荧光定量PCR检测组织中miR-100含量的试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种荧光定量PCR检测miR-100含量的试剂盒及应用，所述试剂盒包括总RNA提取试剂，miRNA反转录试剂，miRNA荧光定量PCR试剂；本发明利用荧光定量PCR检测组织中miR-100含量的试剂盒检测了大量的胃癌患者及正常人的胃组织及血清样品，通过测量其中miR-100的含量，能稳定有效地确定待测组织或血清是否为胃癌，为胃癌的诊断提供了简便有效的新途径。
【专利说明】荧光定量PCR检测组织中miR-100含量的试剂盒及其应用 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及miR-100的检测，特别涉及荧光定量PCR检测组织中miR-100含量的 试剂盒及应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 胃癌是一种消化系统常见的恶性肿瘤，发病率高，在我国，致死率居各种恶性肿瘤 之首，由于肿瘤的范围即癌肿侵润的深度，腹膜转移及远处转移，淋巴结的转移都与胃癌的 预后有较强的相关一致性，所以，提早诊断，早治疗，才是最有效的提高胃癌生存率的手段， 其中，胃癌标志物的发现及应用对于提高胃癌的早期诊断率有着重大的意义。此外，胃癌的 术后复发率高达61%，这也是胃癌致死率高的重要原因，目前监测胃癌术后复发有多种方 法，多数特异性不高，无法对胃癌术后是否复发做出一个早期的诊断。很明显，无论在肿瘤 的的生物学研究中还是临床实践中，都需要一种简单可靠的方法来特异且灵敏的检测胃癌 的发生。
[0003] MicroRNAs (miRNAs)是最近被发现的一类非编码小RNA，研究表明，多数癌症的发 生都与miRNA的异常调控有关，miRNA的含量发生了明显的变化，是否能以miRNA差异表达 来作为区分诊断癌症的一种手段，值得我们深入的进行研究。 (三）
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种荧光定量PCR检测组织中miR-100含量的试剂盒及其应 用，根据组织中miR-100含量判断是否为肿瘤组织。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明提供一种荧光定量PCR检测miR-100含量的试剂盒，所述试剂盒包括总 RNA提取试剂（ambion公司），miRNA反转录试剂（AB公司），miRNA荧光定量PCR试剂（AB 公司）；所述miRNA反转录试剂包括miR-100反转录引物（AB公司）；所述miRNA突光定 量PCR试剂包括miR-100荧光定量PCR引物（AB公司）；所述miR-100的核苷酸序列为 5' -AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'。具体，优选试剂盒由总RNA提取试剂（ambion公司）， miRNA反转录试剂（AB公司）和miRNA荧光定量PCR试剂（AB公司）组成；所述miRNA反 转录试剂包括miR-100反转录引物（AB公司），所述miRNA荧光定量PCR试剂包括miR-100 荧光定量PCR引物（AB公司）。
[0007] 本发明还提供一种所述荧光定量PCR检测组织中miR-100含量的试剂盒的应用， 所述的应用为：利用试剂盒中的总RNA提取试剂提取待测组织或血清的总RNA，再利用试剂 盒中的miRNA反转录试剂及miR-100反转录引物将提取的总RNA反转录成cDNA，以cDNA为 模板，利用试剂盒中的miRNA荧光定量PCR试剂及miR-100荧光定量PCR引物进行荧光定 量PCR反应；所述荧光定量PCR的反应程序为：95°C反应10分钟后进行50个循环的95°C 5 秒，60°C 1分钟；血清中miR-100含量超过0. IfM或者组织中miR-100含量超过lOOfM，则 为肿瘤血清或肿瘤组织。
[0008] 更进一步，本发明所述荧光定量PCR检测组织中miR-100含量的试剂盒的检测方 法具体为：
[0009] (1)使用试剂盒中总RNA提取试剂提取待测组织或者血清中的miRNA ;
[0010] (2)利用试剂盒中的miRNA反转录试剂及miR-100反转录引物将提取的miRNA通 过PCR反应反转录成cDNA ;所述反转录PCR的反应程序为：16°C反应30分钟，42°C反应30 分钟，最后85 °C反应5分钟；
[0011] ⑶以反转录产物cDNA为模板，利用荧光定量PCR试剂及miR-100荧光定量PCR 引物进行PCR反应；所述荧光定量PCR的反应程序为：95°C反应10分钟后，进行50个循环 的95°C 5秒，60°C 1分钟。
[0012] (4)采用绝对定量的方法，将步骤（1)中待测组织或血清改为含miR-100标准品 的混合液进行反转录及突光定量PCR反应,根据含miR-100标准品的混合液中miR-100标 准品的浓度对应的起飞CT值，得到miR-100含量与荧光定量PCR反应CT值之间的线性关 系，绘制成浓度与CT值之间的标准曲线；根据待测样品CT值及标准曲线，若待测血清中超 过0. IfM或者待测组织中miR-100含量超过IOOfM,贝U为胃癌血清或胃癌组织，反之,贝丨J正 堂 巾。
[0013] 本发明以miR-100作为胃癌标志物，研制胃癌诊断试剂盒，并以大量的胃癌患者 及正常组织及血清中miR-100的检测作为验证，发现该试剂盒能有效灵敏地鉴别胃癌患者 与正常人，对于胃癌早期诊断有着重大的意义，是有效地提高胃癌生存率的手段。
[0014] 本发明的有益效果主要体现在：
[0015] 本发明利用荧光定量PCR检测组织中miR-100含量的试剂盒检测了大量的胃癌患 者及正常人的胃组织及血清样品，通过测量其中miR-100的含量，能稳定有效地确定待测 组织或血清是否为胃癌，为胃癌的诊断提供了简便有效的新途径。 (四）
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为本发明试剂盒检测不同胃癌患者发病组织中与正常胃组织中miR-100的表 达量图谱，样本量为66对。
[0017] 图2为本发明试剂盒检测不同临床分期的胃癌患者发病组织中miR-100的表达量 图谱，样本量为60个。
[0018] 图3为本发明试剂盒检测胃癌患者与正常人血清中miR-100的表达量图谱，样本 量为28例正常，29例胃癌。
[0019] 图4为标准曲线。 (五）
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0021] 实施例1 :
[0022] 试剂盒组成：
[0023] 总RNA提取试剂（ambion公司），miRNA反转录试剂（AB公司）及miR-100反转引 物（AB公司），miRNA荧光定量PCR试剂及miR-100荧光定量PCR引物（AB公司）。
[0024] 实施例2
[0025] 标准曲线
[0026] 将 mi-100 标准品用 DEPC 水配制成以 10' 1(Γ2、ΚΓ1、10〇、101、102、IO 3 μ M 的 mi-100 标准品溶液，采用实施例1试剂盒进行反转录及突光定量PCR反应，根据含miR-100标准品 的溶液中miR-100标准品的浓度对应的起飞CT值，得到miR-100含量与荧光定量PCR反应 CT值之间的线性关系，绘制成浓度与CT值之间的标准曲线。
[0027] CT = 3. 259 X lgx+33. 777, X 为 miR-100 标准品溶液中 miR-100 含量。
[0028] 实施例3
[0029] (1)用实施例1所述试剂盒中RNA提取试剂提取120位胃癌志愿者胃组织中的总 RNA，以胃正常组织中的总RNA为对照。
[0030] (2)利用实施例1试剂盒中的miRNA反转录试剂将提取的总RNA反转录成CDNA， 具体操作为：取miR-100反转录引物，反转录试剂，及待测样品miRNA配成PCR反应体系，反 应管置于常规PCR仪中反应，将miRNA反转成为cDNA，反应条件为先16°C反应30分钟，后 42 °C反应30分钟，最后85 °C反应5分钟。
[0031] (3)取步骤⑵反转录产物CDNA为模板，利用实施例1所述试剂盒中荧光定量PCR 试剂及引物进行PCR反应，反应管置于荧光定量PCR仪中进行荧光检测，所述荧光定量PCR 的反应程序为，95°C反应10分钟，后进行50个循环的95°C 5秒，60°C 1分钟。
[0032] (4)根据实施例2制备的标准曲线，胃癌患者胃组织中miR-100含量> IOOfM的 共57例，miR-100含量< IOOfM的共8例，非胃癌患者组织中miR-100含量> IOOfM的有 11例，miR-100含量< IOOfM的有55例。该试剂盒的特异性为83. 8% (57/68)，敏感性为 86. 4% (57/66)。结果发现通过使用该试剂盒，以0. IfM为临界值，血清中miR-100含量超 过0. IfM或者胃组织中超过IOOfM,可以有效地鉴别胃癌患者与正常人。
[0033] 实施例4 :
[0034] 将实施例3中的志愿者胃组织改为29位胃癌志愿者的血清，以正常志愿者血清 为对照，其他操作同实施例3。胃癌患者血清中miR-100含量> 0. IfM的共24例，miR-100 含量< 0. IfM的共5例，非胃癌患者血清中miR-100含量> 0. IfM没有，全部小于0. lfM。 MiR-100作为诊断指标的特异性为100% (24/24)，敏感性为82. 8% (24/29)。
[0035] 结果发现通过使用该试剂盒，以0. IfM为临界值，血清中miR-100含量超过0. IfM 或者胃组织中超过IOOfM,可以有效地鉴别胃癌患者与正常人。
【权利要求】
1. 一种荧光定量PCR检测组织中miR-100含量的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括 总RNA提取试剂，miRNA反转录试剂和miRNA荧光定量PCR试剂；所述miRNA反转录试剂包 括miR-100反转录引物；所述miRNA荧光定量PCR试剂包括miR-100荧光定量PCR引物；所 述 miR-100 的核苷酸序列为 5' -AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'。
2. -种权利要求1所述荧光定量PCR检测组织中miR-100含量的试剂盒的应用，其特 征在于所述的应用为：利用试剂盒中的总RNA提取试剂提取待测组织或血清的总RNA，再利 用试剂盒中的miRNA反转录试剂及miR-100反转录引物将提取的总RNA反转录成cDNA，以 cDNA为模板，利用试剂盒中的miRNA荧光定量PCR试剂及miR-100荧光定量PCR引物进行 荧光定量PCR反应；所述荧光定量PCR的反应程序为：95°C反应10分钟后进行50个循环 的95°C 5秒，60°C 1分钟；血清中miR-100含量超过0. lfM或者组织中miR-100含量超过 lOOfM，则为胃癌血清或胃癌组织。
【文档编号】C12Q1/68GK104293923SQ201410482086
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】章晓波, 龚燚, 杨耿, 王雨濛 申请人:浙江大学