一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法
【专利摘要】一种SYBR?Green?I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，包括以下步骤：(1)引物合成，(2)标准阳性样品制备，(3)待测样品制备，(4)SYBR?Green?I荧光定量PCR，(5)绘制标准曲线和溶解曲线，(6)结果判定。本发明的有益之处在于：采用SYBR?Green?I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法整个过程仅需要3小时就能得出准确结果，而且一次可以进行96个样品的检测，较其他方法具有操作简单、检测速度快、灵敏度高、特异性强、通量高等优点，能够为疾病的治疗和疫情的控制提供保障。
【专利说明】-种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种兔须癣毛癣菌感染的检测方法，具体涉及一种SYBR Green I荧光 定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 须癣毛癣菌是家兔等多种动物皮肤真菌病的最常见病原之一，主要侵害皮肤及其 附属物，表现皮屑增多、结痂、脱毛、渗出、毛囊炎及痒感等症状，导致兔营养不良、生长迟缓 等，给养兔业带来巨大经济损失。更严重的是，该病还能传染给人，引起人畜共患传染病。所 以需要找到一种快速，准确的检测方法，以便及时治疗和控制疫情。
[0003]目前，常见的检测方法包括：病料直接显微观察法、病原分离培养法。病料直接显 微观察法虽然简单、快速，但却无法鉴别真菌的种类，而且有5-15%的假阴性率；病原分离 培养虽然通过菌落、菌丝、孢子的形态，结合生化试验，可以明确真菌种类，但耗时长，一般 为3-4周，而且有40 %的假阴性率。
[0004] 随着技术的发展，分子生物学方法检测真菌感染得到了一定的应用，包括染色体 DNA G+C的含量、总DNA同源性、线粒体DNA限制酶断片长度多态分析、随机引物PCR、随机扩 增DNA多态性分析、PCR指纹等。其中，采用核糖体DNA区及rRNA小亚基序列分析，特别是 ITS(analysis of internal transcribed spacer)区分析比对编码rRNA小亚基（18SrRNA) 基因更适应对皮肤真菌的检测，目前，把核糖体DNA区的ITS区序列分析称为皮肤癣菌鉴定 的金标准。此方法主要是利用常规PCR的方法对目的基因进行扩增，然后利用电泳观察，基 因序列测定，序列分析等方法，最终通过同源性差异，对皮肤真菌病原做出诊断。但是此方 法存在一定的缺陷，主要表现在常规PCR的灵敏度不是特别高、需要PCR后处理、电泳鉴定 需要使用有毒性EB染料等方面。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测时间短、结果直观、敏感 度高、定量准确的SYBR Green I荧光定量PCR方法用于兔须癣毛癣菌的检测。
[0006] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
[0007] -种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，其特征在于，包括以 下步骤：
[0008] (1)引物合成：
[0009] 上游引物 F : 5' -GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG-3'，
[0010] 下游引物 R : 5' -GGAGACCATCTGTGAGAGTTG-3 ;
[0011] (2)标准阳性样品制备：提取标准阳性重组菌的质粒DNA，稀释为不同拷贝数梯 度；
[0012] (3)待测样品制备：按Solarbio试剂盒说明书的步骤提取待测样品DNA ;
[0013] (4) SYBR Green I荧光定量PCR :以标准阳性样品和待测样品分别为模板，F和R 为引物进行SYBR Green I荧光定量PCR反应；
[0014] (5)绘制标准曲线和溶解曲线：根据标准阳性样品进行SYBR Green I荧光定量 PCR反应结果，绘制标准曲线和溶解曲线；
[0015] (6)结果判定：当待测样品SYBR Green I荧光定量PCR反应曲线呈"S"型，且Ct 值彡36. 5、Tm值介于86. 48°C?86. 65°C之间，判定待测样品中含有须癣毛癣菌；若反应曲 线为一条直线，则判断样品中不含须癣毛癣菌。
[0016] 前述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，在步骤（2)中， 标准阳性重组菌的质粒DNA的0D260/0D280介于1. 8?2. 0之间。
[0017] 前述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，在步骤（2)中， 拷贝数梯度为1.0 Χ?ο9?1.0X10拷贝/yL的9个梯度。
[0018] 前述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，在步骤（4)中， SYBR Green I 荧光定量 PCR 反应体系为：2X 的 SYBR Premix Ex Taql2. 5 μ L，10pmol/L 的 上游引物F、下游引物R各1. 0 μ L，DNA模板2. 0 μ L，用灭菌超纯水补足至25. 0 μ L。
[0019] 前述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，在步骤（4) 中，SYBR Green I荧光定量PCR反应程序为：94°C预变性60s ;94°C变性30s，54°C退火30s， 72°C延伸50s，进行40个循环。
[0020] 本发明的有益之处在于：采用SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方 法整个过程仅需要3小时就能得出准确结果，而且一次可以进行96个样品的检测，较其他 方法具有操作简单、检测速度快、灵敏度高、特异性强、通量高等优点，能够为疾病的治疗和 疫情的控制提供保障。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1是本发明的一个具体实施例中获得的SYBR Green I荧光定量PCR标准曲线；
[0022] 图2是本发明的一个具体实施例中获得的SYBR Green I荧光定量PCR溶解曲线；
[0023] 图3是本发明的一个具体实施例中获得的一组SYBR Green I荧光定量PCR检测 结果。
【具体实施方式】
[0024] 1.引物合成
[0025] 参照GenBank已发表的须癣毛癣菌基因序列，设计一对特异性引物：
[0026] 上游引物 F : 5' -GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG-3'，
[0027] 下游引物 R : 5' -GGAGACCATCTGTGAGAGTTG-3。
[0028] 预期扩增片段大小288bp。
[0029] 2.标准阳性样品制备：
[0030] (1)准菌株DNA提取
[0031] 将须癣毛癣菌标准株接种在土豆葡萄糖液体培养基，28°C摇床培养72h，离心收集 菌丝，冰箱冷冻保存备用。将菌丝解冻，用液氮研磨，然后按Solarbio试剂盒说明书的步骤 提取DNA。
[0032] (2)标准阳性重组菌的构建
[0033] 以提取的标准菌株DNA为模板，F和R为引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：Mix 25 4匕引物各1.(^1^模板0嫩4.(^1^加(1(1!120补足25以匕反应程序为：941：预变性 3min ;94°C变性 30s，54°C退火 30s，72°C延伸 50s，共 35 个循环；72°C再延伸 lOmin，于 4°C 终止反应，保存备用。
[0034] 取5yL PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳，在288bp出观察到条带，然后由上海生 工生物工程技术服务公司序列测定正确。
[0035] 将PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化后，与pMDIS-T载体连接，转化大肠杆菌，得到 重组菌。
[0036] 将重组菌经双酶切和PCR鉴定为阳性，得到标准阳性重组菌。
[0037] (3)提取标准阳性重组的质粒DNA，稀释为不同拷贝数梯度
[0038] 按Solarbio试剂盒说明书的步骤提取标准阳性重组菌的DNA，测定0D260值和 0D280值，0D260/0D280值介于1. 8?2. 0的准阳性重组的质粒DNA可用于后续实验。
[0039] 根据0D260值计算质粒浓度，并换算成拷贝数，然后以10倍梯度稀释成 1.0X10 9?1.0X10拷贝/yL的9个梯度。拷贝数=(浓度X阿伏加德罗常数V(-个 碱基对的平均分子量X总长度）。以稀释的不同拷贝数的标准阳性样品为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR。
[0040] 3.待测样品制备
[0041] 将临床分离的待测菌株接种在土豆葡萄糖液体培养基，28°C摇床培养72h，离心收 集菌丝，冰箱冷冻保存备用。将菌丝解冻，用液氮研磨，然后按Solarbio试剂盒说明书的步 骤提取DNA，作为待测样品组模板进行SYBR Green I荧光定量PCR。
[0042] 4. SYBR Green I 荧光定量 PCR
[0043] 以标准阳性样品待测样品分别为模板，F和R为引物，进行SYBR Green I荧光定 量 PCR 反应。SYBR Green I 荧光定量 PCR 反应体系为：2X 的 SYBR Premix Ex Taql2. 5 μ L， 10pm〇l/L的上游引物F、下游引物R各1. 0 μ L，DNA模板2. 0 μ L，用灭菌超纯水补足至 25. 0 μ L ;反应程序为：94°C预变性60s ;94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸50s，进行40 个循环。
[0044] 5.绘制标准曲线和溶解曲线：
[0045] 根据标准阳性样品进行SYBR Green I荧光定量PCR反应结果，采用软件自动分析 绘制标准曲线（见图1)和溶解曲线（见图2)。
[0046] 6.结果判定：
[0047] 待测样品SYBR Green I荧光定量PCR反应曲线呈"S"型（见图3)，而且结合标准 曲线和溶解曲线得出：Ct值彡36. 5,且Tm值介于为86. 48°C?86. 65°C之间，所以判定待测 样品中含有须癖毛癖囷。
[0048] 7. SYBR Green I荧光定量PCR的敏感性和特异性验证实验
[0049] (1)敏感性试验
[0050] 分别取稀释的1. OX 109?1. 0X 10拷贝/ μ L的9个梯度标准阳性样品1 μ L为 模板进行SYBR Green I荧光定量PCR和普通PCR，测定SYBR Green I荧光定量PCR的敏感 性，并与普通PCR进行对比。结果发现该方法能检出10拷贝/ μ L的标准阳性样品，而常规 PCR只能检出103拷贝/ μ L的标准阳性样品，即SYBR Green I荧光定量PCR的敏感性是常 规PCR的100倍。
[0051] ⑵特异性实验
[0052] 用兔须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌、红毛癣菌、白色念珠菌分离菌株和 兔须癣毛癣菌的临床样品的DNA做为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR。结果显示：兔 须癣毛癣菌的分离株和兔须癣毛癣菌的临床样品的反应曲线呈"S"型，CT值为18?25之 间；而犬小孢子菌、絮状表皮癣菌、红毛癣菌、白色念珠菌的分离菌株的反应曲线为一条直 线，为阴性结果（见图3)。重复实验Ct值变异系数小于5%，表明SYBR Green I荧光定量 PCR的特异性强。
【权利要求】
1. 一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，其特征在于，包括以下 步骤： (1) 引物合成： 上游引物 F :5' -GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG-3'， 下游引物 R :5' -GGAGACCATCTGTGAGAGTTG-3 ; (2) 标准阳性样品制备：提取标准阳性重组菌的质粒DNA，稀释为不同拷贝数梯度； (3) 待测样品制备：按Solarbio试剂盒说明书的步骤提取待测样品DNA ; (4) SYBR Green I荧光定量PCR :以标准阳性样品和待测样品分别为模板，F和R为引 物进行SYBR Green I荧光定量PCR反应； (5) 绘制标准曲线和溶解曲线：根据标准阳性样品进行SYBR Green I荧光定量PCR反 应结果，绘制标准曲线和溶解曲线； (6) 结果判定：当待测样品SYBR Green I荧光定量PCR反应曲线呈"S"型，且Ct值 彡36. 5、Tm值介于86. 48°C?86. 65°C之间，判定待测样品中含有须癣毛癣菌；若反应曲线 为一条直线，则判断样品中不含须癣毛癣菌。
2. 根据权利要求1所述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法， 其特征在于，在步骤（2)中，标准阳性重组菌的质粒DNA的0D260/0D280介于1. 8?2. 0之 间。
3. 根据权利要求1或2所述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的 方法，其特征在于，在步骤（2)中，拷贝数梯度为1.0 X109?1.0X10拷贝/ yL的9个梯 度。
4. 根据权利要求3所述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法， 其特征在于，在步骤（4)中，SYBR Green I荧光定量PCR反应体系为：2X的SYBR Premix Ex Taql2. 5 μ L，10pmol/L的上游引物F、下游引物R各1. 0 μ L，DNA模板2. 0 μ L，用灭菌超纯 水补足至25. 0 μ L。
5. 根据权利要求4所述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法， 其特征在于，在步骤（4)中，SYBR Green I荧光定量PCR反应程序为：94°C预变性60s ;94°C 变性30s，54°C退火30s，72°C延伸50s，进行40个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK104195263SQ201410493854
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】刘彦威, 刘娜, 刘利强, 杜鹃, 刘建钗, 张永英, 朱美霞, 刘贵巧 申请人:河北工程大学