葡聚糖可以通过氧化43kDa的葡聚糖(与500kDa的葡聚糖相比，与核苷酸探针具有更高的结合效率)来制备。这种聚醛葡聚糖，例如，可通过以下步骤来制备将葡聚糖和1(104在预先确定的等摩尔量的62. 5mmol单位的葡萄糖中混合，以40rpm的速度旋转该混合溶液，使该溶液静置 6小时以上并用灭菌水透析该溶液三次(每个循环2小时)。如上所述，所述载体可为如白蛋白或合成聚合物的蛋白质。在这种情况下，官能团可与蛋白质或合成聚合物的氨基、巯基等共价连接，或者可将能与其亲和结合的配体引入核苷酸探针。例如，聚醛葡聚糖载体与胺-标记的核苷酸探针在室温下pH值为11时反应以形成希夫氏碱基(Schiff’ s base)的亚胺中间体，希夫氏碱基用例如硼氢化钠的温和的还原剂作为还原剂还原，促使不可逆的连接形成从而实现稳定的共价连接。核苷酸本身缺乏稳定性，但当向其施加足够的能量时获得与其他基团的反应活性。在如亚甲蓝的光敏剂存在下将核苷酸暴露于可见光时，或者没有任何光敏剂时将其暴露于UV，其能够直接与蛋白质交联(参考R Lalwani等人，J. Photochemistry and Photobiology 7,57-73,1990 Jff Hockensmith φ A, Methods in Enzymology,208, 211-236，1991)。通过制备活化的固体多孔支撑(例如，活化膜)来直接交联核苷酸的方法存在两个问题。第一个问题是损失活性。换言之，膜的化学活性表面与空气反应并因此损失其活性。当化学活性增加时，即，当与靶的交联速度提高时，活性损失的速度提高。为了解决这些问题，最近，制造商使用较低活性的基团，特异性地与靶探针本身反应。典型的实例为醛与胺之间的反应，这两者均是相对稳定的。由于与生产、储存和处理相关的活性固体的内在问题，活性膜根本不能用于与探针共价连接的目的。通常使用具有能与探针特异性地结合、同时表现出较低活性，并在储存过程中活性随着时间降低较慢的表面化学性质的膜。这种膜通常在其表面带有胺或醛基。用醛活化表面的优势在于通过希夫氏碱基的形成就可以形成重要的连接而无需加入任何其他试剂。希夫氏碱基是相对稳定的，但在生理条件下可以逆转。因为这个原因，应该用硼氢化钠作为温和还原剂来还原希夫氏碱基从而形成不可逆的连接(MB Meza, “ Covalent Binding in Diagnostic Test Design" in The latex Course，2000)。第二个问题是在使用前应该封闭非特异性的连接和活化膜。如果不这样，样品则会与膜连接。封闭步骤应该简单、快速并相当有效。理想的是，作为封闭结果，在膜的表面形成亲水的不带电荷的残基。当在膜的表面形成保护膜(钝化)时，引入新的化学官能团并且该膜可不具有对核苷酸的反应活性。但是，由于样品连接或检测系统的电荷吸引力或疏水吸引力会增加，而非特异性信号也会因此增加。除二硫键以外的大多数共价连接本身为分批过程，其包括将靶与膜连接然后封闭膜，因此需要大约30分钟至数小时。这样的偏差使自动化控制和大规模生产变得困难。光敏连接化学使大规模生产变得简单，但增加了成本并且不实用。另一方面，本发明，例如，通过特异性地与聚醛葡聚糖(通过活化(氧化)作为载体的葡聚糖)反应的氨基修饰的核苷酸探针的共价结合而解决了这些问题，因此使大规模生产成为可能，并且不另外需要其他有毒试剂，这从通过使用1-乙基-3- [3- 二甲基氨基丙基]碳化亚胺盐酸盐(EDC或EDAC)的胺基和羧基之间的共价连接可以看出，因此降低了与使用有机溶剂相关的成本。在优选的实施方式中，所述多孔固体支撑可为膜并且其基底(substrate)可为纤维素或尼龙。用于核苷酸固定的固体支撑的实例包括膜(硝化纤维素或尼龙膜)、玻璃珠(可控孔度玻璃珠)、丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯基体、活化的葡聚糖、抗生物素蛋白涂覆的聚苯乙烯珠和玻璃等，并且将这些不同的固体支撑用于DNA诊断(参考Saiki R.K et al,PNAS, 86,6230-6234,1989 ；Meinkoth Jet al, Anal. Biochem,138,267-284,1984 ；Ghosh S. S et al, Nucl. Acids Res. , 15, 5353-5372,1987 ；Rasmussen S. R 等人，Anal. Biochem, 198, 138-142,1991 ；Gingeras Τ. R, Nucl. Acids Res.，15，5373-5390，1987 ；Lund V.等人，Nucl. Acids Res. ，16，10861-10880，1988)。本发明主要研究了将多种靶物质固定到多孔固体支撑上的机制，在这些多种固体支撑中特别研究了膜。所述膜包括能用于核苷酸固定的大范围的物质。具体地，所述膜的实例包括常规的铸膜，例如硝化纤维素和尼龙；新型膜，例如陶瓷或径迹蚀刻膜；以及用于微点阵的基底型膜(substrate-type membrance)。应该确定用于核苷酸固定的多种建议的膜的最佳连接状态。在任何一种连接技术中，核苷酸可以以不可控的方式加到膜上。在这种情况下，由于核苷酸探针不会排列成其主要的方向，所以反应能够潜在地受限。因此，在大多数情况下，定向吸附，即本申请中的固定核苷酸的末端连接是优选的。硝化纤维素的主要优点为可快速适用性，但除非通过烘干聚酯涂覆硝化纤维素， 否则该性能较弱，并且与其他膜相比具有较低的结合力。近来，尼龙具有更高的物理强度和更高的结合力，其具有更宽范围的可用表面化合性质，能够最优化核苷酸的粘附，并因此促使其成为用于核苷酸连接的基底。将核苷酸与硝化纤维素连接最常使用的是物理吸附，而尼龙膜上的固定是通过物理吸附、UV交联或化学活化来实现的。如上所述，本发明能够解决常规物理吸附工艺的问题。但是，就生产和制造效率而言，物理吸附是相当简单和粗糙的技术(参考=TC Tisone, IVDTechnology 6，no. 3，43-60， 2000)。当在干燥过程中通过连续工艺将材料用于连接时，基于膜的系统的简单生产是最容易的。可将可固定的材料用于连续工艺，并且通过简单且控制良好的工艺(即，干燥)来进行连接。如果解决了物理吸附的特定问题，S卩，加强物理吸附从而使更强的直接连接成为可能，作为用于核苷酸诊断试验的大规模生产的技术，物理吸附是有益的。就此而言，本发明可进一步包括在载体与多孔固体支撑的孔之间通过干燥形成的物理吸附结合物。大多数加强的物理吸附技术不仅提高与非常短的探针的结合效率，而且也使探针的重要碱基序列排列成在远离固体表面的方向上突出。结果，在加入的样品与重要的碱基序列之间可以发生自由的相互作用。特别是即使使用短探针，由于提高了选择性和敏感性， 物理吸附技术也相当有效。
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就此而言，根据本发明，核苷酸探针的重要碱基序列具有通过共价连接将它们排列成远离多孔固体支撑表面的方向的取向。在本发明中，所述真空转移优选包括在自动线印迹装置(automatic line blotter)的核苷酸狭缝线(slit line)上装入核苷酸探针-载体结合物以及采用真空泵将结合物吸附到多孔固体支撑上。本发明还提供了由所述方法制备的核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑条。根据本发明的核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑条本身具有特定的结构，该结构通过如上所述的特定制备工艺而与常规支撑条区分开来。有益效果从上文中可以明显地看出，本发明通过将核苷酸探针与载体结合而有效地确保了核苷酸探针的取向，避免了固定在固体支撑表面上的核苷酸的重排，并且由于与靶碱基序列互补连接的杂交碱基序列的一部分未被固定，所以防止了由于降低的活性而引起的异常杂交。此外，本发明有效地避免了常规方法中涉及的控制UV最佳照射量的不便之处，并且由于所述方法不采用常规方法(其中通过共价连接固定核苷酸探针)本身所需要的分批过程，因此实现了大规模生产和自动化处理。换言之，本发明有效地制备核苷酸-探针检验系统，其能够采用低成本通过大规模生产以简单的方式来快速实现，其具有再现性，防止膜表面干扰靶碱基序列与核苷酸探针之间的相互作用，从而有利于这两者之间的杂交并且表现出优良的稳定性和敏感性。


联系附图从下文详细描述中将会更清晰地理解本发明的上述和其他目的、特点和其他优点，在附图中图1为图示制备条的整个过程的视图，包括通过共价连接将核苷酸低聚核苷酸探针与作为载体的葡聚糖结合以及通过真空转移将该结合物固定到膜上；图2为显示其中将核苷酸探针与专利蓝色V染料(作为蓝色染料)一起涂覆在膜条上的状态的图，其中，上部的探针为根据一个实施方式检测对利福平、异烟胼的敏感性/ 耐药性的探针，下部的探针为根据另一个实施方式识别和检测分枝杆菌属的探针；图3为显示由用于利福平和异烟胼敏感性/耐药性样本的PCR和反向杂交线印迹检验而得到的图；以及图4为显示由用于分枝杆菌样本和对照(阴性、阳性)组的PCR和反向杂交线印迹检验而得到的图。
具体实施例方式现在，将参照下面的实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于解释说明本发明而不应用于限制本发明的范围和实质。下面的实验涉及通过真空转移将核苷酸探针固定到膜上来制备条的方法以及证实下列有效性的实验(i)检测结核分枝杆菌和确认对利福平和异烟胼药物的耐药性的实验，( )采用两个具体实施例中使用膜条的反向杂交线印迹检验法来进行检测和识别分支杆菌的实验，即，在痰液、支气管冲洗液、脑脊液、尿液、组织、全血和培养菌株中区分结核分枝杆菌(TB)和非结核分枝杆菌(NTM)。实施例1 制备聚酵葡聚糖(PAD)(1)所需试剂和仪器的准备使用葡聚糖(Sigma，D-4133，Mr 43kDa)、KIO4 (Aldrich, 32242-3, F. W230. 00)、 纤维素透析膜截留 12000 :Spectra/Por,MWCO 12-14000)、盐酸羟胺(NH2OH-HCl = 69. 49)、 甲基橙粉末、ION盐酸、酸度计、0. IN氢氧化钠(NaOH)、冷冻干燥机和真空离心蒸发浓缩器寸。(2)氧化葡聚糖的制备将0. 5g的葡聚糖(Sigma, D-4133, Mr 43kDa/相当于62. 5mmol的葡萄糖)完全溶解在热压处理过的D. W中从而将总体积调节至10ml。向其中加入0. 72g的KIO4(相当于 62. 5mmol 的相同当量)(参考Azzam T 等人，J. Med. Chem.，45，1817-1824，2002 ；Azzam T 等人，Macromolecules, 35,9947-9953, 2002 ；Azzam T 等人，J. Controlled Release, 96, 309-323,2004 ；Hosseinkhani H. et al, . Gene Therapy，11，194-203，2004)。将得到的混合物保持6至12小时同时在40rpm的速度下旋转。将氧化葡聚糖加到纤维素透析膜上，在2L灭菌三蒸水中0/N透析一次并继续透析，总共三次，每次透析2小时并更换灭菌蒸馏水。透析后，准确测量聚醛葡聚糖的体积。根据Huiru Zhao等人在期刊中报道的公开方法(Pharmaceutical Research, 8, 400-402，1991)来测量氧化葡聚糖中醛基的量。首先，通过将1. 75g的干燥盐酸羟胺溶解于 15ml的灭菌蒸馏水中来制备0.25N盐酸羟胺-甲基橙(pH4. 0)试剂。单独地，制备0.6ml 的终浓度为0. 05%的甲基橙试剂并将其加入盐酸羟胺溶液。将ION HCl缓慢加入制得的混合物中以调节pH值至4.0，并用灭菌蒸馏水稀释该溶液以制备IOOml的0. 25N盐酸羟胺-甲基橙(pH 4. 0)试剂。用0. IN NaOH标准溶液对聚醛葡聚糖进行氧化-还原滴定。透析后，将1. 25ml的 0. 25N盐酸羟胺-甲基橙(pH 4. 0)溶液加入到100 μ L制得的聚醛葡聚糖中，接着在室温下进行反应2小时，同时在40rpm下旋转。然后，用0. IN NaOH作为标准溶液进行滴定。准确测量在氧化-还原滴定中加入的NaOH的体积(yL)并且可以从颜色的变化(颜色从红色变为黄色)看出滴定终点。聚醛葡聚糖的氧化-还原反应和醛基的取代水平的计算显示在下面的公式中，并且计算在透析后测量的聚醛葡聚糖(PAD)的总体积中存在的醛基的总摩尔数并将其显示在下表1中。葡聚糖-(CHO)η+Η2Ν-0Η · HCl =葡聚糖 _(CH = N_0H)n+H20+HCl (1)HCl+NaOH = NaCl+H20(2)醛基的取代水平
(SaQH体积(mL) χ NNaOH) χ 10'3 mol_ CHO的摩尔数
样品重量(g) χ 葡聚糖(MW)葡聚糖的摩尔数[表1]
权利要求
1.一种制备核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑条的方法，其包括将核苷酸探针与载体连接以制备结合物；以及通过真空转移将所述结合物固定在多孔固体支撑上。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸探针为选自DNA、RNA和PNA中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸探针与所述载体之间的连接为共价连接，或者为具有与共价连接相当的结合力的亲和结合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸探针的5’-端或3’ -端用能与载体共价连接或亲和结合的官能团或配体修饰。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述官能团为选自羧基(-C00H)、磷酸酯基、氨基(-RNH2, -ArNH2 ；其中，R为H或C1-C6烷基)、氯代甲基(-ArCH2Cl)、酰胺基(-CONH2)、醛基(-CH0)、羟基(-0H)、环氧基和巯基中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述配体为选自生物素、谷胱甘肽、麦芽糖、组氨酸、凝集素及其衍生物中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述氨基直接与所述核苷酸探针连接。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述配体直接与所述核苷酸探针连接。
9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述氨基为具有短碳链的氨基C6接头或氨基C12接头。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸探针包含能被分光镜、光化学、生物化学、免疫学或化学的方式直接或间接检测的标记。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸探针为合成的低聚核苷酸。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述合成的低聚核苷酸包含16至22个核苷酸。
13.根据权利要求4所述的方法，其中，所述核苷酸探针包含间隔区以提高在内部区域内的杂交效率。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述间隔区为非特异性聚T尾。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体为选自多糖、蛋白质和合成聚合物中的至少一种。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述载体为葡聚糖或葡聚糖衍生物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述葡聚糖衍生物为氧化葡聚糖。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述氧化葡聚糖为聚醛葡聚糖。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述结合物通过胺-标记的核苷酸探针与作为载体的聚醛葡聚糖反应以形成希夫氏碱基的亚胺中间体并采用还原剂还原该希夫氏碱基以引发不可逆的连接来制备。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多孔固体支撑为膜。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述膜由硝化纤维素或尼龙组成。
22.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述载体和所述多孔固体支撑之间物理吸附所述结合物。
23.根据权利要求1所述的方法，其中，所述真空转移包括在自动线印迹装置的核苷酸狭缝线上装入所述核苷酸探针与载体的结合物；以及采用真空泵将该结合物吸附到多孔固体支撑上。
24.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括用预杂交缓冲液预处理所述固体支撑。
25.根据权利要求M所述的方法，其中，所述预杂交缓冲液为含有登哈特溶液、SSC、SDS和变性的鲑精DNA的组合物。
26.一种核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑条，其由根据权利要求1至25中任一项所述的方法制备。
全文摘要
本申请公开了一种制备核苷酸探针涂覆的多孔固体支撑条的方法。所述方法包括将核苷酸探针与载体连接以制备结合物并通过真空转移将该结合物固定到多孔固体支撑上。
文档编号C12Q1/68GK102559877SQ201110431650
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者俞恩珠, 吴宰勋, 姜镇锡, 朴荣石, 权准徹 申请人:株式会社Lg生命科学