一种基于arms荧光定量pcr检测基因突变的试剂盒和方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于ARMS荧光定量PCR检测基因突变的试剂盒和方法。与现有基因多态性检测方法相比，本发明的基于增强型ARMS荧光定量PCR检测基因多态性的试剂盒及方法不仅特异性强，敏感性高，成本低，结果高度可靠，背景低，结果易于判断，而且在操作和使用上还具有独特优势，荧光定量PCR检测快捷方便，全程闭管检测，降低污染，减少了不必要的费用和工作量。特别是荧光定量PCR可以用CT值来表征扩增效率，因此这个方法可以检测出核基因多态性的杂合子基因型情况，使得结果判断可以准确可靠。
【专利说明】—种基于ARMS荧光定量PCR检测基因突变的试剂盒和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学【技术领域】，特别涉及一种基于ARMS荧光定量PCR检测基因突变的试剂盒和方法。
【背景技术】
[0002]人类基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性，对疾病临床表现的多样性，以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。通过基因多态性的研究，可从基因水平揭示人类不同个体间生物活性物质的功能及效应存在着差异的本质。通过研究基因多态性与疾病易感性之间的联系，例如，由线粒体基因mtDNA A1555G和C1494T突变导致的耳聋主要与氨基糖苷类药物使用有关，维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位I基因(VKORCl)的基因多态性和细胞色素P4502C9基因(CYP2C9)是影响华法林用量个体差异最主要的两个遗传因素等，可以阐明人体对疾病、毒物和应激的易感性，不仅对临床医学也为预防医学的发展带来新的领域。
[0003]用于检测基因多态性的方法很多，包括如DNA直接测序，限制性片段长度多态性(restrict1n fragment lengthpolymorphisms, RFLP),扩增阻碍突变系统(amplificat1n refractory mutat1n system, ARMS)等，其中 DNA 直接测序为突变检测的金标准，但因其所需时间长，费用高，对取材要求严格，所以临床应用受到很大限制。限制性片段长度多态性仅适用于突变位点附近存在适当的特定限制性内切酶识别序列的情况，应用局限性较大。
[0004]扩增阻碍突变系统是验证性检测DNA序列变化的常用经典方法之一。ARMS-PCR基因分型检测通常包括两个互补的PCR反应，使用相同的DNA模板和一条相同的共有引物和反应条件，区别仅在于与共有引物配对的ARMS引物不同，野生型ARMS引物3'末端与野生型模板匹配，突变型ARMS引物3'末端与突变型模板匹配，使两个反应选择性扩增特定的DNA模板，即3'末端不匹配引物的延伸受到阻碍，通常还在3'末端2-4个碱基设置一个错配碱基，以提高错配引物的选择扩增性。但由于人基因组DNA分子模板浓度一般较高，导致ARMS引物经选择性扩增后背景仍然很高，而且对于特定序列，ARMS引物不足以形成较明显的扩增差异，不利于结果判断。
【发明内容】
[0005]为了解决基因 多态性的检测，本发明的目的在于提供一种基于ARMS荧光定量PCR检测基因突变的试剂盒。
[0006]本发明的另一个目的在于提供一种基于ARMS荧光定量PCR检测基因突变的方法。
[0007]本发明中，所述基因突变主要包括:点突变、缺失突变和插入突变等。本发明中，所述缺失突变可以包括缺失一个或多个碱基的突变，同样地，所述插入突变可以包括插入一个或多个碱基的突变。
[0008]本发明整合了 ARMS PCR技术和荧光定量PCR技术。本发明的特征在于，在相同反应体系(例如，包括样本DNA、ROX、TaqMan探针、Mg2+、dNTP、聚合酶及缓冲液等)中，分别使用本发明的针对野生型模板的增强型(enhanced) ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物以及与所述增强型ARMS引物对应的共用上游或下游引物，用两个反应管对同一份待测样本进行检测，通过CT值和Λ CT值的大小判定样本基因型。
[0009]本发明依据传统ARMS-PCR技术的原理，进行了增加ARMS引物3'端和中间区域的错配碱基数，使得针对野生型模板的增强型ARMS引物对突变型样本不扩增或扩增效率很低，并且针对突变型模板的增强型ARMS引物对野生型样本不扩增或扩增效率很低，这样大大降低背景信号，使得结果更易于判断。
[0010]在一个方面中，本发明提供了一种基于ARMS荧光定量PCR检测基因突变的试剂盒，其中，所述基因突变是点突变，所述试剂盒包括:
[0011]针对野生型模板的ARMS引物，所述引物的3'末端终止在待测位点处并且与野生型序列匹配，其中，在所述引物的3'末端第2-4位和第7-13位分别设置一个或多个错配碱基;
[0012]针对突变型模板的ARMS引物，所述引物的3'末端终止在待测位点处并且与突变型序列匹配，其中，在所述引物的3'末端第2-4位和第7-13位分别设置一个或多个错配碱基;
[0013]共用上游或下游引物，所述引物分别与所述针对野生型模板的ARMS引物或所述针对突变型模板的ARMS引物一起扩增一段包含待测基因突变位点的序列；和
[0014]TaqMan探针，所述探针为在ARMS引物扩增片段内设计用于检测ARMS引物对模板的扩增效率。
[0015]在另一个方面中，本发明提供了一种基于ARMS荧光定量PCR检测基因突变的试剂盒，其中，所述基因突变是缺失突变或插入突变，所述试剂盒包括:
[0016]针对野生型模板的ARMS引物，所述引物的3'末端终止在在延伸方向上缺失或插入位点下游第2-5个碱基处，并且包含待测位点在内的3'端碱基(包含缺失或插入位点和下游几个碱基)与野生型序列匹配，其中，所述引物在延伸方向上在缺失或插入位点上游第2-4位和第6-8位分别设置一个或多个错配碱基；
[0017]针对突变型模板的ARMS引物，所述引物的3'末端终止在在延伸方向上缺失或插入位点下游第2-5个碱基处，并且包含待测位点在内的3'端碱基(包含缺失或插入位点和下游几个碱基)与突变型序列匹配，其中，所述引物在延伸方向上在缺失或插入位点上游第2-4位和第6-8位分别设置一个或多个错配碱基；
[0018]共用上游或下游引物，所述引物分别与所述针对野生型模板的ARMS引物或所述针对突变型模板的ARMS引物一起扩增一段包含待测基因突变位点的序列；和
[0019]TaqMan探针，所述探针为在ARMS引物扩增片段内设计用于检测ARMS引物对模板的扩增效率。
[0020]本发明中，优选地，在所述针对野生型模板的ARMS弓丨物和针对突变型模板的ARMS引物中，引入错配碱基的位置和类型相同。
[0021]本发明中，更优选地，除了突变位点处的碱基以外，所述针对野生型模板的ARMS引物和所述针对突变型模板的ARMS引物完全相同。
[0022]本发明中，优选地，所述试剂盒进一步包括:R0X校正液、Mg2+、dNTP、聚合酶及缓冲液。
[0023]本发明中，优选地，在所述试剂盒中，对所述TaqMan探针的末端进行荧光标记，例如，对所述探针进行5’端FAM标记。
[0024]本发明中，优选地，所述点突变例如为，耳聋相关基因12SrRNA1494C>T点突变，华法林用药相关位点VK0RC13730G>A，钼类药物相关基因XRCCIArgl94Trp ;所述缺失突变例如为与耳聋相关的GJB235delG缺失突变。
[0025]本发明中，优选地，所述试剂盒用于检测与耳聋相关的GJB235delG缺失突变，其中，所述针对野生型模板的下游ARMS引物如SEQ ID NO: 7所示，针对突变型模板的下游ARMS引物如SEQ ID NO:8所示；和/或，所述共用上游引物如SEQ ID N0:9所示；和/或，所述探针如SEQ ID NO: 10所示。
[0026]本发明中，优选地，所述试剂盒用于检测耳聋相关基因12SrRNA1494C>T点突变，其中，所述针对野生型模板的上游ARMS引物如SEQ ID NO: 13所示，针对突变型模板的下游ARMS引物如SEQ ID NO: 14所示；和/或，所述共用下游引物如SEQ ID N0:15所示；和/或，所述探针如SEQ ID NO: 16所示。
[0027]本发明中，优选地，所述试剂盒用于检测华法林用药相关位点VK0RC13730G>A突变，其中，所述针对野生型模板的下游ARMS引物如SEQ ID NO: 19所示，针对突变型模板的下游ARMS引物如SEQ ID NO:20所示；和/或，所述共用上游引物如SEQ ID N0:21所示；和/或，所述探针如SEQ ID NO:22所示。
[0028]本发明中，优选地，所述试剂盒用于检测钼类药物相关基因XRCCI Argl94Trp突变，其中，所述针对野生型模板的下游ARMS引物如SEQ ID NO:25所示，针对突变型模板的下游ARMS引物如SEQ ID N0:26所示；和/或，所述共用上游引物如SEQ ID N0:27所示；和/或，所述探针如SEQ ID NO:28所示。
[0029]根据本发明的另一个目的，提供了一种基于ARMS荧光定量PCR检测基因突变的方法，所述方法包括:在相同的反应体系(包括样本DNA、ROX、TaqMan探针、Mg2+、dNTP、聚合酶、共用上游或下游引物、及缓冲液)中，使用本发明的针对野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物分别对同一份待测样本进行检测，通过CT值和Λ CT值的大小判定样本基因型。
[0030]本发明所述方法进一步包括以下步骤:
[0031](I)设计并筛选含有待测位点的taqman探针、增强型ARMS引物、配对引物、反应体系，其中，所述taqman探针、增强型ARMS引物、配对引物如上所述；
[0032](2)从样本中提取人基因组DNA作为模板DNA ；
[0033](3)进行实时荧光定量PCR扩增:每个多态性位点的检测分2管进行，每管中加入相同的ROX校正液、Mg2+、dNTP、聚合酶、缓冲液、taqman探针、配对引物和模板DNA，每管中分别加入野生型ARMS弓丨物和突变型ARMS弓丨物的一种，进行多态性检测的增强型ARMS-qPCR检测；
[0034](4)结果判定
[0035]依据Cut-off Δ Ct值判定结果。
[0036]计算样本用野生型和突变型突变检测反应的Λ Ct值，Λ Ct值=Ct突变型-Ct野生型。[0037]若突变型和野生型检测体系均有扩增信号，依据公式Λ Ct值=Ct突变型-Ct野生型计算Λ Ct值；若Λ Ct>8，判定为野生纯合型；g-l〈ACt〈l，判定为杂合型；若厶(^〈-8，判定为突变纯合型；
[0038]若突变型有扩增信号且Ct值小于36、野生型无扩增信号，则判定为突变纯合型；若突变型Ct值大于36，说明样本DNA提取浓度过低或超出本方法检测范围，需要重新提取样本测试；
[0039]若野生型有扩增信号且Ct值小于36、突变型无扩增信号，则判定为野生纯合型；若野生型Ct值大于36，说明样本DNA提取浓度过低或超出本方法检测范围，需要重新提取样本测试；
[0040]若突变型和野生型检测体系Ct值大于36，说明样本DNA提取浓度过低或超出本方法检测范围，需要重新提取样本测试。
[0041]与现有基因多态性检测方法相比，本发明的基于增强型ARMS荧光定量PCR检测基因多态性的试剂盒及方法不仅特异性强，敏感性高，成本低，结果高度可靠，背景低，结果易于判断，而且在操作和使用上还具有独特优势，荧光定量PCR检测快捷方便，全程闭管检测，降低污染，减少了不必要的费用和工作量。特别是荧光定量PCR可以用CT值来表征扩增效率，因此这个 方法可以检测出核基因多态性的杂合子基因型情况，使得结果判断可以准确可靠。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1为实施例1的使用常规ARMS引物和本发明的增强型ARMS引物检测耳聋样本GJB2基因35delG缺失突变的检测效果进行比较，该样本经测序证实为野生型，其中，标识35delWRl、35delWR2、35delWR3、35delWR4、35delMRl、35delMR2、35delMR3、35delMR4 表示分别使用实施例1中的8对引物对同一份临床样本的检测结果。
[0043]图2为实施例2的使用常规ARMS引物和本发明的增强型ARMS引物检测耳聋样本12SrRNA1494C>T碱基置换突变的检测效果进行比较，该样本经测序证实为野生型，其中，标识1494WR1、1494WR2、1494WR3、1494WR4表示分别使用实施例2中的4对引物对同一份临床样本的检测结果。
[0044]图3为实施例3的使用常规ARMS引物和本发明的增强型ARMS引物检测慢性房颤样本VKORCl基因3730G>A碱基置换突变的检测效果进行比较，该样本经测序证实为野生型，其中，标识V3WF1、V3WF2、V3MF1、V3MF2表示分别使用实施例3中的4对引物对同一份临床样本的检测结果。
[0045]图4为实施例4的使用常规ARMS引物和本发明的增强型ARMS引物检测直肠癌样本XRCCI基因Argl94Trp碱基置换突变的检测效果进行比较，该样本经测序证实为野生型，其中，XRCC6WR1、XRCC6WR2、XRCC6MR1、XRCC6MR2表示分别使用实施例4中的4对引物对同一份临床样本的检测结果。
【具体实施方式】
[0046]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。[0047]下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
[0048]以下实施例中，DNA聚合酶购自QIAGEN公司(PCR缓冲液、Mg2+均随酶一起供应)，dNTP、ROX校正液购自日本Takara公司，所用引物及探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成，血液基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司。
[0049]在下列实施例中均使用血液基因组DNA提取试剂盒制备样本DNA。
[0050]实施例1使用常规ARMS引物和本发明的增强型ARMS引物检测与耳聋相关的GJB235delG缺失突变
[0051]本发明是在常规ARMS引物的基础上，使引物在延伸方向上在缺失位点的上游第6-8个碱基处再设置一个错配碱基，由此在实时荧光定量PCR中降低野生型增强型ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型增强型ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。
[0052]I) ARMS弓丨物和增强型ARMS弓丨物设计
[0053]实验设计了 3对野生型ARMS引物、3对突变型ARMS引物、I对野生型增强型ARMS引物和I对突变型增强型ARMS引物，共用上游引物为35delF，相关参数为:Tm值55.(TC —60.0°C，GC值40.0%— 60.0%，引物大小20±3bp。根据35deIG位点的特殊性，ARMS引物和增强型ARMS引物的3’末端位于在延伸方向上在缺失位点下游第5个碱基处，末端6个碱基分别与野生型和突变型基因相匹配，为提高特异性，ARMS引物在延伸方向上在缺失位点上游第2个碱基处引入一个错配碱基，而增强型ARMS引物在延伸方向上在缺失位点上游第2个碱基处和上游第6个碱基处分别引入一个错配碱基，所设计的ARMS引物和增强型ARMS引物序列如下:
[0054]下游ARMS 引物:35delWRlGTTTGTTCACAACCCCCA(SEQ ID NO:1)
[0055]35delMRlGTTTGTTCACAACCCCA(SEQ ID NO:2)
[0056]35delffR2GTTTGTTCACATCCCCCA(SEQ ID NO:3)
[0057]35delMR2GTTTGTTCACATCCCCA(SEQ ID NO:4)
[0058]35delffR3GTTTGTTCACAGCCCCCA(SEQ ID NO:5)
[0059]35delMR3GTTTGTTCACAGCCCCA(SEQ ID NO:6)
[0060]下游增强型ARMS弓丨物:
[0061]35delffR4GTTTGTGCACAGCCCCCA(SEQ ID NO:7)
[0062]35delMR4GTTTGTGCACAGCCCCA(SEQ ID NO:8)
[0063]共用上游引物35delF:GTGTGCATTCGTCTTTTCCAG(SEQ ID NO:9)
[0064]引物中下划线部分示意表示除缺失碱基外引入的错配碱基的位置及碱基类型。这8条引物与共同上游引物配对组成了四套引物，每套引物包括2条下游引物(野生型和突变型)及上游引物35delF，用来建立检测GJB235delG缺失突变的方案，选择4套引物中更适合用于基因分型的，使得模板DNA的两个平行荧光定量PCR结果CT值〈35和Λ CT值>8。
[0065]2)探针设计
[0066]在ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为:1'111值68.01:— 70.0°C，GC值40.0%- 70.0%，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下:
[0067]35del 探针:CAGCGTGCCCCAATCCATCTTC(SEQ ID NO: 10)
[0068]3) ARMS荧光定 量PCR扩增反应
【权利要求】
1.一种基于ARMS荧光定量PCR检测基因突变的试剂盒，其中，所述基因突变是点突变，所述试剂盒包括: 针对野生型模板的ARMS引物，所述引物的3'末端终止在待测位点处并且与野生型序列匹配，其中，在所述引物的3'末端第2-4位和第7-13位分别设置一个或多个错配碱基； 针对突变型模板的ARMS引物，所述引物的3'末端终止在待测位点处并且与突变型序列匹配，其中，在所述引物的3'末端第2-4位和第7-13位分别设置一个或多个错配碱基； 共用上游或下游引物，所述引物分别与所述针对野生型模板的ARMS引物或所述针对突变型模板的ARMS引物一起扩增一段包含待测基因突变位点的序列；和 TaqMan探针，所述探针为在ARMS引物扩增片段内设计用于检测ARMS引物对模板的扩增效率。
2.一种基于ARMS荧光定量PCR检测基因突变的试剂盒，其中，所述基因突变是缺失突变或插入突变，所述试剂盒包括: 针对野生型模板的ARMS引物，所述引物的3'末端终止在在延伸方向上缺失或插入位点下游第2-5个碱基处，并且包含待测位点在内的3'端碱基与野生型序列匹配，其中，所述引物在延伸方向上在缺失或插入位点上游第2-4位和第6-8位分别设置一个或多个错配碱基; 针对突变型模板的ARMS引物，所述引物的3'末端终止在在延伸方向上缺失或插入位点下游第2-5个碱基处，并且包含待测位点在内的3'端碱基与突变型序列匹配，其中，所述引物在延伸方向上在缺失或插入位点上游第2-4位和第6-8位分别设置一个或多个错配碱基; 共用上游或下游引物，所述引物分别与所述针对野生型模板的ARMS引物或所述针对突变型模板的ARMS引物一起扩增一段包含待测基因突变位点的序列；和 TaqMan探针，所述探针为在ARMS引物扩增片段内设计用于检测ARMS引物对模板的扩增效率。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，在所述针对野生型模板的ARMS引物和针对突变型模板的ARMS引物中，引入错配碱基的位置和类型相同；优选地，除了突变位点处的碱基以外，所述针对野生型模板的ARMS引物和所述针对突变型模板的ARMS引物完全相同。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括:ROX校正液、Mg2+、dNTP、聚合酶及缓冲液。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于检测与耳聋相关的GJB235delG缺失突变，其中，所述针对野生型模板的下游ARMS引物如SEQ ID NO: 7所示，针对突变型模板的下游ARMS引物如SEQ ID NO:8所示；和/或，所述共用上游引物如SEQ IDNO:9所示；和/或,所述探针如SEQ ID NO: 10所示。
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于检测耳聋相关基因12SrRNA1494C>T点突变，其中，所述针对野生型模板的上游ARMS引物如SEQ ID NO: 13所示，针对突变型模板的下游ARMS引物如SEQ ID NO: 14所示；和/或，所述共用下游引物如SEQ ID NO: 15所示；和/或，所述探针如SEQ ID NO: 16所示。
7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于检测华法林用药相关位点VK0RC13730G>A突变，其中，所述针对野生型模板的下游ARMS引物如SEQ ID NO: 19所示，针对突变型模板的下游ARMS引物如SEQ ID NO: 20所示；和/或，所述共用上游引物如SEQID NO:21所示；和/或，所述探针如SEQ ID NO:22所示。
8.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于检测钼类药物相关基因XRCCI Argl94Trp突变，其中，所述针对野生型模板的下游ARMS引物如SEQ ID NO:25所示，针对突变型模板的下游ARMS引物如SEQ ID NO: 26所示；和/或，所述共用上游引物如SEQID NO:27所示；和/或，所述探针如SEQ ID NO:28所示。
9.一种基于ARMS荧光定量PCR检测基因突变的方法，所述方法包括:在相同的反应体系中，使用针对野生型模板的增强型arms引物和针对突变型模板的增强型arms引物分别对同一份待测样本进行检测，通过CT值和Λ CT值的大小判定样本基因型，其中，所述针对野生型模板的增强型ARMS引物和所述针对突变型模板的增强型ARMS引物的定义与权利要求I或2中的定义相同。
10.根据权利要求9所述的方法，进一步包括以下步骤: (1)设计并筛选含有待测位点的taqman探针、增强型ARMS引物、配对引物、反应体系，其中，所述taqman探针、增强型ARMS引物、配对引物如上所述； (2)从样本中提取人基因组DNA作为模板DNA； (3)进行实时荧光定量PCR扩增:每个多态性位点的检测分2管进行，每管中加入相同的ROX校正液、Mg2+、dNTP、聚合酶、缓冲液、taqman探针、配对引物和模板DNA，每管中分别加入野生型ARMS引物和 突变型ARMS引物的一种，进行多态性检测的增强型ARMS-qPCR检测； (4)结果判定 依据Cut-off Δ Ct值判定结果。
【文档编号】G01N21/64GK104031978SQ201310071668
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年3月6日 优先权日:2013年3月6日
【发明者】刘琦, 谢飞飞, 徐磊, 张森林, 其他发明人请求不公开姓名 申请人:北京宏微特斯生物科技有限公司